(Luận văn thạc sĩ) đánh giá hiện trạng và đề xuất giải pháp quản lý môi trường một số mỏ than vùng đông bắc ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lƣu Thị Thanh Huế NGHIÊN CỨU BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus plantarum PHÂN LẬP TỪ MẪU CHAO TẠI HUẾ LUẬN VĂN THẠC SĨ Hà Nội – Năm 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lƣu Thị Thanh Huế NGHIÊN CỨU BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus plantarum PHÂN LẬP TỪ MẪU CHAO TẠI HUẾ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Quỳnh Uyển TS Mai Thị Đàm Linh Hà Nội – Năm 2017 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quỳnh Uyển, cán bộViện Vi sinh học Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, giúp giải vấn đề nảy sinh q trình làm luận văn hồn thành luận văn theo định hướng ban đầu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới : TS Mai Thị Đàm Linh, PGS TS Bùi Thị Việt Hà, cán Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện bước đầu cho tơi hồn thành luận văn CN Hoàng Thu Hà, CN Lê Hồng Anh toàn thể cán bộ, sinh viên Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Đề tài “Đánh giá nguồn gen vi khuẩn lactic địa định hướng ứng dụng thực phẩm, dược phẩm thức ăn chăn nuôi” - Bộ khoa học Cơng nghệ hỗ trợ hóa chất, dụng cụ thí nghiệm suốt q trình thực luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè anh chị đồng học bên giúp đỡ, động viên, khích lệ tơi vượt qua khó khăn học tập suốt năm vừa qua Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Lƣu Thị Thanh Huế MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn lactic (LAB) 1.1.1 Đặc điểm hình thái .3 1.1.2 Quá trình lên men lactic .5 1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển vi khuẩn lactic 1.2 Ứng dụng vi khuẩn lactic 1.2.1 Ứng dụng vi khuẩn lactic nói chung 1.2.2 Ứng dụng vi khuẩn L plantarum 1.3.Bacteriocin 10 1.3.1 Định nghĩa .10 1.3.2 Phân loại 10 1.3.3 Cơ chế hoạt động bacteriocin 11 1.3.4 Đặc điểm bacteriocin nhóm vi khuẩn 12 1.3.5 Các đặc tính bacteriocin 13 1.3.6 Bacteriocin từ vi khuẩn lactic 14 1.3.7 Phương pháp tinh bacteriocin 17 1.4 Tình hình nghiên cứu bacteriocin từ vi khuẩn lactic 19 1.4.1 Các nghiên cứu giới 19 1.4.2 Các nghiên cứu nước 21 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Nguyên liệu 24 2.1.1 Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum 24 2.1.2 Chủng vi khuẩn kiểm định .24 2.1.3 Mơi trường, hóa chất thiết bị 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .26 2.2.1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho khả sinh tổng hợp bacteriocin 27 2.2.2 Một số tính chất bacteriocin 28 2.2.3 Tinh bacteriocin hệ thống AKTA 29 2.2.4 Điện di SDS PAGEvà kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn 30 2.2.5 Khảo sát khả chịu muối mật pH thấp 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng vi khuẩn L plantarum UL485 33 3.1.1 Tối ưu hóa thời gian ni cấy 33 3.1.2 Tối ưu hóa nhiệt độni cấy 34 3.2 Một số tính chất bacteriocin từ chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL485 36 3.2.1 Hoạt độ bacteriocin (AU/ml) 36 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin 37 3.2.3 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính bacteriocin 38 3.2.4 Ảnh hưởng enzym trypsin đến hoạt tính bacteriocin 40 3.3 Sơ tinh bacteriocin sinh tổng hợp từ chủng Lactobacillus plantarum UL485 41 3.3.1 Chương trình tinh hệ thống AKTA 42 3.3.2 Kết trình tinh bacteriocintrên hệ thống AKTA 45 3.3.3 Kết điện di SDS PAGE kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn .46 3.4.Khảo sát khả chịu pH, muối mật chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL485 47 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT LAB : Lactic Acid Bacteria CFU : Colony Formong Unit AU : Activity Unit kDa : Kilo Dalton SDS : Sodium dodecyl sulfate SDS PAGE : Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Độ bền nhiệt, pH enzym thủy phân số bacteriocin sinh tổng hợp vi khuẩn lactic 13 Bảng 1.2: Các bacteriocin phổ biến tổng hợp vi khuẩn lactic 14 Bảng 1.3: Một số bacteriocin sản xuất L plantarum phân lập từ mẫu thực phẩm khác .15 Bảng 1.4: Tinh số bacteriocin sinh tổng hợp vi khuẩn Lactobacillus plantarum 18 Bảng 2.1: Các chủng vi khuẩn kiểm định 24 Bảng 2.2: Thành phần gel