DÙNG TRYPSIN THÈM AXIT AMIN TÀCH TÉ BÀO PHÒI GÀ VÀ DANH GIÀ SU PHÀT TRIÉN CÙA TÈ BÀO DÒ

BÒ GIAO DUO VÀ DÀO TAO • • • DAI HOC QUÓC GU HA NÓI TRUÒNG DAI HOC KHOA HOC TUNHIÈN **** CAO XUAN THINH DÙNG TRYPSIN THÈM AXIT AMIN TÀCH TÉ BÀO PHÒI GÀ VÀ DANH GIÀ SUPHÀT TRIÉN CÙA TÈ BÀO DÒ LUAN AN THAC S? KHOA HOC HOA HOC Qiuyèn ngành: Hoà HOu co Masd: 01-04-02 Nguòrf hiróng dàn khoa hoc: GS.TS.KH Ngò Thi Thuàn GS.TS.KH Nguyén Vàn Man HA NÓI-2000 MUC LUC Trang MÒ DÀU CHUONGLTÓNG QUAN Ll.Tébào 4 7.7.7. Saluge lich sùtébào hgc 4 7.7.2. Màng bào tuoitg 5 1.1.3. Siéu càu trùc cùa càc vùng lién két giua càc té bào 10 7.7 ^. Suphàn chia té bào 19 1.2. Trypsin 19 7.2.7. Càc tién chat cùa enzym 19 7.2.2. Hogt hoà trypsinogen 20 1.2.J?. Dàc diém cùa trypsinogen - co che thuy phàn protein, dnh huòiìg cùa nhiet dò va pll dai vói trypsin 23 1.2.4. Nhoni hydroxyl cùa serin 28 7.2.5. Axit amin 30 CHUONG 2. VÀT LIÈU VÀ PHUONG PHÀP THUC NGHIÈM 2.1. Vatlieu 32 2.7.7. Trang thiét bi va dung cu can thiét 32 2.7.2. Càc mói truàng càn thiét dùng de tàch va nuói cày té bào 33 2.2. Phifimg phap thirc nghiem 37 2.2.7. Chuàn hi tritng gà co phói 37 2,2.2. Chuàn hi nuói cày té bào CEF (Chick Embryos Fibroblast) 39 CHUONG 3. KÉT QUA VÀ THÀO LUÀN 40 3.1. So té bào song / mi dirgc tàch tir phói gà 40 3.2. So té bào chét / mi dugc tàch tir phói gà 42 3.3. So té bào song / gam dirgc tàch tir phòl gà 43 3.4. So té bào chét / gam dirgc tàch tir phói gà 44 3.5.Ty le té bào song / tong so té bào (%) tàch tir phói gà 45 3.6. Quan sàt sir phàt trién cùa té bào qua 2 ngày nuói cày 46 3.7. Su nhàn lén cùa virut trén té bào phói gà 48 3.8. Su phàn huy va tài tao té bào 51 3.9. Tàc dung cùa trypsin va trypsin axit amin 52 KÉT LUÀN 57 TÀI LIÈU THAMKHÀO 58 MODÀU Tir dàu thàp nién 1950 viéc nghién culi va phàt trién càc vaexin da eó dugc buóc tién bó nbày vgt nhó phuang phàp nuói cà'y té bào in vitro thành cóng . Thoat tién Goodpasture dà nuói cà'y tình dugc màng phói gà. Sau dò Maitland dà cài tién nuói té bào thàn gà trong chai thuy tinli, dùng mói truàng eó huyét thanh gà va mot sÓ muói khoàng de cà''y virut vaexin. Khóng lAu ve sau, Gey da eó mot dóng góp dàng ké : óng de xuA't phuang phàp quay tròn lién tue càc óng nghiém nuói té' bào dà cày virut vaexin va bÀng ky thuAt này Gey dà thu hoach dugc lugng virut lón han gA'p bòi. Cilng trong nhiTng nàm 50, Enders, Wella va Robbins thue hién nhiéu thf nghiém cày virut trén té bào nguòi nuói in vitro, chù yéu là càc nguyén bào xa (fibroblast) tu tÓ chirc da va ea cùa tré chét khi mói sinh. Bang phuang phàp này càc tàc già dà dat dugc nhung két qua rat khà quan là dugc polyovirut typ II Langsing vói khói lugng khà lón trong té bào nuói. Thành cóng trong viéc su diing té' bào nuói in vitro de cày virut gay bénh cho nguói dà ma ra mot ky nguyén mói nghién cuu va phàt trién mot loat càc vaexin mai phòng càc bénh bai liét, dai, quai bj, thuy dàu, sai, v.v Gòng nghé nuói té bào a mot quy mó lón ngày càng dugc cài tién va hoàn thién sé tao diéu kién thuAn Igi hon nùa cho viéc san xuà't càc vaexin va nghién ciru sinh y hoc. Bang phuang phap trypsin hoà nguòi ta dà tàch dugc càc té bào riéng ré tìrmó [3]. Trypsin là mot trong nhung enzym phAn giài protein dac hiéu nhA't san eó va cung dugc su dung róng rai nhàt [9]. Trypsin vói net dàc tnrng cùa chuói peptit lién quan dé'n nhóm eaeboxyl cùa càc axit amin ea ban [22]. 