Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết trình bày CCoV (Canine Coronavirus) là một tác nhân gây viêm ruột trên chó, được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới. Việc ứng dụng các kỹ thuật chẩn đoán nhanh, chính xác và kịp thời bệnh là hết sức cần thiết. Trong nghiên cứu này, kỹ thuật RT-PCR đã được thiết lập và ứng dụng trong chẩn đoán bệnh do CCoV-II và khảo sát sự lưu hành CCoV trên chó nuôi tại Hà Nội và khu vực lân cận.
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH DO CORONAVIRUS TRÊN CHÓ NUÔI Bùi Thị Tố Nga1, Bùi Trần Anh Đào1, Nguyễn Văn Dũng2 TÓM TẮT CCoV (Canine Coronavirus) tác nhân gây viêm ruột chó, phát nhiều nước giới Việc ứng dụng kỹ thuật chẩn đốn nhanh, xác kịp thời bệnh cần thiết Trong nghiên cứu này, kỹ thuật RT-PCR thiết lập ứng dụng chẩn đoán bệnh CCoV-II khảo sát lưu hành CCoV chó ni Hà Nội khu vực lân cận Kết nghiên cứu cho thấy, phản ứng RT-PCR với cặp mồi 2bF, 2bR phát CCoV-II mẫu lâm sàng mẫu thí nghiệm với độ nhạy 1copy/µl, cao so với cặp mồi S5, S6 (10 copy/µl) Độ đặc hiệu hai cặp mồi 2bF, 2bR S5, S6 cao để phát CCoV-II, khơng phát dương tính mẫu virus Carré, Parvo thử nghiệm Kết khảo sát lưu hành CCoV-II cho thấy tỷ lệ lưu hành chung 30%, tỷ lệ lưu hành CCoV-II nhóm giống chó ngoại (77,23%) cao so với nhóm giống chó nội (22,27%), tỷ lệ lưu hành CCoV-II chó giai đoạn từ tháng đến tháng tuổi cao (68,18%) Từ khóa: Chó, CCoV, RT-PCR, tỷ lệ bệnh, Hà Nội The application of RT-PCR for diagnosing canine coronavirus in domestic dogs Bui Thi To Nga, Bui Tran Anh Dao, Nguyen Van Dung SUMMARY CCoV is a pathogen causing enteritis in dogs in many countries around the world The application of fast, accuracy and timely diagnostic techniques is essential In this study, RT-PCR technique was established and applied for diagnosing and investigating the prevalence of CCoV-II in the domestic dogs raising in Ha Noi and surrounding area The studied result showed that RT-PCR with a pair of 2bF- 2bR primers (detected 1copy/µl) was more sensitive in comparison with S5-S6 primers (detected 10 copies/µl) in identifying CCoV-II The specificity of both primers 2bF-2bR and S5-S6 was high for detecting CCoV, and not to detect the CDV and CPV-positive samples The prevalence of CCoV-II in Ha Noi and surrounding area was 30%, the infection rate of the exotic dog breeds (77.23%) was higher than that of the indigenous dog breeds (22.27%) and prevalence in the dog group from months old to less than months old was the highest (68.18%) Keywords: Dogs, CCoV, RT-PCR, prevalence, Ha Noi City I ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, với phát triển kinh tế đất nước, phong trào nuôi thú cảnh ngày phát triển đa dạng, phong phú với nhiều loại vật nuôi khác nhau, có Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Chi cục Chăn nuôi Thú y Tp Hồ Chí Minh 38 việc ni chó Việc