sử dụng điện di Trixin - SDS PAGE 30 Bảng 2.3: Thành phần gel sử dụng điện di Glyxin - SDS PAGE .31 Bảng 3.1: Ảnh hưởng thời gian ni cấy đến hoạt tính bacteriocin chủng vi khuẩn L plantarum UL485 .34 Bảng 3.2: Ảnh hưởng nhiệt độ ni cấy đến hoạt tính bacteriocin chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL485 35 Bảng 3.3: Hoạt độ AU L plantarum UL485 với chủng vi khuẩn kiểm định 36 Bảng 3.4: Tổng kết trình tinh bacteriocin chủng L plantarum UL485 cột sắc ký trao đổi cation 45 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cơ chế hoạt động bacteriocin 12 Hình 2.1: Sơ đồ quy trình thí nghiệm 27 Hình 2.2: Cách pha lỗng mẫu theo hệ số 28 Hình 3.1: Hoạt tính bacteriocin chủng vi khuẩn L plantarum UL485 với KĐ28 thời điểm nuôi cấy khác 33 Hình 3.2: Hoạt tính bacteriocin chủng vi khuẩn L plantarumUL485 với KĐ28 nhiệt độ nuôi cấy khác 35 Hình 3.3: Hoạt tính bacteriocin từ chủng L plantarum UL485 60oC, 100oC, 121oC 37 Hình 3.4: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin chủng Lactobacillus plantarum UL485 38 Hình 3.5: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính bacteriocin chủng Lactobacillus plantarumUL485 .39 Hình 3.6: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính bacteriocin L plantarum UL485 39 Hình 3.7: Ảnh hưởng enzym trypsin đến hoạt tính bacteriocin chủng Lactobacillus plantarumUL485 .40 Hình 3.8: Sắc ký đồ dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarumUL485 qua cột Hitrap SP FF ml 42 Hình 3.9: Kết kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn sắc ký với KĐ28 43 Hình 3.10: Sắc ký đồ dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarumUL485 qua cột Hitrap SP FF ml 44 Hình 3.11: Kết kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn rửa giải với KĐ28 44 Hình 3.12: Điện di Glyxin – SDS PAGE 18% .47 Hình 3.13: Khả chịu pH thấp, muối mật chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL485 48 MỞ ĐẦU Hiện nay, loại chất phụ gia ngày sử dụng phổ biến trình sản xuất, chế biến bảo quản thực phẩm nhằm cải thiện hương vị, trì chất lượng dinh dưỡng độ tươi sản phẩm Tuy nhiên, tượng lạm dụng mức chất làm gia tăng tình trạng ngộ độc thực phẩm mang lại nhiều tác hại cho sức khỏe người tiêu dùng Bởi vậy, việc nghiên cứu chất kháng khuẩn để ứng dụng bảo quản thực phẩm cần phải theo hướng mới, hiệu hơn, an tồn Khác với hóa chất phụ gia kháng sinh, bacteriocin chất kháng khuẩn có chất peptit protein tổng hợp theo đường riboxom vi khuẩn, có hoạt tính kìm hãm, ức chế phát triển số vi khuẩn Bacteriocin cơng nhận an tồn, khơng gây dị ứng không gây hại cho sức khỏe người bị phân hủy proteinaza, lipaza đường ruột Điển hình nisin, chất bảo quản bổ sung loại rau, sữa, mát, thịt…do có khả ức chế vi sinh vật làm hỏng thực phẩm Từ đó, thấy rằng, việc ứng dụng bacteriocin có nguồn gốc từ vi khuẩn bacteriocin có nguồn gốc tự nhiên mang lại lợi ích vơ to lớn cho sống người Những năm gần đây, vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) ứng dụng nhiều ngành sản xuất, đặc biệt ngành công nghiệp thực phẩm số ngành chế biến khác chúng có khả sinh axit, tạo hương ức chế phát triển số vi khuẩn nhờ khả sinh tổng hợp bacteriocin Trong đó, nhóm vi khuẩn Lactobacillus plantarum đánh giá ứng cử viên tiềm việc sinh tổng hợp bacteriocin có khả tiêu diệt tác nhân gây bệnh Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum Staphylococcus aureus Đã có nhiều công bố nghiên cứu sâu bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum, bao gồm tinh xácđịnhcác bacteriocin để ứng dụng công nghệ thực phẩm nhằm mục đích kéo dài thời gian bảo quản, chống lại phát triển tác nhân gây bệnh, điều trị số bệnh trì sức khỏe cho người Tuy nhiên để sử dụng bacteriocin, cần thiết phải chọn lựa chủng vi khuẩn có khả tổng hợp bacteriocin có phổ hoạt tính rộng có hoạt độ cao để nghiên cứu sâu bacteriocin nhằm tạo tiền đề cho việc thu nhận, ứng dụng thực tế Xuất phát từ thực tiễn với xu hướng trọng việc ứng dụng bacteriocin đời sống, thực đề tài: “Nghiên cứu bacteriocin vi khuẩn Lactobacillus plantarum phân lập từ mẫu chao Huế” nhằm góp phần khai thác tiềm ứng dụng bacteriocin sinh tổng hợp từ vi khuẩn LAB phân lập từ mẫu thực phẩm Việt Nam 1.3.6.2 Bacteriocin từ vi khuẩn L plantarum Rất nhiều bacteriocin sinh tổng hợp từ L