Dùng Trypsin thêm Axít Amin tách tế bào phôi gà và đánh giá sự phát triển các tế bào đó

BỊ GIAO DUO VÀ DÀO TAO • • • DAI HOC QC GU HA NĨI TRNG DAI HOC KHOA HOC TUNHIÈN **** CAO XUAN THINH DÙNG TRYPSIN THÈM AXIT AMIN TÀCH TÉ BÀO PHÒI GÀ VÀ DANH GIÀ SUPHÀT TRIÉN CÙA TÈ BÀO DÒ LUAN AN THAC S? KHOA HOC HOA HOC Qiun ngành: Hồ HOu co Masd: 01-04-02 Ngrf hiróng dàn khoa hoc: GS.TS.KH Ngị Thi Thn GS.TS.KH Ngun Vàn Man HA NĨI-2000 MUC LUC Trang MỊ DÀU CHUONGLTĨNG QUAN Ll.Tébào 7.7.7 Saluge lich sùtébào hgc 7.7.2 Màng bào tuoitg 1.1.3 Siéu càu trùc cùa càc vùng lién két giua càc té bào 10 7.7.-^ Suphàn chia té bào 19 1.2 Trypsin 19 7.2.7 Càc tién chat cùa enzym 19 7.2.2 Hogt hoà trypsinogen 20 1.2.J? Dàc diém cùa trypsinogen - co che thuy phàn protein, dnh hiìg cùa nhiet dị va pll dai vói trypsin 23 1.2.4 Nhoni hydroxyl cùa serin 28 7.2.5 Axit amin 30 CHUONG VÀT LIÈU VÀ PHUONG PHÀP THUC NGHIÈM 2.1 Vatlieu 2.7.7 Trang thiét bi va dung cu can thiét 32 32 2.7.2 Càc mói truàng càn thiét dùng de tàch va nuói cày té bào 33 2.2 Phifimg phap thirc nghiem 2.2.7 Chuàn hi tritng gà co phói 37 37 2,2.2 Chuàn hi nuói cày té bào CEF (Chick Embryos Fibroblast) CHUONG KÉT QUA VÀ THÀO LUÀN 3.1 So té bào song / mi dirgc tàch tir phói gà 39 40 40 3.2 So té bào chét / mi dugc tàch tir phói gà 42 3.3 So té bào song / gam dirgc tàch tir phòl gà 43 3.4 So té bào chét / gam dirgc tàch tir phói gà 44 3.5.Ty le té bào song / tong so té bào (%) tàch tir phói gà 45 3.6 Quan sàt sir phàt trién cùa té bào qua ngày nuói cày 46 3.7 Su nhàn cùa virut trén té bào phói gà 48 3.8 Su phàn huy va tài tao té bào 51 3.9 Tàc dung cùa trypsin va trypsin axit amin 52 KÉT LUÀN 57 TÀI LIÈU THAMKHÀO 58 MODÀU Tir dàu thàp nién 1950 viéc nghién culi va phàt trién càc vaexin da eó dugc buóc tién bó nbày vgt nhó phuang phàp nuói cà'y té bào in vitro thành cóng Thoat tién Goodpasture dà ni cà'y tình dugc màng phói gà Sau dị Maitland dà cài tién ni té bào thàn gà chai thuy tinli, dùng mói truàng eó huyét gà va mot sĨ mi khồng de cà''y virut vaexin Khóng lAu ve sau, Gey da eó mot dóng góp dàng ké : óng de xuA't phuang phàp quay trịn lién tue càc óng nghiém nuói té' bào dà cày virut vaexin va bÀng ky thuAt Gey dà thu hoach dugc lugng virut lón han gA'p bịi Cilng nhiTng nàm 50, Enders, Wella va Robbins thue hién nhiéu thf nghiém cày virut trén té bào ngi ni in vitro, chù yéu càc nguyén bào xa (fibroblast) tu tĨ chirc da va ea cùa tré chét mói sinh Bang phuang phàp càc tàc già dà dat dugc nhung két qua rat khà quan dugc polyovirut typ II Langsing vói khói lugng khà lón té bào nuói Thành cóng viéc su diing té' bào nuói in vitro de cày virut gay bénh cho nguói dà ma mot ky nguyén mói nghién cuu va phàt trién mot loat càc vaexin mai phòng càc bénh bai liét, dai, quai bj, thuy dàu, sai, v.v Gịng nghé ni té bào a mot quy mó lón