0 diéu kién thieh hgp trypsin boat dóng rat huu hiéu trong viéc tàch mó, nhung trypsin sé phà huy té' bào né'u kéo dai thòi gian trypsin hoà [26]. Tiì yéu cÀu thue té càn lugng té bào song nhiéu han, nén chùng tói tién hành nghién cuu de tài: ''Dùng trypsin thém axit amin tàch té bào phói gà va dành già su phàt trién cùa té bào dò " . Mue tiéu cùa de tài bao góm nhung vA'n de ehinh sau: 1 )Nghién cùru ành huong cùa trypsin va trypsin co axit amin dén sir tàch té bào phói gà. 2) Dành già sir phàt trién cùa hai nhóm té' bào tàch dugc theo càc phuang phàp trén. Chuong 1 TÓNG QUAN 1.1. Té bào. 7.7.7, Saluge lich sùtébào hgc. Té bào dugc Robert Hook phàt hién lÀn dàu tién vào nàm 1665 nhò kmh hién vi tir tao vói dò phóng dai 30X. Ong dà xuàt ban euón "Kinh hién vi" mó ta nhiéu dói tugng ma óng dà quan sàt dugc. Ong mó tà càu tiiie cùa tiéu bau thue vAt à dcing càc xoang róng eó thành bao quanh va dat tén là cella [4]. Antoni Van Leuvenhock (1674) vói kmh hién vi eó dò phóng dai 270X dà mó tà càc té bào dóng vAt va dà xàc djnli té bào khóng phài là xoang róng ma eó cA'u trùc phùe tap. Tu quan diém té bào là "xoang róng" dà chuyén sang quan niém té bào là khói té bào chat eó chùa nhàn (R. Brawn, 1831) va dugc giói han bòi màng té bào [4]. Nhiéu qua trình sinh ly quan trong cùa té bào dugc nghién cuu làm ca sa cho sir phàt trién cùa di truyén hoc , sinh ly hoc va phói sinh hoc a cuòi théky XIX va dàu théky XX [21]. Ca thè ehi song trong tiiròng hgp néu càc hgp phÀn cùa nò dugc càu tao tir le bào. Mó cùa tA't cà càc ea thè déu bao góm nhung té bào gAn vói nhau bÀng nhiìng lue bàm thóng thuòng. TA't cà càc mó va càc ca quan ehi là càc khói té bào bién dang khàc nhau [11], té bào sinh ra bang eàch chia dói va co cAu phàt biéu nói tié'ng : "Ngoài té bào khóng eó su song" [4]. Hoc thuyét té bào dirge Engels dành già là mot trong mhiìng su kién lón nliAt cùa thè ky 19. Hoc thuyét cho rÀng: + Mèi ca thè song déu eó càu tao té bào va san phàm boat dóng song cùa té bào. + Càc té bào mói duae hình thành ti^ su phAn chia té bào cu + Thành phàn hoà hoc va su chuyén hoà cùa chùng rat gió'ng nhau. Boat tinh ca thè toàn ven bao góm boat tinh va su tàc dóng tuang hó cùa càc dan vi té bào dóc lAp càu tao nén nò [5]. Té bào là dan vj só'ng ea ban dugc tao thành bòi càc thành phàn quan trong lién quan màt thiét vói nhau góm 3 thành phàn ea ban: màng, té bào chA't, nhàn [4]. 7.7.2. Màng bào tuoyig Trong de tài nghién cuu này bang phuang phàp trypsin hoà chùng tói da tàch dugc iihùng té bào riéng ré tir mó (phói gà), de bié't dugc nhung tàc dung tfch cuc cung nhu khóng tieh ciré trong viéc thuy phAn protein màng té bào cùa trypsin. Chùng tói quan tAm rat nhiéu dé'n cA'u tiijc cùa màng, dac biét dé'n càc phàn biét hoà cùa màng nói giua càc té bào vói nhau. Màng bào tuong là màng ngàn, giói han su ngA'm thu dóng dàn dé'n két qua là màng dò chi cho phép càc chA't di qua theo gradien nóng dò, nguòi ta thày ràng niróc va nhung chA't eó kliói lugng phAn tir nhò di qua màng ngàn do mot eàch tu do. Su vAn chuyén mot so chat nhu duòng, axit amin co su tham già cùa càc enzym. Càc