plantarum phát nghiên cứu Bảng 1.3 thể đặc điểm số bacteriocin sản sinh vi khuẩn L plantarum phân lập từ sản phẩm lên men khác [36] Bảng 1.3: Một số bacteriocin sản xuất L plantarum đƣợc phân lập từ mẫu thực phẩm khác [36] Mẫu phân lập Chủng vi khuẩn L.plantarum UG1 L.plantarum LT154 Thịt Bacteriocin Đặc điểm cấu trúc Vi sinh vật bị ức chế Plantaricin UG1 Chuỗi peptit đơn, khối L monocytogenes, B cereus, lượng phân tử từ – 10 C perfringens, kDa C sporogenes Plantacin 154 Chuỗi peptit đơn, khối S aureus, L.monocytogenes, lượng phân tử nhỏ A hydrophila kDa L plantarum, L.plantarum SA6 L.plantarum ST202Ch ST216Ch L.plantarum PMU 33 Chuỗi peptit đơn, khối Lactobacillus brevis, Plantaricin SA6 lượng phân tử khoảng Leuconostoc spp., 3,4 kDa Listeria grayi BacSt202Ch, bacST216 ST28MS, ST16MS Cá L.plantarum BF001 Plantaricin F Chuỗi peptit đơn với khối lượng phân tử tương ứng 3,5 kDa 10 kDa Enterococcus faecium, E coli, L.monocytogenes Pseudomonas spp., S aureus Chuỗi peptit đôi (  L monocytogenes, B cereus, peptit), khối lượng phân S aureus, E faecium, E tử tương ứng 3,2 kDa faecali kDa Chuỗi peptit đơn, khối S aureus, S typhimurium, L lượng phân tử tương monocytogenes, P ứng 0,4 kDa 4,6 aeruginosa kDa 15 L.plantarum ST28MS ST16MS L.plantarum C11 Rau ST28MS ST16MS Plantaricin EF Plantaricin JK Plantaricin A L.plantarum Plantaricin S LPC010 Plantaricin T Chuỗi peptit đơn, khối L sakei, S aureus lượng phân tử tương E faecalis, P aeruginosa, E ứng 5,5 kDa 2,8 coli, A baumanii kDa Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử chưa xác định Chuỗi peptit đôi với khối lượng phân tử 2,5 kDa (đối với plantaricin S) chưa xác định khối lượng (đối với plantaricin T) Lactobacillus sp., Pediococcus sp., Leuconostoc sp., Streptococcus sp Propionibacterium sp., Clostridium tyrobutyricum, E faecalis E faecalis, E faecium, L.plantarum ST16Pa L.plantarum 163 L.plantarum AMA-K L.plantarum Các WHE92 sản phẩm L.plantarum từ sữa LB-B1 L.plantarum ST8KF ST16Pa Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử 6,5 kDa Plantaricin 163 Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử 3,5 kDa AMA-K Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử 2,9 kDa AcH Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử 4,6 kDa LB-B1 Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử từ 2,5 – 6,5 kDa BacST8KF Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử khoảng 3,5 kDa 16 L monocytogenes, Listeria innocua, S aureus, Streptococcus spp.,Pseudomonas spp S aureus, L monocytogenes, B pumilus, B cereus, M luteus, L thermophilus, L rhamnosus, E coli, P aeruginosa , P fluorescens Enterococcus spp., E coli, Klebsiella pneumonia, Listeria spp L monocytogenes Listeria, Lactobacillus spp., Streptococcus spp Enterococcus spp., Pediococcus spp , E coli L casei, Lactobacillus salivarus, Lactobacillus curvatus, L innocua L.plantarum ST13BR ST13BR Ngũ cốc L.plantarum ST194BZ (α) ST194BZ ST194BZ (β) L.plantarum 423 Plantaricin 423 Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử khoảng 10 kDa P aeruginosa, E faecalis, K pneumonia, E coli Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử tương ứng 3,3kDa 14 kDa E faecalis, E coli, Enterobacter cloacae, P aeruginosa Chuỗi peptit đơn, khối lượng phân tử 3,5 kDa B cereus, C sporogenes, E faecalis, Listeria spp., Staphylococcus spp Như vậy, bacteriocin từ vi khuẩn L plantarum có cấu trúc chuỗi peptit đơn đôi với khối lượng phân tử nằm khoảng 0,4 – 14 kDa có khả ức chế nhiều vi sinh vật gây hại S aureus, E faecalis, P aeruginosa, L.monocytogenes,… 1.3.7 Phương pháp tinh bacteriocin Quá trình tinh bước cần thiết để nghiên cứu sâu cấu trúc phân tử, trình tự amino axit, chế hoạt động, đặc tính bacteriocin xác định thông tin trọng lượng phân tử Một số phương pháp tinh bacteriocin sinh tổng hợp từ vi khuẩn lacticlà chiết dung môi, siêu lọc, hấp phụ - giải hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, kết tủa muối, sắc ký lỏng hiệu cao HPLC,…Trong đó, HPLC kỹ thuật áp dụng phổ biến mức độ tinh cao xác Kết tinh số bacteriocin sinh tổng hợp vi khuẩnLactobacillus plantarum trình bày Bảng 1.4 17 Bảng 1.4: Tinh số bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp vi khuẩn Lactobacillus plantarum[36] Bacteriocin Plantaricin ZJ008 Plantaricin