Phân tích tính đa hình và mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;5 liên quan đến khả năng chịu mặn ở cây lúa (Oryza Sativa)

,d, ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -- Trần Xuân An PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN OsHKT1;5 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa) Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: H N i - 2018 TS ĐỖ THỊ PHÚC Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Thị Phúc, người thầy, người hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô công tác Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Trong q trình học tập nghiên cứu phịng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, nhận giúp đỡ chia sẻ tận tình chun mơn bạn, anh chị phịng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Cuối cùng, tơi vơ cảm ơn gia đình, đồng nghiệp Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội tất bạn bè động viên chia sẻ khó khăn tơi suốt thời gian qua Xin chân thành cảm ơn! Trần Xuân An Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ BẢNG CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt Bp Basepair Cặp bazơ cDNA Complementary DNA ADN bổ sung DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate Deoxyribonucleoside triphosphate dS/m deci Siemens per meter Deci Siemen mét EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit etilenediamin-tetraaxetic gDNA Genomic DNA ADN Hệ gen Gly Glycine Glyxin HKT High-Affinity K+ Transporter Kênh vận chuyển K+ lực cao mRNA Messenger RNA ARN thông tin Os Oryza sativa Lúa PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp ppm part per million Một phần nghìn Ser Serine Serin QLT quantitative trait loci Locus tính trạng số lượng TF Transcription factor Nhân tố phiên mã Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ MỤC LỤC CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Đất nhiễm mặn ảnh hƣởng đến suất trồng .3 1.1.1 Giới thiệu đất nhiễm mặn 1.1.2 Tình hình đất nhiễm mặn Việt Nam .3 1.1.3 Ảnh hƣởng mặn tới suất, chất lƣợng lúa 1.2 Cơ chế tác động đất nhiễm mặn đến trồng 1.3 Các họ protein vận chuyển ion Na+ trồng 1.3.1 Vai trò protein NHX SOS việc trì nồng độ Na+ thấp tế bào chất 1.3.2 Protein HKT đóng vai trị khả chịu mặn thực vật ngăn chặn Na+ vận chuyển từ rễ đến thân 10 1.4 Họ gen OsHKT lúa 12 1.5 Gen OsHKT1;5 14 1.6 Nghiên cứu đa hình sử dụng phƣơng pháp PCR kết hợp giải trình tự gen 16 1.6.1 Kĩ thuật PCR 16 1.6.2 Giải trình tự gen 17 1.6.3 Phân tích tin sinh học 19 1.7 Nghiên cứu biểu gen sử dụng phƣơng pháp Realtime-PCR 21 2.1 Đối tƣợng vật liệu nghiên cứu 24 2.2 Phƣơng pháp phân tích đa hình gen 25 2.2.1 Trồng thu mẫu .25 2.2.2 Tách chiết DNA tổng số 25 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ 2.2.3 Khuếch đại gen PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 26 2.2.4 Điện di gel Agarose 27 2.2.5 Tinh giải trình tự gen 28 2.2.6 Phân tích trình tự gen cơng cụ tin sinh 28 2.3 Phƣơng pháp phân tích mức độ biểu gen 28 2.3.1 Trồng lúa thủy cảnh thu mẫu 29 2.3.2 Tách chiết ARN tổng số 29 2.3.3 Tổng hợp cDNA dùng mồi oligo T 30 2.3.4 Phản ứng Realtime-PCR 30 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Phân tích đa hình gen OsHKT1.5 giống lúa 33 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số 33 3.1.2 Phản ứng PCR nhân trình tự promoter trình tự mã hóa gen OsHKT1.5 33 3.1.2.1 Thiết kế mồi 33 3.1.2.2 Nhân vùng Promoter gen OsHKT1.5 36 3.1.2.3 Nhân vùng CDS gen OsHKT1;5 36 3.1.3 Phân tích đa hình vùng promoter gen OsHKT1;5 37 3.2 Đánh giá mức độ biểu gen OsHKT1;5 đáp ứng điều kiện mặn 43 3.2.1 Tách chiết RNA tổng số từ mô .43 3.2.2 Thiết kế kiểm tra độ đặc hiệu mồi 44 Realtime-Actin 45 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ 3.2.3 Phân tích mức độ biểu gen OsHKT1;5 phƣơng pháp Realtime PCR 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 Kết luận 50 Kiến nghị .50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Phụ lục Kết phân tích yếu tố cis trình tự promoter (-1500kb tính từ mã khởi đầu ATG) giống Nipponbare công cụ PlantCARE 59 Trần Xn An Luận văn thạc sĩ DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các đƣờng điều hòa chống chịu stress mặn thực vật Hình 1.2 Hai phân họ họ gen HKT 10 Hình 1.3 Cấu trúc gen số thành viên họ gen lúa .13 Hình 1.4 Mơ hình gen AtHKT1;1 OsHKT1;5 tách Na+ khỏi cách loại bỏ Na+ khỏi xylem 14 Hình 1.5 Các giai đoạn phản ứng PCR 16 Hình 1.6 Sơ đồ giải trình tự gen theo phƣơng pháp Sanger 18 Hình 1.7 Sơ đồ giải trình tự gen theo phƣơng pháp giải trình tự tự động .19 Hình 1.8.Biểu đồ khuếch đại Realtime-PCR .22 Hình 3.1 Kết điện di DNA tổng số tách từ giống lúa nghiên cứu .33 Hình 3.2 Sơ đồ cấu trúc gen đoạn sản phẩm PCR .34 Hình 3.3 Kiểm tra độ đặc hiệu các cặp mồi sử đụng để nhân Promoter CDS gen OsHKT1;5 35 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR vùng promoter gen OsHKT1;5 .36 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR vùng CDS gen OsHKT1;5 37 Hình 3.6 Kết so sánh trình tự axit amin Protein OsHKT1;5 41 Hình 3.7 Kết mô cấu trúc protein OsHKT1;5 (A Mô hình cấu trúc protein TrkH; B C Mơ hình cấu trúc protein OsHKT1;5 vị trí đột biến làm thay đổi axit amin) .42 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm tách chiết RNA tổng số giống lúa Pokkali 44 Hình 3.9 Kết kiểm tra độ đặc hiệu các mồi sử dụng để xác định độ biểu gen OsHKT1;5 45 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ Hình 3.10 Biểu gen OsHKT1;5 giống lúa Nipponbare Pokkali 46 Hình 3.11 Biểu gen OsHKT1;5 rễ giống lúa Nipponbare Pokkali 47 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Khả chịu mặn số loại trồng Bảng 1.2 Các thành viên họ gen HKT lúa [39] 13 Bảng 2.1 Một số giống lúa sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gene 26 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gene .27 Bảng 2.4 Thành phần quy trình tổng hợp cDNA .30 Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng nhân vùng promoter CDS gene OsHKT1;5 34 Bảng 3.2 Sơ đồ kết so sánh trình tự nucleotide thay đổi yếu tố cis promoter gen OsHKT1;5 38 Bảng 3.3 Các yếu tố Cis thay đổi đa hình promoter gen OsHKT1;5 39 Bảng 3.4 Sơ đồ kết so sánh trình tự nucleotide CDS gen OsHKT1;5 40 Bảng 3.5 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng Realtime-PCR 44 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ MỞ ĐẦU Hiện nay, tác động biến đổi khí hậu, vấn đề đất nhiễm mặn ngày trầm trọng hơn, đặc biệt khu vực ven biển Đất nhiễm mặn gây ảnh hưởng xấu tới sinh trưởng phát triển nhiều loại trồng Lúa lương thực chủ yếu quan trọng người dân Việt Nam Lúa loài trồng mẫn cảm với tác động đến từ bên (điều kiện ngoại cảnh) Hàng năm, thiệt hại lương thực thiên tai, ngoại cảnh bất lợi không nhỏ Đây xem yếu tố làm giảm suất lúa Do vậy, việc lựa chọn chọn tạo giống lúa thích nghi với điều kiện mặn cần thiết để đảm bảo an ninh lương thực quốc gia, tăng trưởng kinh tế Việt Nam Từ lâu, việc lựa chọn lúa có suất cao dựa vào đặc điểm hình thái cây, việc lựa chọn lúa có kiểu gen chống chịu với ngoại cảnh bất lợi ngày quan tâm nghiên cứu Cùng với phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học, kỹ thuật sinh học phân tử ngày ứng dụng nhiều vào việc sàng lọc, lai tạo, nhân dòng gen có tính chống chịu cao Để tạo giống trồng chịu mặn việc nghiên cứu gene quy định tính trạng chống chịu mặn quạn trọng, đặc biệt gene mã hóa cho kênh vận chuyển ion Na+, K+ họ gene HKT Trong đó, gene OsHKT1;5 gene quan trọng tham gia vào trình cân ion tế bào trình chống chịu mặn lúa Hiện nay, chưa có nghiên cứu gen OsHKT1;5 lúa tiến hành Việt Nam Vì lý chúng tơi lựa chọn đề tài: “Phân tích tính đa hình v mức đ biểu gen OsHKT1;5 mã hóa cho protein vận chuyển ion lúa (Oryza sativa)” với mục đích: Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Nhân giải trình