phát triển ni chó tăng mật độ, số lượng thường kèm theo gia tăng mầm bệnh, đặc biệt bệnh truyền nhiễm Bệnh Coronavirus bệnh chó ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe chó ni khơng phát kịp thời phòng trị bệnh hợp lý Virus Corona gây bệnh chó (CCoV) có cấu trúc sợi ARN đơn dương CCoV KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 chia làm hai type: CCoV type I (CCoV-I) CCoV type II (CCoV-II) dựa vào sai khác trình tự nucleotide vùng gen S (Masters ctv, 2013) Với CCoV-II lại phân subtype CCoV-IIa, CCoV-IIb dựa vào khác biệt trình tự 52 nucleotide vùng N terminal S protein (Pratelli ctv, 2010) Con vật mắc chủ yếu tiếp xúc với phân chó nhiễm bệnh chất gây nhiễm CCoV thường xuyên xuất ghép bệnh thường gặp chó khác Ca-rê, Parvovirus… khiến cho cơng tác chẩn đốn gặp nhiều khó khăn Việc chẩn đốn nhanh, kịp thời xác u cầu cần thiết tình hình Tuy nhiên Việt Nam, thông tin ứng dụng phương pháp chẩn đốn nhanh, xác hạn chế, chủ yếu chẩn đoán dựa vào dấu hiệu lâm sàng test xét nghiệm nhanh Do đó, mục tiêu nghiên cứu thiết lập ứng dụng kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán bệnh CCoV nhằm hỗ trợ cho cơng tác phịng trị bệnh ngày hiệu II NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu - Thiết lập tối ưu quy trình RT-PCR chẩn đốn bệnh CCoV chó ni - Bước đầu ứng dụng kỹ thuật RT-PCR xác định tỷ lệ lưu hành CCoV chó ni Hà Nội khu vực lân cận 2.2 Nguyên liệu Mẫu bệnh phẩm: Mẫu phân thu thập từ chó tiêu chảy chó khỏe phịng khám thú y hộ ni Vật tư, hóa chất: Hóa chất, môi trường dùng để bảo quản mẫu: dung dịch PBS, kít ly trích RNA, Kit One step RT-PCR, nuclease-freewater, agarose Thiết bị, dụng cụ: Tủ lạnh, tủ lạnh âm sâu -20ºC, -80ºC, tủ sấy, tủ ấm 370C, tủ ấm 560C, kính hiển vi quang học, buồng cấy vơ trùng, máy chạy PCR, máy điện di, máy đọc chụp ảnh gel Imaging Analyzer, máy ly tâm lạnh, máy vortex, ống nghiệm, ống eppendorff dụng cụ thường quy phịng thí nghiệm 2.3 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thu mẫu: Tổng cộng 66 mẫu phân chó khỏe chó có biểu tiêu chảy thu thập từ phịng khám, hộ ni chó địa bàn thành phố Hà Nội (quận Thanh Xuân, Ba Đình, Hai Bà Trưng, Gia Lâm) Mẫu lấy vào ống falcon vô trùng Mẫu bệnh phẩm sau lấy bảo quản nhiệt độ 2-80C vận chuyển phịng thí nghiệm Mẫu hịa tan trong 2ml dung dịch PBS, sau lọc qua màng 0.22 μm (Millipore, Carrigtwohill, Ireland) bảo quản nhiệt độ -80°C đưa phân tích Phương pháp ly trích RNA virus: RNA virus ly trích kit QIAamp Viral RNA mini kit hãng Qiagen theo hướng dẫn nhà sản xuất Phương pháp RT-PCR: Để phát RNA virus mẫu bệnh phẩm, phản ứng RT-PCR thực dựa kít One step RT-PCR (Qiagen) với cặp mồi 2bF, 5'-AGG TTG TTG TGG ATG CAT AG-3' 2bR, 5'-ACG GTC AAG TTC GTC AAG TA-3' (Poder ctv, 2013) cho việc phát CCoV type II đầu 3’ gen S (spike) Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT- PCR gồm giai đoạn RT: 50oC 