enzynì làm tàng toc dò thAm thà'u cùa càc chat dò qua màng. He thóng enzym này tham già vào thành phàn càu tao cùa ehinh màng va boat dóng nhu "chat chuyén chò" khóng phii thuóc vào nàng lugng [5] Màng té bào là mot màng rat mòng , khóng thè nhìn thA'y dugc duói kùih hién vi quang hoc ma dugc nhìn thA'y duói knih hién vi dién tu . Màng bào tuong boc quanh té bào cùng dugc xàc nhàn nhò càc hién tugng sau: - Càc ch^t chùa trong té' bào bi chày ra, dàc biét là khi thié'u Ca^^ khi té' bào bi tén thircfng. - Càc loai phàn tu ngà'm vào tè' bào khòng cùng tó'c dò nhir nhau. - Nhùng ion cùng nhu phàn tir mang dién tfch thàm nhàp vào té' bào chàm han nhùng phan tir khòng mang dién tich. - Nhùng phàn tir bé thàm nhap vào té' bào nhanh hon nhùng phàn tu lón. a. Càu tao cùa bào tuong. Overton (1902) nhàn thà'y nhùng chc'ft hoà tan trong lipit rà't de xàm nhàp vào té' bào, dòng thòi òng ta nhftn thà'y ràng nhùng dung mòi cùa lipit va nhùng men iipaza phà huy màt té' bào. Tu dò òng két luàn màng bào tuong co chat lipit . Già thuyét duoc khàng dinh sau khi nguòi ta nhàn thày nhùng hoc7t dóng men ò màt ngoài màng bào tuong. Tu dò két luàn màng bào tuong dugc tao thành bòi lipit va protit. Bang phuong phàp hoà hoc té' bào, nguói ta còli chùng minh su co màt mot lóp chat co tinh chat cùa polysaccarit o trén màt té' bào. Phàn tfch hoà hoc, nhàn thày màng bào tuong tàch rói co lipit, protit vói so lugng tuong duong, dóng thòi co thém polisaccarit [28]. Màng bào tuong là mot màng dàm, day eàch màng té' bào bòi mot vùng sàng nhò hon dò là mot tnjóng hgp càc desmosom dà dugc biét hoà cao dò [6]. Màng té' bào co thè két dfnh vói là trong. Màng bào tuong co thè cà'u trùc kiéu màng, song song vói màt té' bào. Càc màng này lién két vói nhau trong mot khuón co ban chat hoà hoc gàn giò'ng keratohyaline [18]. Càc sgi nhò nói té bào (tonofilaments) là nhùng thành phàn quan trong nhà't cùa vùng lién két. Tonofilaments co duòng kfnii 10 nm, xuyén qua càc màng bào tuong, va chia ra tiiành càc tién sgi bàm vào càc tiéu thè protein nói màng. Càc tonofilaments là mot thành phàn cùa bó xuong té bào, là chat sùng cùa té' bào nguòi ta dành già rat cao già tri cùa gangliosit eó trén màng té bào. Nhfmg chat này tuong tu nhu photpholipit nò là mot ehuói ki nuóc, nhung phàn eó ciré thi dai va két thue boi axit neuramin, cài ma co mot nhóm eaeboxyl tir do. Cuc cuòi cùa phAn tu chùra N-axetyllactosamil, glaetosamil va diròng glucose [17]. Dién tieh bé màt Am tinh nguòi ta cho ràng eó lién quan dé'n nóng dò cùa doan cuòi axit neuramin. Sau khi hoà tan nhe vói neuraminidase dac biét thi axit neuramin tan ra tir té bào song va tinh (-) cùa bé mat giàm. Càc thành phÀn quan trong cùa gangliosit dóng vai trò trong vàn chuyén ion va trong màng chùra neuron. Ben canh viéc tao nén càc nhóm eaeboxyl ionogen trén bé mat té bào axit neuramin là thành phàn quan trong cùa mot sé khàng nguyén bé màt (vimt va khàng nguyén toxin). Nhung diéu dò chi ra ràng càc gangliosit là thành phàn cA'u trùc quan trong cùa màng té bào. e. Su biét hoà màng bào tuong va su két dinh. Càc té bào canh nhau cùa co thè dugc ngan eàch nhau boi nhung khoàng gian bào, giàn doan tùng quàng tuy theo càc kiéu phùe hgp lién két. Càc té bào dugc ràp lai vói nhau qua