tự thành cơng promoter OsHKT1;5 14 giống lúa CDS gen OsHKT1;5 16 giống lúa  Phát 25 sai khác nucleotide so sánh trình tự giống lúa, vị trí sai khác dự đoán làm thay đổi yếu tố Cis CAAT-box, TATA-box, có khả có ảnh hưởng đến chức gen Các sai khác giống kháng Pokkali so với giống nhiễm Nipponbare làm thay đổi yêu tố Cis CAAT-box TATA-box  Phát 12 sai khác nucleotide so sánh trình tự giống lúa, có vị trí sai khác làm ảnh hưởng đến trình tự axit amin Các sai khác giống kháng Pokkali so với giống nhiễm Nipponbare làm thay đổi axit amin: P140A, H184R, D332H V395L Thay đổi V395L nằm gần vị trí trung tâm lọc protein OsHKT1;5 có khả ảnh hưởng đến độ bền vững khả chọn lọc phân tử Na+; Thay đổi A140P có mối liên hệ đáng kể với nồng độ Na+ thân, thay Proline gây thay đổi xương sống protein - Biểu gen OsHKT1;5 giảm xuống giống Nipponbare lại tăng lên giống Pokkali; Biểu gen OsHKT1;5 rễ tăng với giống Nipponbare, tăng với giống Pokkali nồng độ mặn cao (100mM) Kiến nghị Đánh giá tính chịu mặn khác giống lúa từ đánh giá mối liên hệ đa hình vùng promoter làm thay đổi yếu tố Cis đa hình vùng CDS làm thay đổi trình tự axit amin gen OsHKT1;5 với khả chịu mặn 50 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Tổng cục Thống kê (2017), Báo cáo số 152/BC-TCTK ngày 28/6/2017, Hà Nội Hồ Quang Đức (2010), Đất phèn đất mặn Việt Nam, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Tiếng Anh Alexey Larionov, Andreas Krause, and William Miller, (2005), “A standard curve based method for relative real time PCR data processing”, BMC Bioinformatics, 6: pp 62 Apse MP, Aharon GS, Snedden WA and Blumwald E., (1999), “Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+ antiport in Arabidopsis”, Science, 285, pp 1256–1258 Barragán V, Leidi EO, Andrés Z, Rubio L, De Luca A, Fernández JA, Cubero B and Pardo JM., (2012), “Ion exchangers NHX1 and NHX2 mediate active potassium uptake into vacuoles to regulate cell turgor and stomatal function in Arabidopsis”, Plant Cell, 24, pp 1127–1142 Bassil E, Ohto MA, Esumi T, Tajima H, Zhu Z, Cagnac O, Belmonte M, Peleg Z, Yamaguchi T and Blumwald E., (2011), “The Arabidopsis intracellular Na+/H+ antiporters NHX5 and NHX6 are endosome associated and necessary for plant growth and development”, Plant Cell, 23, pp.224–239 Becker J., Vos P., Kuiper M., Salamini F and Heun M., (1995), “Combined mapping of AFLP and RFLP markers in barley” Molecular and General Genetics, 249, pp.65-73 Byrt, C.S., Platten, J.D., Spielmeyer, W., James, R.A., Lagudah, E.S., Dennis, E.S., Tester, M and Munns, R (2007), “HKT1;5-like cation transporters linked to Na+ exclusion loci in wheat, Nax2 and Kna1”, Plant Physiol 143, pp.1918–192 Cao Y, Jin X, Huang H, Derebe MG, Levin EJ., (2011), “Crystal structure of a potassium ion transporter, TrkH”, Nature 471: pp 336–340 51 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ 10 Cotsaftis Olivier, Darren Plett, Neil Shirley, Mark Tester, Maria Hrmova, (2012), “A two-staged model of Na+ exclusion in rice explained by 3D modeling of HKT transporters and alternative splicing”, PLoS One 7:e39865 11 Cui MH, Yoo KS, Hyoung S, Nguyen HT, Kim YY, Kim HJ, Ok SH, Yoo SD and Shin JS., (2013), “An Arabidopsis R2R3-MYB transcription factor, AtMYB20, negatively regulates type 2C serine/threonine protein phosphatases to enhance salt tolerance” FEBS Lett ; 587, pp.1773–1778 12 Dai Yin Chao, Yong Hai Luo, Min Shi, Da Luo and Hong Xuan Lin, (2005), “Saltresponsive genes in rice revealed by cDNA microarray analysis” Cell Research 15, pp 796-810 13 Deepak SA, KR Kottapalli, R Rakwal, G Oros, KS Rangappa, H Iwahashi, Y Masuo, and GK Agrawal, (2007), “Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes”, Curr Genomics 8(4): pp.234–251 14 Dinneny JR, Long TA, Wang JY, Jung JW, Mace D, Pointer S, Barron C, Brady SM, Schiefelbein J and Benfey PN., (2008), “Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress”, Science 