30 phút, 95oC 15 phút, phản ứng PCR với 40 chu kỳ (94oC 30 giây, 54oC 30 giây, 72oC phút) giai đoạn kéo dài 72oC phút, sau giữ 4oC Sản phẩm khuếch đại phát kỹ thuật điện di agarose 2% với kích thước 232 bp Sử dụng cặp mồi S5, 5’-TGCATTTGTGTCTCAGACTT-3’ S6, 5’-CCAAGGCCATTTTACATAAG-3’ khuếch đại đầu 5’ gen S (Pratelli ctv., 2004) Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT- PCR gồm giai đoạn RT: 50oC 30 phút, 95oC 15 phút, phản ứng PCR với 40 chu kỳ (94oC 30 giây, 52oC 30 giây, 72oC phút) giai đoạn kéo dài 39 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 72oC 10 phút, sau giữ 4oC Sản phẩm khuếch đại phát kỹ thuật điện di agarose 1,5% với kích thước 694 bp So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu cặp mồi: Để đánh giá độ đặc hiệu phương pháp RT-PCR, chủng chuẩn virus Carré (Nguyen ctv., 2017), Parvovirus (Nguyễn Văn Dũng ctv., 2018) dùng để thử nghiệm Để đánh giá độ nhạy phương pháp RT-PCR, mẫu chuẩn CCoV định lượng pha loãng để thực phản ứng RT-PCR III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 So sánh độ đặc hiệu hai quy trình RTPCR với cặp mồi lựa chọn S5-S6 2b Độ đặc hiệu phản ứng RT-PCR xác định tỷ lệ loại virus khác có kết âm tính với phản ứng RT- PCR tổng số loại virus thử Độ đặc hiệu phản ứng RT-PCR độ đặc hiệu cặp mồi sử dụng Cặp mồi phải lựa chọn cho có khả ghép cặp tốt với trình tự đầu đoạn DNA đích Để đánh giá độ đặc hiệu cặp mồi, thực phản ứng RTPCR sử dụng mồi 2b, mồi S5-S6 với mẫu virus vacxin Parvo, virus Corona Kết (hình 1) cho thấy có RNA virus Corona khuếch đại với kích thước sản phẩm phù hợp với thông tin cặp mồi Điều chứng tỏ mồi có độ đặc hiệu cao với virus Corona, không bắt cặp với mẫu virus vacxin khác Sau tiến hành phản ứng RT-PCR với việc sử dụng cặp mồi 2b S5-S6 phản ứng với virus Corona với độ đặc hiệu cao, bắt cặp sai khác với virus khác Hình Kết đánh giá độ đặc hiệu cặp mồi S5S6 2b M: marker, giếng 1, 2, tương ứng với CPV, CCoV với mồi S5-S6 (694bp), CCoV với mồi 2b (232bp) CDV 3.2 So sánh độ nhạy hai quy trình RTPCR với cặp mồi lựa chọn S5-S6 2b Độ nhạy phản ứng PCR giới hạn phát RNA phản ứng Độ nhạy phản ứng PCR (giới hạn phát hiện) xác định nồng độ thấp cho kết PCR dương tính Giới 40 hạn nồng độ đoạn RNA đích hỗn hợp phản ứng Nhằm đưa đánh giá tổng quan việc sử dụng cặp mồi phản ứng PCR, độ nhạy đánh giá bắt cặp phát nồng độ thấp mà kết PCR dương tính Giữa cặp mồi cách để nhận định tiêu tốn mẫu để KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 tiến hành thí nghiệm, từ tiết kiệm chi phí mẫu sử dụng Phản ứng RT-PCR tiến hành với mẫu ARN virus Corona nuôi cấy môi trường tế bào chuẩn độ Mẫu cung cấp Phòng thí nghiệm vi sinh vật - Khoa Nơng nghiệp - Đại học Yamaguchi Nhật Bản Phản ứng sử dụng cặp mồi S5-S6 2b với với nồng độ mẫu pha lỗng từ 1000 -1copy/µl Cặp mồi có độ nhạy cao cặp mồi có khả phát mẫu nồng độ thấp Qua thử nghiệm, kết