ngày dugc cài tién va hoàn thién sé tao diéu kién thuAn Igi hon nùa cho viéc san xuà't càc vaexin va nghién ciru sinh y hoc Bang phuang phap trypsin hồ ngi ta dà tàch dugc càc té bào riéng ré tìrmó [3] Trypsin mot nhung enzym phAn giài protein dac hiéu nhA't san eó va cung dugc su dung róng rai nhàt [9] Trypsin vói net dàc tnrng cùa chuói peptit lién quan dé'n nhóm eaeboxyl cùa càc axit amin ea ban [22] diéu kién thieh hgp trypsin boat dóng rat huu hiéu viéc tàch mó, nhung trypsin sé phà huy té' bào né'u kéo dai thịi gian trypsin hồ [26] Tiì u cÀu thue té càn lugng té bào song nhiéu han, nén chùng tói tién hành nghién cuu de tài: ''Dùng trypsin thém axit amin tàch té bào phói gà va dành già su phàt trién cùa té bào dò " Mue tiéu cùa de tài bao góm nhung vA'n de ehinh sau: )Nghién cùru ành huong cùa trypsin va trypsin co axit amin dén sir tàch té bào phói gà 2) Dành già sir phàt trién cùa hai nhóm té' bào tàch dugc theo càc phuang phàp trén Chuong TÓNG QUAN 1.1 Té bào 7.7.7, Saluge lich sùtébào hgc Té bào dugc Robert Hook phàt hién lÀn dàu tién vào nàm 1665 nhò kmh hién vi tir tao vói dị phóng dai 30X Ong dà xt ban euón "Kinh hién vi" mó ta nhiéu dói tugng ma óng dà quan sàt dugc Ong mó tà càu tiiie cùa tiéu bau thue vAt dcing càc xoang róng eó thành bao quanh va dat tén cella [4] Antoni Van Leuvenhock (1674) vói kmh hién vi eó dị phóng dai 270X dà mó tà càc té bào dóng vAt va dà xàc djnli té bào khóng phài xoang róng ma eó cA'u trùc phùe tap Tu quan diém té bào "xoang róng" dà chuyén sang quan niém té bào khói té bào chat eó chùa nhàn (R Brawn, 1831) va dugc giói han bịi màng té bào [4] Nhiéu qua trình sinh ly quan cùa té bào dugc nghién cuu làm ca sa cho sir phàt trién cùa di truyén hoc , sinh ly hoc va phói sinh hoc a ci théky XIX va dàu théky XX [21] Ca thè ehi song tiiròng hgp néu càc hgp phÀn cùa nò dugc càu tao tir le bào Mó cùa tA't cà càc ea thè déu bao góm nhung té bào gAn vói bÀng nhiìng lue bàm thóng thng TA't cà càc mó va càc ca quan ehi càc khói té bào bién dang khàc [11], té bào sinh bang eàch chia dói va co cAu phàt biéu nói tié'ng : "Ngồi té bào khóng su song" [4] Hoc thuyét té bào dirge Engels dành già mot mhiìng su kién lón nliAt cùa thè ky 19 Hoc thuyét cho rÀng: + Mèi ca thè song déu eó càu tao té bào va san phàm boat dóng song cùa té bào + Càc té bào mói duae hình thành ti^ su phAn chia té bào cu + Thành phàn hoà hoc va su chuyén hoà cùa chùng rat gió'ng Boat tinh ca thè tồn ven bao góm boat tinh va su tàc dóng tuang hó cùa càc dan vi té bào dóc lAp càu tao nén nị [5] Té bào dan vj só'ng ea ban dugc tao thành bòi càc thành phàn quan lién quan màt thiét vói góm thành phàn ea ban: màng, té bào chA't, nhàn [4] 7.7.2 Màng bào tuoyig Trong de tài nghién cuu bang phuang phàp trypsin hồ chùng tói da tàch dugc iihùng té bào riéng ré tir mó (phói gà), de