320: pp 942–945 15 Do Thi Phuc, Nguyen Van Minh and Hoang Hai Yen (2016), “Assessment of Natural Variation in OsHKT1;2 Gene in Rice (Oryza sativa)”, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 32, No 1S (2016) pp 189-193 16 Duan L, Dietrich D, Ng CH, Chan PM, Bhalerao R, Bennett MJ and Dinneny JR., (2013), “Endodermal ABA signaling promotes lateral root quiescence during salt stress in Arabidopsis seedlings”.Plant Cell 25: pp.324–341 17 Frederique Ponchel, Carmel Toomes, Kieran Bransfield, Fong T Leong, Susan H Douglas, Sarah L Field, Sandra M Bell, Valerie Combaret, Alain Puisieux, Alan J Mighell, Philip A Robinson, Chris F Inglehearn, John D Isaacs, and Alex F Markham, (2003), “Real-time PCR based on SYBR-Green I fluorescence: An alternative to the TaqMan assay for a relative quantification of gene rearrangements, gene amplifications and micro gene deletions”, BMC Biotechnol 3: pp 18 52 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ 18 Galvan-Ampudia CS, Julkowska MM, Darwish E, Gandullo J, Korver RA, Brunoud G, Haring MA, Munnik T, Vernoux T and Testerink C., (2013), “Halotropism is a response of plant roots to avoid a saline environment”, Current Biology 23:pp.2044–2050 19 Garciadeblás B, Senn ME, Buelos MA and Rodríguez-Navarro A., (2003), “Sodium transport and HKT transporters: the rice model”, The Plant Journal, 34, pp.788-801 20 Garciadeblás B, Senn ME, Buelos MA and Rodríguez-Navarro A., (2003), “Sodium transport and HKT transporters: the rice model”, Plant J 34, pp 788– 801 21 Geng Y, Wu R, Wee CW, Xie F, Wei X, Chan PM, Tham C, Duan L and Dinneny JR., (2013), “A spatio-temporal understanding of growth regulation during the salt stress response inArabidopsis” Plant Cell 25: pp 2132–2154 22 Golldack D, Lüking I and Yang O., (2011), “Plant tolerance to drought and salinity: stress regulating transcription factors and their functional significance in the cellular transcriptional network”.Plant Cell Rep.30:pp.1383–1391 23 Henderson SW, Dunlevy JD, Wu Y, Blackmore DH, Walker RR, Edwards EJ, Gilliham M, Walker AR., (2018), “Functional differences in transport properties of natural HKT1;1 variants influence shoot Na+ exclusion in grapevine rootstocks”, New Phytol ;217(3): pp 1113-1127 24 Horie T, Hauser F and Schroeder JI (2009), ”HKT transporter-mediated salinity resistance mechanisms in Arabidopsis and monocot crop plants”, Trends Plant Sci 14: pp 660–668 25 Huang S, Spielmeyer W, Lagudah ES, James RA, Platten JD, Dennis ES and Munns R (2006) “A sodium transporter (HKT7) is a candidate for Nax1, a gene for salt tolerance in durum wheat” Plant Physiol 142: pp.1718–1727 26 Ismail, A.M and Horie, T (2017) “Genomics, physiology, and molecular breeding approaches for improving salt tolerance” Annu Rev Plant Biol 27 James, R.A., Davenport, R.J and Munns, R., (2006), “Physiological characterization of two genes for Na+ exclusion in durum wheat, Nax1 and Nax2”, Plant Physiol 142, pp.1537–1547 53 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ 28 Jiang C, Belfield EJ, Cao Y, Smith JA and Harberd NP., (2013), “An Arabidopsis soil-salinity-tolerance mutation confers ethylene-mediated enhancement of sodium/potassium homeostasis”.Plant Cell 25: pp.3535–3352 29 Jiang C, Belfield EJ, Mithani A, Visscher A, Ragoussis J, Mott R, Smith JA and Harberd NP., (2012) “ROS-mediated vascular homeostatic control of root-toshoot soil Na delivery in Arabidopsis” EMBO J 31: pp 4359–4370 30 Jiang Y and Deyholos MK., (2009), “Functional characterization of Arabidopsis NaCl-inducible WRKY25 andWRKY33 transcription factors in abiotic stresses”, Plant Mol, Biol 69: pp 91–105 31 Jiang Y, Yang B and Deyholos MK., (2009), “Functional characterization of the Arabidopsis bHLH92 transcription factor in abiotic stress”, Mol Genet Genomics 282: pp.503–516 32 Karley A.J.,Leigh R.A.