từ L plantarum LP31 Các bƣớc tinh Cột hạt nhựa Macroporous 37,5 2,5 Trao đổi cation 369,9 24,8 Lọc gel 8556,7 573,1 Dịch nuôi cấy thô 85,5 Sắc ký lọc gel 5900 689,5 506.000 5914,6 455 409.600 900,2 Dịch nuôi cấy thô 0,37 Kết tủa muối amonium sunphat 5,35 14,9 Lọc gel 44,64 20,0 9333,33 25,2 Dịch nuôi cấy thô 2083 Kết tủa muối amonium 9904 4,7 Lọc gel 146.104 70,1 HPLC 197.368 94,7 Dịch nuôi cấy thô 253 Kết tủa muối amonium sunphat 1850 7,3 Trao đổi cation 11.900 47,0 HPLC 10.700 42,3 Dịch nuôi cấy thô RP – HPLC BacTN635 Plantaricin ASM1 Độ 14,9 RP – HPLC Plantaricin MG (AU/mg) Dịch nuôi cấy thô RP – HPLC Plantaricin C19 Hoạt độ riêng sunphat 18 1.4 Tình hình nghiên cứu bacteriocin từ vi khuẩn lactic Bacteriocin mang lại nhiều lợi ích ứng dụng sống người nhờ tính chất đặc trưng chúng Tuy vậy, cịn nhiều vấn đề liên quan đến bacteriocin cần làm sáng tỏ Điều thúc nhà khoa học bắt tay vào nghiên cứu có nhiều cơng trình ứng dụng thành cơng vào thực tế, góp phần nâng cao chất lượng sống 1.4.1 Các nghiên cứu giới Bacteriocin từ vi khuẩn lactic nói chung Budu-Amoako E cộng thuộc trung tâm Công nghệ thực phẩm PEI, Canada nghiên cứu hiệu tiêu diệt Listeria monocytogenes thùng chứa bảo quản tôm hùm kết hợp nisin nhiệt độ.Năm 2006, Marcinowski, giám đốc điều hành nghiên cứu BASF cho biết, cơng ty hố chất BASF Đức phát triển kẹo cao su có chứa chủng vi khuẩn Lactobacillus có lợi Đây sản phẩm giúp người dùng loại trừ bệnh miệng Chủng Lactobacillus (có tên Lanti-caries) có khả sinh bacteriocin làm cho vi khuẩn gây sâu kết thành khối khơng thể dính bề mặt bị loại bỏ dễ dàng súc miệng.Nhóm tác giả Todorov Dicks K M thuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch, Nam Phi nghiên cứu khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng Lactobacillus pentosus ST712BZ phân lập từ boza (một loại đồ uống lên men từ lúa mì Thổ Nhỹ Kỳ) Bacteriocin ST712BZ (kích thước 14 kDa) ức chế phát triển Lactobacillus casei, E.coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococus faecalis, Klebsiellapneumoniae Lactobacillus curvatus[48] Một nghiên cứu khác Satish Kumar R, Arul V thuộc khoa Công nghệ sinh học trường đại học Pondicherry, Ấn Độ tách chiết loại bacteriocin, phocaecin PI80, sinh tổng hợp từ chủng Streptococus phocae PI80 phân lập từ tôm thẻ chân trắng Ấn Độ Chất kháng khuẩn nhạy cảm với trypsin, proteinaza, pepsin, chymotrypsin ức chế số tác nhân gây bệnh quan trọng như: Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, V.fischeri [26] Năm 2011, Ozdemir cộng thuộc khoa Công nghệ sinh học, trường đại học Adnan Menderes, Thổ Nhĩ Kỳ xây dựng sưu tập gồm 57 chủngEnterococcalphân lậptừ nguồnkhác nhau(bao gồmnướcsông, nước thải, đất, động vật, loại rau), sử dụng để sản 19 xuấtbacteriocin [32] Đến năm 2012, Samar L cộng thuộc phịng thí nghiệm ERT62, trường đại họcBiopharmaAmbrilia S.A, Pháp tìm loại bacteriocin (lacticin LC14) sản sinh Lactococcus lactis BMG6.14 phân lập từ môi trường nước thịt Lacticin LC14 cho thấy khả diệt khuẩn sinh tổng hợp nhiều hợp chất kháng khuẩn tiêu diệt số vi khuẩn lactic chủng gây bệnh bao gồm vi khuẩn Listeria monocytogenes [37] Bacteriocin từ vi khuẩn L plantarum Năm 1990, Daeschel cộng nghiên cứu bacteriocin từ vi khuẩn L plantarum C11 phân lập từ rau Hai loại bacteriocin sản sinh từ vi khuẩn plantaricin E plantaricin JK có khả chống lại tác nhân gây bệnh Lactobacillus sp., Pediococcus sp., Leuconostoc sp Streptococcus sp [14] Vào năm 1992, Yang R., Joshnon M.C Ray B nghiên cứu phương pháp để chiết tách lượng lớn bacteriocin từ vi khuẩn lactic Phương pháp sử dụng mơi trường có bổ sung pediocin AcH, nisin, sakacin A, leuconocin Lcm1 giúp tăng hiệu chiết tách thu lượng bacteriocin nhiều hơn.Năm 1993, nhà khoa học Díaz cộng phát loại bacteriocin plantaricin S plantaricin T Hai bacteriocin sinh tổng hợp từ chủng vi khuẩn L plantarum LPC010 có khả ức chế Propionibacterium sp., Clostridium tyrobutyricum vàEnterococcus faecalis Bacteriocin plantaricin F sinh tổng hợp vi khuẩn L plantarum BF001 nghiên cứu Fricourt cộng vào năm 1995 có khối lượng phân tử nằm khoảng 0,4 – 6,7 kDa [16] Plantaricin SA6 sinh tổng hợp vi khuẩn L plantarum SA6 Rekhif cộng nghiên cứu, tìm hiểu khối lượng phân tử khả đối kháng với vi sinh vật khác Những nghiên cứu xoay