bié't dugc nhung tàc dung tfch cuc cung nhu khóng tieh ciré viéc thuy phAn protein màng té bào cùa trypsin Chùng tói quan tAm rat nhiéu dé'n cA'u tiijc cùa màng, dac biét dé'n càc phàn biét hồ cùa màng nói giua càc té bào vói Màng bào tuong màng ngàn, giói han su ngA'm thu dóng dàn dé'n két qua màng dò chi cho phép càc chA't di qua theo gradien nóng dị, ngi ta thày ràng niróc va nhung chA't kliói lugng phAn tir nhị di qua màng ngàn mot eàch tu Su vAn chuyén mot so chat nhu duòng, axit amin co su tham già cùa càc enzym Càc enzynì làm tàng toc dò thAm thà'u cùa càc chat dò qua màng He thóng enzym tham già vào thành phàn càu tao cùa ehinh màng va boat dóng nhu "chat chuyén chị" khóng phii thc vào nàng lugng [5] Màng té bào mot màng rat mịng , khóng thè nhìn thA'y dugc duói kùih hién vi quang hoc ma dugc nhìn thA'y di knih hién vi dién tu Màng bào tuong boc quanh té bào dugc xàc nhàn nhò càc hién tugng sau: - Càc ch^t chùa té' bào bi chày ra, dàc biét thié'u Ca^^ té' bào bi tén thircfng - Càc loai phàn tu ngà'm vào tè' bào khịng tó'c dị nhir - Nhùng ion nhu phàn tir mang dién tfch thàm nhàp vào té' bào chàm han nhùng phan tir khòng mang dién tich - Nhùng phàn tir bé thàm nhap vào té' bào nhanh hon nhùng phàn tu lón a Càu tao cùa bào tuong Overton (1902) nhàn thà'y nhùng chc'ft hoà tan lipit rà't de xàm nhàp vào té' bào, dòng thòi òng ta nhftn thà'y ràng nhùng dung mòi cùa lipit va nhùng men iipaza phà huy màt té' bào Tu dò òng két luàn màng bào tuong co chat lipit Già thuyét duoc khàng dinh sau nguòi ta nhàn thày nhùng hoc7t dóng men ị màt ngồi màng bào tuong Tu dò két luàn màng bào tuong dugc tao thành bòi lipit va protit Bang phuong phàp hoà hoc té' bào, ngi ta cịli chùng minh su co màt mot lóp chat co tinh chat cùa polysaccarit o trén màt té' bào Phàn tfch hoà hoc, nhàn thày màng bào tuong tàch rói co lipit, protit vói so lugng tuong duong, dóng thịi co thém polisaccarit [28] Màng bào tuong mot màng dàm, day ềch màng té' bào bịi mot vùng sàng nhị hon dị mot tnjóng hgp càc desmosom dà dugc biét hồ cao dị [6] Màng té' bào co thè két dfnh vói Màng bào tuong co thè cà'u trùc kiéu màng, song song vói màt té' bào Càc màng lién két vói mot khn co ban chat hồ hoc gàn giị'ng keratohyaline [18] Càc sgi nhị nói té bào (tonofilaments) nhùng thành phàn quan nhà't cùa vùng lién két Tonofilaments co duòng kfnii 10 nm, xuyén qua càc màng bào tuong, va chia tiiành càc tién sgi bàm vào càc tiéu thè protein nói màng Càc tonofilaments mot thành phàn cùa bó xuong té bào, chat sùng cùa té' bào nguòi ta dành già rat cao già tri cùa gangliosit eó trén màng té bào Nhfmg chat tuong tu nhu photpholipit nị mot ehi ki nuóc, nhung phàn eó ciré thi dai va két thue boi axit neuramin, cài ma co mot nhóm eaeboxyl tir Cuc cuòi cùa phAn tu chùra N-axetyllactosamil, glaetosamil va diròng glucose [17] Dién tieh bé màt Am tinh ngi ta cho ràng lién quan dé'n nóng dị cùa doan ci axit neuramin Sau hồ tan nhe vói neuraminidase dac biét thi axit neuramin tan tir té bào song va tinh (-) cùa bé mat giàm Càc thành phÀn quan cùa gangliosit dóng vai trị vàn chuyén ion va màng chùra neuron Ben canh viéc tao nén càc nhóm eaeboxyl ionogen trén bé mat té bào axit neuramin thành phàn quan cùa mot sé khàng nguyén bé màt (vimt va khàng nguyén toxin) Nhung diéu dò chi ràng càc gangliosit thành phàn cA'u trùc quan cùa màng té bào e Su biét hoà màng bào tuong va su két dinh Càc té bào canh cùa co thè dugc ngan ềch boi nhung khồng gian bào, giàn doan tùng quàng theo càc kiéu phùe hgp lién két Càc té bào dugc ràp lai vói qua càc móng Càc khồng gian bào: Càc té bào khịng dfnh vói trén suót chiéu dai cùa chùng Trong biéu mó hình lang kmh don giàn thày nhung kè ho giua càc té bào, dị càc khồng gian bào dinh eó mot càu trùc ggi khung té bào, co tàc diing ngàn khóng cho dich lién bào thồt va khóng cho chat liéu bé mat biéu mó nhAp vào khồng gian bào Khồng gian bào eó kieh lluróc tuong dói bang dinh Càc té bào lién két dugc vói mot chA't "kco" co chira càc protein (fibroneetin, elastin, collagen) Su eó màt cùa Mg'^ va Ca'' cÀn thiét cho sir lién két giùa càc té bào [ 14] 1.1.3 Siéu càu trùc cùa càc vùng lién két giira càc té bào Càc té' bào dugc phàn ềch vói bang mot khồng gian bào hep hồc rịng Càc té' bào khóng dfnh vói trén suót chiéu dai cùa chùng ma thà'y co nhùng kè ho giùa càc tè' bào, dị càc khồng gian bào Khồng gian bào co kfch thc tucmg dĨi hàng djnh [11] Trong gian bào co djch khe vàn chu'n càc chà^t ni dng, càc chà't tié't va càc chat thài [15] Tai mot sĨ vùng càc màng tè' bào dinh lai vói Càc vùng lién két góm càc kiè'u lién két khàc nhau: (hình 2, 3, 4, 5a, 5b, 5c, 5d,5e ) - Càc lién két kiéu chat - Càc lién két kiéu khe - Càc lién két kiéu càu nói - Càc lién két kiéu desmosom a Càc lién két kiéu chat Dò càc vùng chuyén biét cùa màng, tai dị càc ngồi lién ké't vói dén nói khịng khồng gian bào nùa, va nhu vày khòng su van chuyén chat giùa càc té' bào Lién két kiéu chat thng thà'y ó nhiéu mó, nói lién càc té' bào nói mó Kiéu lién két chat khịng chó cho dich luu chun giùa càc té' bào Vi vày viéc trao dói ó day giùa hai té' bào, chù khòng phài qua càc gian bào Mịi màng té'bào thc lién két kiéu chat déu co chùa pròtéin dugc ggi càc connexin [4] (càc chat nói )(hình 2) 10 Hình7- Su phàt trién cùa té bào duge tàch bang trypsin b Trypsin axit amin Hón dich té Hésị Z hịn dich SỊ chai bào ban dàu pha té'bào cuòi nuòi (mi) loang cùng(ml) cà'y Nhàn xét té' bào phàt trién 100 8,96 896 59 bình thng va kfn Nhu vày, càc té bào bào thai gà duge tàch bang trypsin axit amin phàt trién tịt hon té bào hình sgi moc khàp thành chai (hình 8) va sĨ chai ni cày gàn gap dói (59/ 34) Qng tói da