&Sanders D., (2000), “Differential ion accumulation and ion fluxes in the mesophyll and epidermis of barley”.Plant Physiology122, pp.835-844 33 Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K., (1999), “Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor”, Nat Biotechnol 17: pp 287–291 34 Mãser, P., Hosoo Y, Goshima S, Horie T, Eckelman B, Yamada K, Yoshida K, Bakker EP, Shinmyo A, Oiki S, Schroeder JI and Uozumi N., (2002), “Glycine residues in potassium channel-like selectivity filters determine potassium selectivity in four-loop-persubunit HKT transporters from plants”, Proc Natl Acad Science, pp 6428–6433 35 Michael W Pfaffl, Ales Tichopad, Christian Prgomet & Tanja P Neuvians P, (2004), “Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper – Excel-based tool using pair-wise correlations”, Biotechnology Letters 26: pp 509–515 36 Mount, David W., (2002), "Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis" Spring Harbor Press, May ISBN 0-87969-608-7 37 Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H (1986), “Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction”, Cold Spring Harb Sym 51, 263–273 54 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ 38 Munns, R.; Tester, M (2008), “Mechanisms of salinity tolerance” Annu Rev Plant Biol 59, pp 651-681 39 Nguyen Tien Dat and Do Thi Phuc (2016), “Study on Polymorphisms of OsHKT2;4 Gene in some Vietnamese Rice”, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, Vol 32, No 1S (2016) pp.184-188 40 Olías R1, Eljakaoui Z, Li J, De Morales PA, Marín-Manzano MC, Pardo JM, Belver A, (2009 ), “The plasma membrane Na+/H+ antiporter SOS1 is essential for salt tolerance in tomato and affects the partitioning of Na+ between plant organs”, Plant Cell Environ Jul;32(7): pp 904-16 41 Pandey N, Alok Ranjan, Poonam Pant, Rajiv K Tripathi, Farha Ateek, Haushilla P Pandey, Uday V Patre, and Samir V Sawant, (2013), “CAMTA regulates drought responses in Arabidopsis thaliana” BMC Genomics 14, pp 216 42 PhamQuynh-Hoa, TranXuan-An, NguyenThi-Nha-Trang, TranThi-Thuy-Anh, HoangHai-Yen, NguyenThi-Hong-Van, TangThi-Hanh and DoThi-Phuc (2016) “Investigation of polymorphisms in the coding region of OsHKT1 gene in relation to salinity in rice”, Rice Science Volume 23, Issue 6, November 2016, pp 334-338 43 Platten, J.D.; Cotsaftis, O.; Berthomieu, P.; Bohnert, H.; Davenport, R.J.; Fairbairn, D.J.; Horie, T.; Leigh, R.A.; Lin, H.X.; Luan, S., (2006), “Nomenclature for HKT transporters, key determinants of plant salinity tolerance”, Trends Plant Sci., 11, pp.372–374 44 Plett, D.C.; Møller, I.S., (2010), “Na+ transport in glycophytic plants: What we know and would like to know”, Plant Cell Environ 33, pp.612-626 45 Qi and Spalding, (2004), “Protection of plasma membrane K+ transport by the salt overly sensitive1 Na+-H+ antiporter during salinity stress”, Plant Physiol Nov;136(3):pp.3849 46 R Durbin, S Eddy, A Krogh and G Mitchison, (1998),“Biological sequence analysis Cambridge University Press”, ISBN 0-521-62971-3 47 Ren Z.-H., Ji-Ping Gao, Le-Gong Li, Xiu-Ling Cai, Wei Huang, Dai-Yin Chao, Mei-Zhen Zhu, Zong-Yang Wang, Sheng Luan and Hong-Xuan Lin, (2005), “A 55 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter”, Nature Genetics 37: pp.1141-1146 48 Rengasamy, P., (2006), “World salinization with emphasis on Australia”, J Exp Bot 57, pp.1017-1023 49 Rodríguez-Rosales M P., Gálvez F J., Huertas R., Aranda M N., Baghour M., Cagnac O., & Venema K., (2009), "Plant NHX cation/proton antiporters" Plant Signaling & Behavior, 4(4), pp.265–276 50 Rubio F, Gassmann W and Schroeder JI., (1995), “Sodium-driven potassium uptake by the plant potassium transporter HKT1 and mutations conferring salt tolerance” Science 270: pp.1660-1663 51 Rubio F, Gassmann W, Schroeder JI (1995), “Sodium-driven potassium uptake by the plant potassium transporter HKT1 and mutations