quanh vi khuẩn L plantarum UG1 phân lập từ thịt bacteriocin nó, plantaricin UG1, tiến hành Enan cộng vào năm 1996 [35] Nhà khoa học Reenen đồng nghiệp có thơng tin bước đầu khối lượng phân tử bacteriocin plantaricin 423 (khoảng 3,5 kDa)[34].Nhóm tác giả Todorov S., Reenen C V., Dicks L.thuộc khoa vi sinh, đại học Stellenbosch, Nam Phi nghiên cứu khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng L plantarum ST13BR phân lập từ bia Barley Bacteriocin L plantarum ST13BR có kích thước phân tử 10 kDa ức chế phát triển vi 20 khuẩnLactobacillus casein, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae E coli [46] Và gần vào năm 2016, Hu cộng tách chiết bacteriocin 163-1 có khối lượng phân tử 825 Da sinh tổng hợp chủng vi khuẩn L plantarum 163 phân lập từ củ cải muối Các axit amin xác định YVCASPW dựa khối phổ Bacteriocin 163-1 bền nhiệt hoạt động ổn định phạm vi pH rộng (pH - 6), nhạy với proteaza K, pepsin, đồng thời có khả chống lại tác nhân gây bệnh bao gồm vi khuẩn Gram dương Gram âm Với phổ hoạt tính kháng khuẩn rộng, loại bacteriocin hữu dụng bảo quản rau quả, thực phẩm kiểm sốt yếu tố sinh học nơng nghiệp [24] 1.4.2 Các nghiên cứu nước Cũng nhiều nước giới, nhà khoa học Việt Nam quan tâm đến bacteriocin cókhơng cơng trình khoa học nghiên cứu vấn đề Tuy nhiên, cơng trình nghiên cứu tập trung vào xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng LAB sinh tổng hợp bacteriocin, định danh chủng xác định số tính chất hóa sinh bacteriocin độ nhạy chúng với enzym Năm 2002, Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội nghiên cứu khả sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn lactic L24 phân lập từ nước dưa Các phân tích trình tự rADN 16S cho thấy chủng L24 thuộc loài L plantarum [1] Năm 2004, TS Lê Thị Hồng Tuyết, TS Hoàng Quốc Khánh Viện Sinh học Nhiệt Ðới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam có nghiên cứusơ số đặc tính bacteriocin sản xuất vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Vi khuẩn L acidophilus sản xuất bacteriocin có khả kháng số vi khuẩn gây bệnh thực phẩm E coli, Salmonella số vi khuẩn lactic khác Quá trình sinh tổng hợp bacteriocin 12 Điều kiện tối ưu để tạo bacteriocin vi khuẩn là 30 - 37oC với pH từ - Chủng vi khuẩn có khả sử dụng tốt loại đường manitol, maltozơ, lactozơ glucozơ để sản xuất bacteriocin Hoạt tính bacteriocin tăng bổ sung 1% cao nấm men, thành phần khác glucozơ, cao thịt, cazein pepton, NaCl không ảnh hưởng đến hoạt tính bacteriocin 21 Bên cạnh đó, bacteriocin sản xuất vi khuẩn L acidophilus nhạy với proteaza lại ổn định với dung môi hữu cơ, pH nhiệt độ [6].Một nghiên cứu khác TS.PhạmThùy Linhvềkhả tạo chất diệt khuẩn enterocin P tái tổ hợp nhằm ứng dụng bảo quản thực phẩm Đây nghiên cứu tạo bacteriocin tái tổ hợp cách có hệ thống Việt Nam Sản phẩm nghiên cứu nàylà protein HisentP tái tổhợp có hoạt tính kháng khuẩn đặc tính sinh hóa tương tự với enterocin P tự nhiên Protein bước đầu có khả kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm tiếp tục nghiên cứu phát triển làm phụ gia sinh học dùng cho bảo quản [3] Với mục tiêu thu nhận bacteriocin để ứng dụng trình bảo quản thịt sơ chế tối thiểu, tác giả Nguyễn Thúy Hương nghiên cứu việc cố định tế bào vi khuẩn Lactococcus lactic chất mang cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose - BC) [2].Năm 2014, tác giả Lê Ngọc Thùy Trang Phạm Minh Nhựt tiến hành phân lập sản phẩm lên men truyền thống sữa chua, nem chua, cải chua, kim chi, măng chua Theo đó, sau sàng lọc, chủng SC01 chọn có khả đối kháng mạnh, đồng thời tạo hợp chất kháng khuẩn có tính ức chế mạnh vi khuẩn thị Salmonella, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes Bacillus subtilis Định danh phương pháp giải trình tự 16S rDNA cho thấy chủng SC01 Lactobacillus plantarum.Khả sản sinh hợp chất kháng khuẩn L plantarum SC01 môi trường khác cho thấy mơi trường MRS có cải tiến tốt Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl thành phần môi trường MRS xác định môi trường MRS OPTSC01 thích hợp mơi trường bao gồm cao thịt bò (10 g/l), cao nấm men (5 g/l), trypton (10 g/l), sucrose (20 g/l), sodium acetate (5 g/l), K2HPO4 (4 g/l), ammonium citrate (2 g/l), MgSO4 (0,2 g/l), MnSO4 (0,05 g/l), Tween 80 (1 ml/l), pH 6,0,nhiệt độ nuôi cấy37oC Năm 