cho thấy phản ứng RT-PCR với hai cặp mồi tốt, mẫu virus Corona đem thử cho kết dương tính sáng rõ, sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp, khơng có dương tính giả Như hai cặp mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR để chẩn đoán phát virus Corona Tuy nhiên, cặp mồi S5S6 có khả bắt cặp mẫu với nồng độ 10CFU, cặp mồi 2b có khả phát Marker 1000 100 10 Đối A nồng độ thấp 1copy/µl (hình 2) Do nồng độ ARN gốc dùng cho phản ứng nên kết cho thấy cặp mồi 2b nhạy việc phát virus Corona Kết cho thấy cặp mồi 2b cho hiệu tốt trình chẩn đốn chi phí thực hiện, dung lượng mồi cho phản ứng cần 1copy/µl phát diện virus Còn cặp mồi S5-S6, để phát lưu hành virus, cần dung lượng mồi để chẩn đoán gấp 10 lần so với cặp mồi 2b Ngồi ra, chúng tơi thử giảm thể tích phản ứng xuống 12,5ml cặp mồi 2b cho kết dương tính sáng rõ Như vậy, chẩn đoán CCoV RT-PCR với cặp mồi 2b có độ nhạy cao so với cặp mồi S5-S6 Do đó, chúng tơi sử dụng cặp mồi 2b cho phản ứng RT-PCR phát CCoV phân chó nội dung nghiên cứu Marker 1000 100 10 Đối B Hình Kết đánh giá độ nhạy cặp mồi S5-S6 (A) 2b (B) 3.3 Xác định tỷ lệ lưu hành CCoV chó ni khu vực Hà Nội vùng lân cận Qua khảo sát 66 mẫu phân chó khỏe chó bị tiêu chảy phòng khám thú y 10 hộ dân xung quanh khu vực quận/huyện khu vực Hà Nội cho thấy tỷ lệ lưu hành CCoV type II 30% (22/66 mẫu khảo sát), khơng có khác biệt tỷ lệ lưu hành CCoV theo địa bàn quận/huyện Điều cho thấy có diện CCoV-II đàn chó ni khu vực Hà Nội Sự lưu hành CCoV báo cáo số nước Nhật Bản (56,9%) (Soma ctv., 2016), Trung Quốc ( 23,9%) (Wang ctv, 2011), Ý (36,3%), Anh (20,6%), Hungary (15%), Hy Lạp (36%) (Pratelli ctv., 2004, Decaro ctv., 2010) Kết phân tích lưu hành CCoV-II theo nhóm giống chó, cho thấy giống chó ngoại (77,27%) cao giống chó nội (22,73%) Điều giống chó ngoại có sức 41 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 đề kháng so với chó nội Điều kiện khí hậu, thời tiết mơi trường ni nhốt Việt Nam nguyên nhân gây stress cho giống chó nhập ngoại, dẫn đến khả nhiễm mầm bệnh truyền nhiễm đối tượng cao Ngoài ra, tâm lý người ni chó, họ mang chó đến phịng khám thú y thấy chó bị ốm, bị bệnh Chó nhập ngoại đầu tư chăm sóc chu đáo so với giống chó nội nên lượng chó ngoại đưa đến thăm khám phòng khám nhiều hơn, giống chó nội ni thả tự gia đình, quan tâm sức khỏe Sự khác biệt ảnh hưởng đến số lượng mẫu nghiên cứu đối tượng Kết phân tích theo lứa tuổi cho thấy chó ni giai đoạn từ 2-5 tháng tuổi nhiễm CCoV (68,18%) cao chó tháng tuổi đến năm tuổi (22,73%) năm tuổi (9,09%) Nhóm chó 2-5 tháng tuổi có tỷ lệ nhiễm cao, giai đoạn vật có nhiều thay đổi hình vóc, cân nặng, chó sinh trưởng, phát triển nhanh, hệ thống miễn dịch chưa hồn thiện, ảnh hưởng đến sức đề kháng vật IV KẾT LUẬN Quy trình chẩn đốn CCoV RT-PCR với cặp mồi S5-S6 2b có khả phát tốt CCoV-II mẫu phân chó ni Cặp mồi S5-S6 có độ đặc hiệu tương