càc móng. Càc khoàng gian bào: Càc té bào khòng dfnh vói nhau trén suót chiéu dai cùa chùng. Trong biéu mó hình lang kmh don giàn thày eó nhung kè ho giua càc té bào, dò là càc khoàng gian bào. 0 dinh eó mot càu trùc ggi là khung té bào, co tàc diing ngàn khóng cho dich lién bào thoàt ra va khóng cho chat liéu bé mat biéu mó nhAp vào khoàng gian bào. Khoàng gian bào eó kieh lluróc tuong dói bang dinh. Càc té bào lién két dugc vói nhau là do mot chA't "kco" co chira càc protein (fibroneetin, elastin, collagen). Su eó màt cùa Mg'^ va Ca'' là cÀn thiét cho sir lién két giùa càc té bào [ 14]. 1.1.3. Siéu càu trùc cùa càc vùng lién két giira càc té bào. Càc té' bào dugc phàn eàch vói nhau bang mot khoàng gian bào hep hoàc ròng. Càc té' bào khóng dfnh vói nhau trén suót chiéu dai cùa chùng ma thà'y co nhùng kè ho giùa càc tè' bào, dò là càc khoàng gian bào. Khoàng gian bào co kfch thuóc tucmg dÓi hàng djnh [11]. Trong gian bào co djch khe vàn chuyè'n càc chà^t nuói duòng, càc chà't tié't va càc chat thài [15]. Tai mot sÓ vùng càc màng tè' bào dinh lai vói nhau. Càc vùng lién két này góm càc kiè'u lién két khàc nhau: (hình 2, 3, 4, 5a, 5b, 5c, 5d,5e ) - Càc lién két kiéu chat. - Càc lién két kiéu khe. - Càc lién két kiéu càu nói. - Càc lién két kiéu desmosom. a. Càc lién két kiéu chat. Dò là càc vùng chuyén biét cùa màng, tai dò càc là ngoài lién ké't vói nhau dén nói khòng con khoàng gian bào nùa, va nhu vày khòng con su van chuyén chat giùa càc té' bào. Lién két kiéu chat thuòng thà'y ó nhiéu mó, nói lién càc té' bào nói mó .Kiéu lién két chat này khòng con chó cho dich luu chuyén giùa càc té' bào. Vi vày viéc trao dói ó day là giùa hai té' bào, chù khòng phài là qua càc gian bào. Mòi màng té'bào thuóc lién két kiéu chat déu co chùa pròtéin dugc ggi là càc connexin [4] (càc chat nói )(hình 2). 10 [...]... thém càc axit amin khàc chàng han serin cho viéc phàt trién té bào don le [30] Vi vày càc axit amin khàc ngoài 10 axit amin khòng thè thay thè thuòng duge thém vào hàu hét càc mói triròng nuòi cày té bào [27] Vi càc té bào chi su dung càc dóng phàn L cùa càc axit amin, càc dóng phàn D co thè bi han che, nhìn 30 chung trong mói truòng nuói cày té bào chi chùa càc L axit amin Nhùng axit amin ma té bào khòng... 1.2.5 .Axit amin Trong tìiòi truòng nuói cà'y té bào, càc axit amin phài dugc thém vào mói triròng nuói cà'y té bào, chùng duge su dung cho viéc tóng hgp protein va axit nucleic (ADN va RNA) [26] Chùng cùng tham già vào qua trình vàn chuyén ion Bòi vi càc axit amin là luong tinh, phàn ùng nhu là axit va bazo Càc axit amin tu do eó thè dóng vai trò nhu là càc chat dém [25] Khi thié'u càc enzym, té bào. .. dò) [26] - Càc thành phàn ngoai té bào: "ào" khoàng gian bào cùa desmosom co chùa càc chat hoà hoc giÓng nJiU cùa "ào" 0 day "ào" trò nén dàm hon eó vai trò nhu xi màng gàn càc desmosom vói nhau [31] (hình 5e) Demosom Demosom PHUC HO? CÀC DlEM NOI GIUA HAI TE BÀO RUÒT Hình 5(e)- Lién két kiéu desmosom 18 1.1.4 Su phàn chia té bào Co hai loai té bào: té bào soma (dinh duong) va té bào sinh dite Té bào. .. Vói nhiét dò thàp thi boat dò cùa enzym giàm di Tai nhiét dò O^'C, boat dò cùa nhiéu enzym con 26 lai khóng dàng ké Khi tàng nhiét dò lén tbì boat tinh cùa enzym lai tàng