2015, tác giả Bằng Hồng Lam, Nguyễn Hữu Hiệp tiến hành phân lập 148 dòng vi khuẩn lactic từ 56 mẫu thực phẩm lên men truyền thống (rau muối chua sản phẩm lên men từ thịt cá thu) từ tỉnh Đồng sơng Cửu Long Tất dịng vi khuẩn có khả sinhtrưởng phát triển 40oC 45oC, có 48 dịng vi khuẩn phát triển 50oC khơng có dịng vi khuẩn sống 55oC Trong số 48 dòng vi khuẩn lactic chịu 50oC, hai dòng 22 vi khuẩn RM18 CC4 có khả sinh bacteriocin ức chế tăng trưởng củavi khuẩn thị Lactobacillus sakei subsp sakei JCM 1157 sử dụngphương pháp khuếch tán giếng thạch Kết định danhbằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA cho thấy dịng RM18 đồnghình 100% với dòng Lactobacillus plantarum WCFS1 dòng CC4 đồng hình100% với dịng Pediococcus acidilactici B3 Mặc dù có nhiều nghiên cứu vi khuẩn lactic, nghiên cứu bacteriocin, cụ thể nghiên cứu cụ thể bacteriocin sinh tổng hợp L plantarum chưa tiến hành Việt Nam Chính vậy, chúng tơi thực đề tài:“Nghiên cứu bacteriocin vi khuẩn Lactobacillus plantarum phân lập từ mẫu chao Huế” nhằm góp phần khai thác tiềm ứng dụng bacteriocin sinh tổng hợp từ vi khuẩn LAB, phân lập từ mẫu thực phẩm Việt Nam 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thị Hoài Hà,Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy (2002), “Nghiên cứu khả sinh tổng hợp bacterioxin lồi Lactobacillus plantarum L24”, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, Chuyên san Công nghệ sinh học, Hà Nội , tr 47 - 52 Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An (2008), “Thu nhận bacteriocin phương pháp lên men tế bào Lactococcus lactic cố định chất mang Cellulose vi khuẩn (BC) ứng dụng bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu”, Science & Technology Development, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 11 (9), tr 100 – 109 Phạm Thùy Linh (2011), Nghiên cứu khả tạo chấ t diê ̣t khuẩn enterocin P tái tổ hợp nhằ m ứng dụ ng bảo quản thực phẩm ,Luận án Tiến sĩ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ Môi trường (2016), Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6261 : 1997 Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Vũ Tường Vy, Trần Thu Hoa (2007),“Khảo sát khả chịu đựng muối mật kháng sinh số vi sinh vật nguyên liệu sản xuất probiotic đường uống”, Tạp chí Dược học, 378 Lê Thị Hồng Tuyết, Hoàng Quốc Khánh (2004),“Một sốđặc tính bacteriocin sản xuất vi khuẩn Lactobacillus acidophilus”, Báo cáo Khoa học, Viện Sinh học Nhiệt Ðới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Tiếng Anh Ali W S., Musleh R M (2015),"Purification and Characterization of PlantaricinVGW8, A Bacteriocin Produced by Lactobacillus PlantarumVGW8",Journal of Biology, Agriculture and Healthcare, (1), pp 147 - 152 Ammor M S., Mayo B (2007), "Selection criteria for lactic acid bacteria to be used as functional starter cultures in dry sausage production: An update", Meat Science, 76 (1), pp 138 - 146 51 Bradford M M (1976),"A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding", Analytical Biochemistry , pp 248 - 254 10 Bromberg R., Moreno I., Zaganini C L., Delboni R R., Oliveira J D (2004), "Isolation of bacteriocin-producing lactic acid bacteria from meat and meat products and its spectrum of inhibitory activity",Brazilian Journal of Microbiology, 35 (1), pp 1678 - 4405 11 Chen H., Hoover D (2003),"Bacteriocins and their Food Applications",Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, (3), pp 82 - 100 12 Crupper S S., Iandolo J J (1996), "Purification and partial characterization of a novel antibacterial agent (Bac1829) produced by Staphylococcus aureus KSI1829", Applied and Environmental Microbiology , 62 (9), pp 3171–3175 13 Cui Y., Zhang C., Wang Y., Shi J., Zhang L., Ding Z (2012),"Class IIa Bacteriocins: Diversity and New Developments",International Journal of Molecular Sciences, 13, pp 16668-16707 14 Daeschel M A., McKenney M C., McDonald L C (1990), "Bacteriocidal activity of Lactobacillus plantarum C-11", Food Fermentation, 7, pp 91 - 98 15 Desriac F., Defer D., Bourgougnon N., Brillet B., Chevalier P L., Fleury Y (2010), "Bacteriocin as Weapons in the Marine Animal-Associated Bacteria Warfare: Inventory and Potential Applications as an Aquaculture Probiotic", Marine Drugs, (4), pp 1153 - 1177 16 Díaz