kiém tra càu tnic nliu chat lugng cùa té bào thi thày chùng vàn bình thng Chùng tịi nghì ràng thè té bào duge tàch bang trypsin thém axit amin ft bi ton thng, sau tàch khịi mó càc té bào dugc hàp thu thém mot lugng axit amin càn thiét cho su phàt trién sau cùa té bào Vi vày qua trình ni cày sĨ té bào chét sé ft hon 47 HìnbS- Su phàt trién cùa té bào tàch bang trypsin axit amin 3.7 Su nhàn cùa virut trén té bào phịi gà Bc dàu chùng tói thue hién nghién cuu nhiém virut vaexin soi trén lóp té bào phịi gà dà phàt trién sau hai ngày nuòi cày Quan sàt thày su nhàn cùa vimt bang kfnli hién vi dién tu trén hai lóp té bào duge tàch bang trypsin va trypsin co axit amin Vi rùt nhàn bào tuong té bào hồn chinh càc virut mói Hình thài virut hình càu dng kfnh khàc tu SOnm dén 250nm, vimt eó dang sgi dai 300nm, ben chùa chat Nueleocapsit cùa viiut Qua trình nhàn cùa virut gay huy boai té bào phói gà (hình 9,10,11) 48 Hình - Té b bào thai gà bình thng (ành phóng dai 60.000) 49 ma Hình 10 - T6 bào bào thai gà nhiém vinjl vaexin sèi san Tigày gay nhiém, virai sòi nhàn lèn ò bào tiroiig té bào Vt (ành phrtng dai 60.000) È;'«#*eptit tìm thà'y càc chat bao bgc màng Tu* day y nghì té bào san xt dich tié't Colbidalis nhu u tĨdinh bng Hién san x't mot sĨ locii vaexin, hồc cóng nghé gen phài su diing dén nhiéu té bào khàc nhau, nhung té bào dugc tàch ti^ nhung mó nhu: thàn, da, phịi hồc bào thai Trén thue té bang phuong phàp trypsin hoà da tàch duge càc té bào riéng rè tu càc mó va nuói cày chùng de phàt trién thành té bào mot lóp Trypsin mot enzym thuy phàn protein cùa màng té bào, càt càc lién két pepit va càc lién két khàc nói càc té bào vói Trong qua trình trypsin hồ mot sĨ té bào co nhung u tó gay ành huong dén boat dóng trypsin nhu càc ion kim loai Vi vày dói vói nhùng loai té bào dùng trypsin de tàch nguòi ta thuòng dua thém mot lugng nhò EDTA (Etylen Dimetyl Tetra axetic Axit) nhàm tao phù'c vói càc ion kim loai giùp 51 cho boat dóng trypsin de dàng hon viéc càt càc lién ké't Nguge lai trypsin cung gay tén thuòng màng té bào, ành huong dé'n su phàt trién sau Nén nguòi ta da bé sung thém mot sĨ axit amin càn thiét ma té bào khóng tu tóng hgp duge vào mot sĨ mói trng ni cà'y té bào, hoàc vào dung dich trypsin qua trinh trypsin hoà giùp cho viéc tàch té bào dat hiéu qua cao hon 3.9 Tàc dung cùa trypsin va trypsin axit amin tàch té bào tir mó Trypsin mot enzym eó tàc diing thuy phàn lién ké't peptit, lién két amin, lién két este arginin hay lysin tao nén; a-benzoyl-L-argininamit hoac a-benzoyl-L-Lysinamit nhung mó hình co chat thfeh hgp cùa enzym Trong tniòng hgp nhung nhóm cation cùa co chat dugc két hgp vói nhóm aspatyl (vói nhóm COO' cùa axit aspatie) cùa phàn tu enzym mot eàch rat chfnh xàc Nhung chat co càu tao phàn tu dai hon phàn tu co chat mot nhóm CH2 nhu a-benzoyl-L-homoargininamit