theo vi enzym khóng bi bién tinh ò nhiét dò lanh Nguòi ta su diing dàc tinh này de bào quàn enzym Enzym thuòng dugc bào quan a OX hoàc nhiéu khi ò 20''C hoàc -30X hoac thàp han nua [2] Trong truòng hgp dùng trypsin de tàch té bào ti^... cho su phàt trién cùa té' bào Vi nò là nguón du trù tao ADN va protein trong té bào, khóng chi trong qua trình nuói cà'y ma ngay cà trong dung dich trypsin dùng tàch nhimg té bào riéng ré tu càc mó Viéc dua thém nhùng axit amin này cùng rà't càn thiét 31 Chirong 2 VAT LIÈU VÀ PHl/ONG PHÀP THlTC NGHIÈM 2.1 Vat lìeu 2.1.1 Trang thiét bi va dung cu can thiét - May do pH - Trùng gà da thu thai 9 ngày tuoi... dén mot mue dò nào dò thi phAn chia ra thành càc té bào mói [16] 1.2 Trypsin Trypsiiì là mot proteaza serin tuyén tuy vói net dac trung cùa chuói peptit lien quan dén nhóm eaeboxyl cùa càc axit amin ca bàn là arginin va lysin Trypsin tinh khiét mot minh thiròng kém hiéu qua trong viéc tàch té bào mó, vi no ehi ra tmh chon loc ft dÓi vói càc protein gian bào Trypsin khi co su két hgp vói chymotrypsin va... tié't vào long óng tiéu hoà Trypsinogen duge hoat hoà thành trypsin duói tàc diing cùa chuìh trypsin hoàc enterokinaza 7.2.2 llogt hoà trypsinogen Su phAn lAp tinh khiét trypsinogen va trypsin cùng nliu su nghién cuu dóng hoc cùa qua trinh hocit hoà trypsinogen thành trypsin dà dugc thirc hién long lai trong truòng phài cùa Northrop Trypsinogen tinh thè eó thè boat hoà bang ehmh trypsin va nhu vày vói... nhu té bào trong càc mó cùa ea thè da bào thuòng phAn chia theo kiéu nguyén phAn vói mot lÀn nhAn dói cùa phAn tu DNA va 4 kì phAn chia: kì dàu, kì giùa, kì sau va kì cuòi, lui nam 1858 Virchov dà dua ra dinh de nói tié'ng: * 'té bào sinh ra tu té bào eó tiiróe" [5] Tu té bào con mói dugc sinh ra bang con duòng trao dói chA't tang truòng kJió'i lugng té bào chat va nhàn dàp ùng càc boat dòng song Té bào. .. khi tàng nhiét dò lén 10''C, toc dò phàn ùmg sé tàng lén khoàng 2 làn Khi tàng nhiét dò lén dén khoàng 60 ^ 70^C tbì phàn lón càc enzym màt bàn boat tinh va nhiét dò dò duge goi là nhiét dò tói han [2] Mòi enzym déu eó mot nliiét dò thieh hgp nhà't cho sir boat dóng xùc tàc, ò nhiét dò dò phàn ihig enzym dat tói toc dò cao nhà't [24] Nói chung nhiét dò thieh hgp cùa enzym gàn vói nhiét dò cùa ea thè Tuy... tàch té bào ti^ mó hoàc té bào mot lóp, nhiét dò thieh hgp nhàt là 37''C - Ành huong cùa pH dÓi vói trypsin Enzym rà't nhay càm vói pH cùa mói tiiròng, do dò pH eó tàc dung rat lón tói toc dò cùa enzym MÓi enzym eó mot tri sÓ pH thieh hgp cho sir boat dóng cùa nò Ò pH dò, toc dò cùa phàn img enzym tòt nhàt, vói nhung tri sÓ lón han va nhò han tri so thieh hgp, toc dò phàn ùmg enzym giàm dàn Co rat nhiéu . bau thue vAt à dcing càc xoang róng eó thành bao quanh va dat tén là cella [4]. Antoni Van Leuvenhock (1674) v i kmh hién vi eó dò phóng dai 270X dà mó tà càc té bào dóng vAt va dà xàc . dò va pll dai v i trypsin 23 1.2.4. Nhoni hydroxyl cùa serin 28 7.2.5. Axit amin 30 CHUONG 2. V T LIÈU V PHUONG PHÀP THUC NGHIÈM 2.1. Vatlieu 32 2.7.7. Trang thiét bi va dung. cày virut vaexin va bÀng ky thuAt này Gey dà thu hoach dugc lugng virut lón han gA'p bòi. Cilng trong nhiTng nàm 50, Enders, Wella va Robbins thue hién nhiéu thf nghiém cày virut