R J., Barba J L., Cathcart D P., Holo H., Nes I F., Sletten K H (1995), "Purification and Partial Amino Acid Sequence of Plantaricin S, a Bacteriocin Produced by Lactobacillus plantarum LPCO10, the Activity of Which Depends on the Complementary Action of Two Peptides",American Society for Microbiology, 61 (12), pp 4459 - 4463 17 Dobson A., Cotter P D., Ross R P., Hill C (2012), "Bacteriocin Production: a Probiotic Trait?",Applied Environmental Microbiology, 78 (1), pp - 18 El-Shafie H A., I.Yahia N., Ali H A., Khalil F A., El-Kady E M (2009), "Hypocholesterolemic Action of Lactobacillus plantarum NRRL-B-4524 and 52 Lactobacillus paracasei in Mice with Hypercholesterolemia Induced by Diet",Australian Journal of Basic and Applied Sciences, (1), pp 218 - 228 19 Fugelsang K C., Edwards C G (2007), Wine Microbiology, Springer, 2, pp 29 - 44 20 Hashium A J., Hamza S J., Aldujaili N H (2010), "Antimicrobial Activity of Bacteriocin Produced by Weissella cibaria NRIC0136", Al-Kufa Journal for Biology, (1) 21 Hayek A S., Ibrahim A S (2013), "Current Limitations and Challenges with Lactic Acid Bacteria: A Review", Food and Nutrition Sciences, 4, pp 73 - 87 22 Héchard Y., Sahl H.-G (2002), "Mode of action of modified and unmodified bacteriocins from Gram-positive bacteria", Biochimie , pp 545 - 557 23 Hoover D G (1992), "Bacteriocins: activities and applications, Encyclopedia of microbiology",Encyclopedia of microbiology, 1, pp 181 - 192 24 Hu M., Dang L., Zhao H., Zhang C., Lu Y., Yu J (2016), "Characterization and Antibacterial Mode of a Novel Bacteriocin with Seven Amino Acids from Lactobacillus plantarum in Guizhou Salted Radish",Journal of Agricultural Science, (10), pp 120 - 130 25 Ibrahim O O., Day D F (2014), "Biotechnology in Nutrition and Food Engineering", Journal of Nutritional Health & Food Engineering, (5) 26 Kumar R S., Arul V (2009), "Purification and characterization of phocaecin PI80: an anti-listerial bacteriocin produced by Streptococcus phocae PI80 Isolated from the gut of Peneaus indicus (Indian white shrimp)", J Microbiol Biotechnol , 19 (11), pp 1393 - 1400 27 Laemmli U K (1970), "Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4", Nature, 227, pp.680 - 685 28 Mahawar B P (2012), "Multilocus sequence typing for differentiation of closely related species of indigenous probiotic Lactobacilli",Master science in Dairy Microbiology, Nation Dairy Research Institute , pp 30 - 31 29 Nespolo C R., Brandelli A (2010), "Production of bacteriocin-like substances by lactic acid bacteria isolated from regional ovine cheese", Brazilian Journal of Microbiology, 41, pp 1009 - 1018 53 30 Noordiana N., Fatimah A B., Mun A S (2013), "Antibacterial agents produced by lactic acid bacteria isolated from Threadfin Salmon and Grass Shrimp", International Food Research Journal, 20(1), pp 117 - 124 31 Oscáriz J C., Pisabarro A G (2001), "Classification and mode of action of membrane-active bacteriocins produced by gram-positive bacteria", International Micribiology, (1), pp.13 - 19 32 Özdemir G B., Oryaşın E., Bıyık H H., Özteber M., Bozdoğan B (2011), "Phenotypic and Genotypic Characterization of Bacteriocins in Enterococcal Isolates of Different Sources", Indian J Microbiol, 51 (2), pp 182 - 187 33 Patrick O M (2012), "Lactic acid bacteria in health and disease", Rwanda Journal of Health Sciences, (1), pp 39 - 50 34 Reenen V., Dicks L M., Chikindas M (1998),"Isolation, purification and partial characterization of plantaricin 423, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum", Journal of Applied Microbiology, 84 (6), pp 1131 - 1137 35 Rekhif N., Atrih A., Lefebvrexy G (1995), "Activity of plantaricin SA6, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum SA6 isolated from fermented sausage", Journal of Applied Microbiology, 78 (4), pp 349 - 358 36 Sabo S D., Vitolo M., González J J., Oliveira R P (2014),"Overview of Lactobacillus plantarum as a promising bacteriocin producer among lactic acid bacteria", Food Research International, 64, pp.527 – 536 37 Samar L., Hadda O., Nicolas A., Ziad F., Pascal M., Abdellatif B (2012), "Lacticin LC14, a new bacteriocin produced by Lactococcus lactis BMG6.14: isolation, purification and partial characterization",Infect Disord