hồc ngàn hon phàn tu co chat mot nhóm CHj nhu a-benzoyl-L-omithiamit déu khóng chiù tàc dung cùa trypsin, eó le nlióm cation cùa co chat khóng ị vi trf tuong ùng vói nhóm anion cùa enzym Enzym vira dàc hiéu vói co chat vira dàc hiéu vói phàn ùng hồ hgc nén tfnh dàc hiéu cùa enzym rat cao Tuy nhién, eó nhung enzym co tinh dàc hiéu tuyét dói, nhung eó nhung enzym ehi eó tfnh dàc hiéu tuong dói Bàn chat cùa trypsin mot enzym xùc tàc, càu trùc If boa dac biét cùa phàn tu enzym va dac biét tmng tàm hoat dịng ma tfnh dàc hiéu rat cao so vói nhung chat xùc tàc thóng thng khàc Trypsin enzym dugc tóng hgp qua mot giai doan trung gian càc tién chat cùa enzym (proenzym) Càc tién chat phài trai qua mot qua trình bién dói sàp xép lai cà'u trùc phàn tu mói bién thành enzym boat dong duge Trypsin enzym thuy phàn protein, duge su dung viéc tàch mó cùa té bào tao càc té bào riéng le Trypsin thuy phàn càt lién két peptit cùa protein nói càc màng 52 tè' bào mị Phàn lón té bào bié'u mó, càc mao mach va nhiéu noi ị khoàng gian bào ta co thè gap glucoprotein va polysaccarit ị dang axit hyaluron hồc gàn day ngi ta goi glucocalyx de chi sir co màt cùa càc màng polysaccarit va glucoprotein bao boc té' bào Càc bé màt té' bào tiét chà't kè trén, ràng khóng phài càn thiét hoàn toàn dé'n su toàn ven cùa té' bào, nhir sau chung ta dà thà'y nị dóng vai trị rat quan trong viéc càc té' bào hofp lai thành mó Trong tó chirc lién ké't hyaluron dòng vai trò chi dao thàm thà'u Su tri càc vi mói tmịng cùa té bào nhùng tàng bao boc ngoai bào co thè ành huong dé'n nóng dị càc chat khàc trén bé màt té' bào Khóng chi vi hoat dóng nhu barie thàm thà'u ma ành hng dé'n nóng dị cation cùa mói tiirịng té' bào Tir quan diém nị tucmg tir nhu viéc trao doi ion hoà hoc Càc glucocalyx bao boc màng té' bào nhay càm, kfch thich cùa té' bào co, vi du nhu khà nàng giù \a\ ion Na^, nguoc lai axit hyaluron co thè thay dói rat manh thàm chi làm dói hàn trén dién tich bé màt té' bào va dò pH Day chfnh nguyén nhàn cùa sir thay dói hoat tfnh cùa càc enzym trén màng té bào noi ma co thè tàch chùng khịi càc vi mó tè' bào a Tàch té bào bang trypsin Trong qua trình tàch tè' bào tu mị bang trypsin theo phuong phàp thóng tlìiróng, SĨ luong té bào duoc tàch chua cao nhiéu mó chua duoc tàch Do cà'u trùc cùa màng va càc lién ké't giùa càc té' bào rat phùc tap nén khà nàng hoat dòng cùa tàm hoat dòng bi ành huong Khi hoat dòng de thuy phàn protein tàm hoat dong phài làm hoàc xoàn càc lién két de be gay càc lién két Viéc tàch té' bào khịi mó bang phuang phàp co hoc cQng gay ành huong khịng it tói màng té' bào, nhà't dói vói nhùng té' bào vira duoc tàch khịi mị Bình thng enzym dugc bao boc kfn màng lypoprotein cùa lysosom bi phà vị hồc bi tón thng, càc he enzym cùa nị bi giài phóng 53 se làm tiéu huy cà té bào Mot diéu dàng chù