conferring salt tolerance” Science, 270:1660–1663 52 Sanger F., S Nicklen, and A R Coulson, (1977), “DNA sequencing with chainterminating inhibitors”, Proc Natl Acad Sci U S A 74(12): pp.5463–5467 51 53 Schachtman D.P., and Munns R (1992) “Sodium accumulation in leaves of triticum species that differ in salt tolerance” Australian Journal of Plant Physiology 19:pp.331-340 54 Schachtman DP, Schroeder JI., ( 1994), “Structure and transport mechanism of a high-affinity potassium uptake transporter from higher plants”, Nature 370:pp.655–658 55 Shane Waters, Matthew Gilliham and Maria Hrmova (2013), “Plant High-Affinity Potassium (HKT) Transporters Involved in Salinity Tolerance: Structural Insights to Probe Differences in Ion Selectivity” Int J Mol Sci 14, pp.76607680 56 Shefali Mishra, Balwant Singh, Kabita Panda, Bikram Pratap Singh, Nisha Singh, Pragati Misra, Vandna Rai, and Nagendra Kumar Singh (2016), “Association of SNP Haplotypes of HKT Family Genes with Salt Tolerance in Indian Wild Rice Germplasm“, Rice 9:pp.1 56 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ 57 Shkolnik-Inbar D, Adler G and Bar-Zvi D., (2013) “ABI4 downregulates expression of the sodium transporter HKT1;1 in Arabidopsis roots and affects salt tolerance” Plant J 73:993–1005 58 Sunarpi, Horie T, Motoda J, Kubo M, Yang H, Yoda K, Horie R, Chan WY, Leung HY, Hattori K, Konomi M, Osumi M, Yamagami M, Schroeder JI and Uozumi N., (2005) “Enhanced salt tolerance mediated by AtHKT1 transporter- induced Na unloading from xylem vessels to xylem parenchyma cells”, Plant J 2005 :pp.928–938 59 Sundstrom, Joanna Faye (2011), Role and control of HKT in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana, Thesis (Ph.D) University of Adelaide, School of Agriculture, Food and Wine, 2011 60 Tester, M and Davenport, R., (2003), “Na+ tolerance and Na+ transport in higher plants” Ann Bot (Lond.) 91, 503-527 61 Thomson, M.J., Ocampo, M., Egdane, J., (2010), “Characterizing the Saltol quantitative trait locus for salinity tolerance in rice”, Rice, 3, pp.148–160 56 62 Tran LS, Nakashima K, Sakuma Y, Simpson SD, Fujita Y, Maruyama K, Fujita M, Seki M, Shinozaki K and Yamaguchi-Shinozaki K., (2004),“Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress promoter”, Plant Cell ;16:pp.2481–2498 63 Tuteja N., (2007), "Mechanisms of High Salinity Tolerance in Plants", In Methods in Enzymology, Elsevier, Vol 428, pp 419–438 64 Ulrich D., Aaron B.S., Tomoaki H., Wei L., Guohua X and Julian L.S, (2014), “Plant salt-tolerance mechanisms”, Plant Science, 19, pp.371-379 65 Venema K., Quintero F J., Pardo J M., & Donaire J P (2002) "The arabidopsis Na+/H+ exchanger AtNHX1 catalyzes low affinity Na+ and K+ transport in reconstituted liposomes" The Journal of Biological Chemistry, 277(4), pp.2413– 2418 66 Villalta I, Reina-Sánchez A, Bolarín MC, Cuartero J, Belver A, Venema K, Carbonell EA and Asins MJ., (2008), “Genetic analysis of Na+ and K+ 57 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ concentrations in leaf and stem as physiological components of salt tolerance in Tomato”, Theor Appl Genet.; 116:pp.869–880 67 Weng H, Yoo CY, Gosney MJ, Hasegawa PM and Mickelbart MV.,(2012), “Poplar GTL1 is a Ca2+ /calmodulin-binding transcription factor that functions in plant water use efficiency and drought tolerance” PLoS One 7:e32925 68 Xiayu Rao, Xuelin Huang, Zhicheng Zhou, and Xin Lin (2013),“An improvement of the 2ˆ(–delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis”, Biostat Bioinforma Biomath 3(3): pp.71–85 69 Yang O, Popova OV, Süthoff U, Lüking I, Dietz KJ, Golldack D, (2009), “The Arabidopsis basic leucine zipper transcription factor AtbZIP24 regulates complex transcriptional networks involved in abiotic stress resistance”.Gene 436:pp.45–55 70 Yoo JH, Park CY, Kim JC, Heo WD, Cheong MS, Park HC, Kim MC, Moon BC, Choi MS, Kang YH, Lee