Drug Targets, pp 316 - 325 38 Sankar N., Priyanka V., ReddyP.S., RajanikanthP., Kumar V., Indira M (2012), "Purification and Characterization of Bacteriocin Produced by Lactobacillus plantarum Isolated from Cow Milk",International Journal of Microbiology Research, (2), pp 133 - 137 39 Savadogo A., Ouattara A C., Bassole H I., Traore S A (2006), "Bacteriocins and lactic acid bacteria",African Journal of Biotechnology, (9), pp.678 - 683 54 40 Schägger H., Jagow G V (1987), "Trixin-Sodium Dodecyl SulfatePolyacrylamide Gel Electrophoresis for the Separation of Proteins in the Range from to 100 kDa",Analytical Biochemistry, 166, pp 368 - 379 41 Schlegel R., Slade H D (1972), "Bacteriocin Production by Transformable Group H Streptococci", Journal of Bacteriology, 112 (2), pp 824–829 42 Sifour M., Tayeb, I., Haddar, H O., Namous, H., & Aissaoui, S (2012)., "Production and characterization of bacteriocin of Lactobacillus plantarum F12 with inhibitory activity against Listeria monocytogenes", Journal of Science and Technology, (1), pp 56 - 61 43 Smaoui S., Elleuch L., Bejar W., Karray-Rebai I., Ayadi I (2010), "Inhibition of fungi and gram-negative bacteria by bacteriocin BacTN635 produced by Lactobacillus plantarum sp TN635",Biochemistry and Biotechnology,, 162 (4), pp.1132 - 1146 44 Song D F., Zhu M.Y., Gu Q (2014), "Purification and Characterization of Plantaricin ZJ5, a New Bacteriocin Produced by Lactobacillus plantarum ZJ5",Plos One, (8) 45 Stackebrandt E., Teuber M (1988), "Molecular taxonomy and phylogenetic position of lactic acid bacteria", Biochimie, 90 (3), pp 317-324 46 Todorov S D (2008), "Bacteriocin production by Lactobacillus plantarum AMA-K isolated from Amasi, a Zimbabwean fermented milk product and study of the adsorption of bacteriocin AMA-K to Listeriasp", Brazilian Journal of Microbiology, 39 (1), pp 178 - 187 47 Todorov S D (2009), "Bacteriocins from Lactobacillus plantarum – production, genetic organization and mode of action", Brazilian Journal of Microbiology, 40 (2), pp 209 - 221 48 Todorov S D., Dicks L M (2007), "Bacteriocin production by Lactobacillus pentosus ST712BZ isolated from boza", Braz J Microbiol, 38 (1), pp 1678 - 4405 49 Todorov D S., Vaz-Velho M., Gibbs P (2004), "Comparison of two methods for purification ofplantaricin ST31, a bacteriocinproduced 55 byLactobacillusplantarum ST31", Brazilian Journal of Microbiology, 35(1 2), pp 157-160 50 Tripuraneni S (2011), Effect of Nutrient Supplements on Cucumber Fermentation by Lactic Acid Bacteria, A thesis submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science in Food Science, University of Arkansas 51 Yang S C., Lin C H., Sung C T., Fang, J Y (2014), "Antibacterial activities of bacteriocins: application in foods and pharmaceuticals", Frontiers in Microbiology, 5, pp - 10 52 Zacharof M., Lovitt R (2012), "Bacteriocins Produced by Lactic Acid Bacteria", Biotechnology and Food Science, 2, pp 50 - 56 53 Zhang H., Cai Y (2014), Lactic Acid Bacteria, Springer, 2, pp 103 - 203 54 Zhang H., Liu L., Hao Y., Xie Y (2013), "Isolation and partial characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum BM-1 isolated from a traditionally fermented Chinese meat product", Microbiology and Immunology, 57 (11), pp 746 - 755 55 Zhou J., Esmaily-Moghadam M., Conover T A., Hsia T.Y., Marsden A L., Figliola R S (2015), "In Vitro Assessment of the Assisted Bidirectional Glenn Procedure for Stage One Single Ventricle Repair",Cardiovasc Eng Technol, (3), pp 256 - 267 56 Perez H R.,Zendo T , Sonomoto K (2014), "Novel bacteriocins from lactic acid bacteria (LAB): various structures and applications", Microb Cell Fact, 13(1): S3, pp - 13 56 ... riboflavin, sinh trưởng L plantarum bị ức chế hoàn toàn Một số vitamin (chẳng hạn vitamin H, vitamin C,…) yếu tố kích thích cho tăng trưởng số chủng LAB lại không ảnh hưởng đến tăng trưởng số chủng LAB... sĩ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ Môi trường (2016), Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6261 : 1997 Nguyễn Văn Thanh,... mơi trường MRS có cải tiến tốt Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl thành phần môi trường MRS xác định mơi trường MRS OPTSC01 thích hợp môi trường bao gồm cao thịt bò (10 g/l), cao nấm