tự cặp mồi 2b Tuy nhiên, cặp mồi 2b có độ nhạy cao cặp mồi S5-S6 gấp 10 lần Tỷ lệ lưu hành CCoV-II chó ni khu vực Hà Nội 30%, tỷ lệ nhiễm cao nhóm giống chó ngoại (77,23%) nhóm chó giai đoạn tháng đến tháng tuổi (68,18%) TÀI LI ỆU THAM KHẢO Decaro N., Mari V., Elia G., Addie D., Camero M., Lecente MS, 2010 Recombinant canine coronarvirus in dogs, Europe Emerg 42 Infect Dis 16:41-47 Masters, P.S.; Perlman, S Coronaviridae In Fields Virology, 6th ed.; Knipe, D.M., Howley, P.M., Eds.; Lippincott, Williams and Wilkins: Philadelphia, PA, USA, 2013; pp 825–858 Poder L.S Feline and canine coronaviruses: Common genetic and pathobiological features Adv Virol 2011, 11 Nguyen, D.V., Suzuki, J., Minami, S., Yonemitsu, K., Nagata, N., Kuwata, R., Shimoda, H., Vu C.K., Truong, T.Q and Maeda K 2017 Isolation and phylogenetic analysis of canine distemper virus among domestic dogs in Vietnam J Vet Med Sci 79(1): 123-127 Nguyễn Văn Dũng, Phan Xuân Thảo, Vũ Kim Chiến, Ken Maeda Dịch tễ học phân tử Parvovirus chó ni Thành phố Hồ Chí Minh Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y Tập XXV Số 4/2018, trang 12-18 Pratelli, A., Decaro, N., Tinelli, A., Martella, V., Elia, G.,Tempesta, M., Cirone, F., and Buonavoglia, C 2004 Two genotypes of canine coronavirus simultaneously detected in the fecal samples of dogs with diarrhea J Clin Microl.42: 1797-1799 Soma, T.; Ohinata, T.; Ishii, H.; Takahashi, T.; Taharaguchi, S.; Hara, M Detection and genotyping of canine coronavirus RNA in diarrheic dogs in Japan Res Vet Sci 2011, 90, 205–207 Wang, X., Li, C., Guo, D., Wang, X., Wei, S., Geng, Y., Wang, E., Wang, Z., Zhao, X., Su, M., Liu, Q., Zhang, S., Feng, L and Sun, D.2006 Co-circulation of canine coronavirus I and IIa/b with high prevalence and genetic diversity in Heilongjiang province, Northeast China PLoS ONE 11: e0146975 Ngày nhận 4-1-2019 Ngày phản biện 15-4-2019 Ngày đăng 1-6-2019 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ Ở CHÓ MẮC BỆNH CA-RÊ TẠI BỆNH XÁ THÚ Y, TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYEÂN Phan Thị Hồng Phúc, Nguyễn Thị Ngân, La Văn Cơng, Đặng Thị Mai Lan, Nguyễn Thị Bích Đào, Nguyễn Đình Thắng Khoa Chăn ni-Thú y, Trường Đại học Nơng Lâm Thái Nguyên TÓM TẮT Kết kiểm tra 1406 chó bệnh mang đến khám Bệnh xá Thú y, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên cho thấy có 778 ca mắc bệnh truyền nhiễm (chiếm tỷ lệ 55,33%), 222 ca mắc bệnh ký sinh trùng (chiếm tỷ lệ 15,79%), 406 ca mắc số bệnh nội, ngoại khoa khác (chiếm tỷ lệ 28,88%) Trong số 778 chó mắc bệnh truyền nhiễm, có 139 chó mắc bệnh Ca-rê, chiếm tỷ lệ 17,87%; có 49 chó mắc bệnh Ca-rê chết sau khám điều trị (chiếm tỷ lệ 32,25%) Các giống chó ngoại có tỷ lệ mắc bệnh Ca-rê cao giống chó nội, giống chó lai có tỷ lệ mắc cao (12,06%) Tỷ lệ chó mắc bệnh Carê cao lứa tuổi - tháng (15,23%) mắc nhiều vào mùa Xuân (15,8%) Chó