JH, Kim HS, Lee SM, Yoon HW, Lim CO, Yun DJ, Lee SY, Chung WS and Cho MJ., (2005), “Direct interaction of a divergent CaM isoform and the transcription factor, MYB2, enhances salt tolerance in Arabidopsis”, J Biol Chem 280: pp.3697–3706 71 Yuan HJ, Ma Q, Wu GQ, Wang P, Hu J and Wang SM., (2015), “ZxNHX controls Na⁺ and K⁺ homeostasis at the whole-plant level in Zygophyllum xanthoxylum through feedback regulation of the expression of genes involved in their transport”, Ann Bot 2015 Feb;115(3):495-507 72 Zhang H-X, Blumwald E., (2001), “Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit”, Nature Biotechnol.; 19:765–768 Trang web 73 74 http://www.fao.org https://ncbi.nlm.nih.gov 58 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ Phụ lục Kết phân tích yếu tố cis trình tự promoter (-1500kb tính từ mã khởi đầu ATG) giống Nipponbare công cụ PlantCARE Site Name AACA_mot if AC-II ATCTmotif Box Organism Position Strand Matrix score Sequence function + 13 CAACAAACTATATC involved in endosperm-specific negative expression - (C/T)T(T/C)(C/T)(A/C)(A/C)C(A/C)A(A/C)C( C/A)(C/A)C - AATCTAATCC part of a conserved DNA module involved in light responsiveness + ATTAAT part of a conserved DNA module involved in light responsiveness - ATTAAT part of a conserved DNA module involved in light responsiveness + TTTCAAA light responsive element + gGCAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions + CAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions - CCAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions + CAAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions - CAATT common cis-acting element in promoter and enhancer regions - CAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions - TGCCAAC common cis-acting element in promoter and enhancer regions -124 Oryza sativa Phaseolus vulgaris -1086 -357 Pisum sativum Petroselinum crispum Petroselinum crispum -998 -493 -1305 Box I Pisum sativum CAAT-box Arabidopsis thaliana CAAT-box Hordeum vulgare CAAT-box Arabidopsis thaliana CAAT-box Brassica rapa CAAT-box Glycine max -1399 -1397 -1347 -1337 -1298 -1297 CAAT-box Hordeum vulgare CAAT-box Petunia hybrida -1193 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ -987 CAAT-box Brassica rapa CAAT-box Arabidopsis thaliana CAAT-box Brassica rapa CAAT-box Glycine max + CAAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions - CCAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions + CAAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions - CAATT common cis-acting element in promoter and enhancer regions - CAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions + CAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions - gGCAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions + CAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions - CAATT common cis-acting element in promoter and enhancer regions - CCAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions - CCAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions - CAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions - CAAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions + CAAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions + CAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions - CAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions + CAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions -974 -695 -693 -692 CAAT-box Hordeum vulgare CAAT-box Hordeum vulgare CAAT-box Arabidopsis thaliana CAAT-box Hordeum vulgare CAAT-box Glycine max CAAT-box Arabidopsis thaliana CAAT-box Arabidopsis thaliana -583 -533 -509 -490 -489 -425 -345 CAAT-box Hordeum vulgare -317 CAAT-box Brassica rapa CAAT-box Brassica rapa -299 -253 CAAT-box Hordeum vulgare CAAT-box Hordeum vulgare CAAT-box Hordeum vulgare -236 -223 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ -117 CAAT-box CGTCAmotif