mắc bệnh Ca-rê có triệu chứng lâm sàng đặc trưng như: sốt, nôn mửa, chảy dịch mũi xanh, viêm kết mạc mắt, tiêu chảy màu cà phê Tỷ lệ nhiễm bệnh Ca-rê không phụ thuộc vào giới tính chó Chó tiêm phịng vacxin có tỷ lệ mắc bệnh Ca-rê thấp chó chưa tiêm phịng Từ khóa: Chó, Ca-rê, dịch tễ, tỉnh Thái Ngun Study on some epidemiological characteristics of Carré virus infection dogs in the Veterinary Clinic, Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry Phan Thi Hong Phuc, Nguyen Thi Ngan, La Van Cong, Dang Thi Mai Lan, Nguyen Thi Bich Dao, Nguyen Dinh Thang SUMMARY The result of testing 1406 disease dogs at the Veterinary Clinic, Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry showed that there were 778 cases infected with the infectious diseases (accounted for 55.33%), 222 cases infected with the parasitic diseases (accounted for 15.79%), 406 cases infected with the other diseases (accounted for 28.88%) There were 139 dogs out of 778 infectious disease dogs infected with Carré disease, accounting for 17.8%; There were 49 Carré disease dogs died after examination and treatment (accounted for 32.25%) The rate of the exotic dog breeds infecting with Carré disease was higher than that of the indigenous dog breeds, the infection rate of the hybrid dogs was the highest (12.06%) The dogs at 2-6 months old were infected with the highest rate (15.23%); the dogs were infected with the highest rate in spring (15.8%) The Carré disease infection rate was not different between the male or female dogs The Carré disease dogs presented the typical clinic symptoms, such as: fever, vomiting, discharging blue nose fluid, eye conjunctivitis and diarrhea The infection rate of the vaccinated dogs was lower than that of the un-vaccinated dogs Keywords: Dog, Carré, epidemiology, Thai Nguyen province I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Ca-rê bệnh nguy hiểm phổ biến đàn chó nội chó nhập ngoại Ở Việt Nam, bệnh Ca-rê phát từ năm 1920 bác sĩ thú y Pháp Đến nay, bệnh xảy hầu hết tỉnh gây thiệt hại lớn tỷ lệ tử vong bệnh cao Bệnh virus Ca-rê (Canine distemper virus/CDV) gây Virus công vào thể chó số lồi động vật mẫn cảm khác gây nên rối loạn đường hô hấp, tiêu hóa, hệ thần kinh, chứng sừng hóa gan bàn chân rối 43 ... tin ứng dụng phương pháp chẩn đoán nhanh, xác hạn chế, chủ yếu chẩn đốn dựa vào dấu hiệu lâm sàng test xét nghiệm nhanh Do đó, mục tiêu nghiên cứu thiết lập ứng dụng kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán bệnh. .. phịng trị bệnh ngày hiệu II NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu - Thiết lập tối ưu quy trình RT-PCR chẩn đốn bệnh CCoV chó ni - Bước đầu ứng dụng kỹ thuật RT-PCR. .. mồi Điều chứng tỏ mồi có độ đặc hiệu cao với virus Corona, không bắt cặp với mẫu virus vacxin khác Sau tiến hành phản ứng RT-PCR với việc sử dụng cặp mồi 2b S5-S6 phản ứng với virus Corona với