CGTCAmotif ERE GAREmotif GT1-motif MBS Hordeum vulgare + CAAT common cis-acting element in promoter and enhancer regions + CGTCA cis-acting regulatory element involved in the MeJAresponsiveness - CGTCA cis-acting regulatory element involved in the MeJAresponsiveness + ATTTCAAA ethylene-responsive element + TCTGTTG gibberellin-responsive element - GGTTAA light responsive element - CAACTG MYB binding site involved in drought-inducibility - GTGCCC(A/T)(A/T) light responsive element + GTGCCC(A/T)(A/T) light responsive element - GATGACATGA cis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulation - GATGATATGG cis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulation + GATGATATGG cis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulation + GTCAT cis-acting regulatory element required for endosperm expression + GGGCGG light responsive elemen - ATATAT core promoter element around -30 of transcription start - TATA core promoter element around -30 of transcription start + tcTATAAAta core promoter element around -30 of transcription start + ATATAAT core promoter element around -30 of transcription start -1172 Hordeum vulgare -380 Hordeum vulgare Dianthus caryophyllus -1306 -112 Brassica oleracea Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana -935 -414 -973 MNF1 Zea mays -265 MNF1 Zea mays -1108 O2-site Zea mays -594 O2-site Zea mays O2-site Skn1_motif Zea mays Oryza sativa Sp1 Oryza sativa -799 -1104 -808 -403 TATA-box TATA-box TATA-box Brassica napus Arabidopsis thaliana Nicotiana tabacum -402 -336 -287 TATA-box Brassica oleracea Trần Xuân An TATA-box Luận văn thạc sĩ Arabidopsis thaliana -286 - TATA core promoter element around -30 of transcription start + TAATA core promoter element around -30 of transcription start - ATATAT core promoter element around -30 of transcription start - TATA core promoter element around -30 of transcription start - ATATAT core promoter element around -30 of transcription start - TATA core promoter element around -30 of transcription start + TATAAA core promoter element around -30 of transcription start - TTTTA core promoter element around -30 of transcription start - TATA core promoter element around -30 of transcription start - TATACA core promoter element around -30 of transcription start + TATAAAT core promoter element around -30 of transcription start + ccTATAAAaa core promoter element around -30 of transcription start + TATAAA core promoter element around -30 of transcription start - TATCCCA cis-acting element involved in gibberellin-responsiveness - GTTTTCTTAC cis-acting element involved in defense and stress responsiveness - TGACG cis-acting regulatory element involved in the MeJAresponsiveness + TGACG cis-acting regulatory element involved in the MeJAresponsiveness -284 TATA-box Glycine max -282 TATA-box TATA-box Brassica napus Arabidopsis thaliana -281 -280 TATA-box TATA-box TATA-box TATA-box TATA-box TATA-box Brassica napus Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Lycopersicon esculentum Arabidopsis thaliana Helianthus annuus -279 -208 -206 -194 -101 -99 TATA-box TATA-box TATA-box Ac Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana -69 -67 -843 TATC-box TC-rich repeats TGACGmotif TGACGmotif Oryza sativa Nicotiana tabacum -53 -1172 Hordeum vulgare -380 Hordeum vulgare Trần Xuân An TGG-motif TGGCAmotif box S box S circadian circadian Luận văn thạc sĩ Helianthus annuus Triticum aestivum Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Lycopersicon esculentum Lycopersicon esculentum -487 + TGGTGGCTA part of a light responsive element - 12 TGCACCAATGGCA part of a light responsive element - AGCCACC - AGCCACC - CAANNNNATC cis-acting regulatory element involved in circadian control - CAANNNNATC cis-acting regulatory element involved in circadian control -264 -486 -422 -388 -351 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