Phân tích tính đa hình và mức độ biểu hiện của gen OsHKT15 liên quan đến khả năng chịu mặn ở cây lúa (oryza sativa)

,d, ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -- Trần Xuân An PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN OsHKT1;5 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa) Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ THỊ PHÚC H N i - 2018 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Thị Phúc, người thầy, người hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô công tác Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Trong q trình học tập nghiên cứu phịng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, nhận giúp đỡ chia sẻ tận tình chun mơn bạn, anh chị phịng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Cuối cùng, tơi vơ cảm ơn gia đình, đồng nghiệp Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội tất bạn bè động viên chia sẻ khó khăn tơi suốt thời gian qua Xin chân thành cảm ơn! Trần Xuân An Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ BẢNG CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT Viết tắt Bp cDNA DNA dNTP dS/m EDTA gDNA Gly HKT mRNA Os PCR ppm Ser QLT TF Trần Xuân An MỤC LỤC CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Đất nhiễm mặn ảnh hƣởng đến suất trồng 1.1.1 Giới thiệu đất nhiễm mặn 1.1.2 Tình hình đất nhiễm mặn Việt Nam 1.1.3 Ảnh hƣởng mặn tới suất, chất lƣợng lúa 1.2.Cơ chế tác động đất nhiễm mặn đến trồng + 1.3 Các họ protein vận chuyển ion Na trồng 1.3.1 Vai trò protein NHX SOS việc trì nồng độ Na+ thấp tế bào chất 1.3.2 Protein HKT đóng vai trị khả chịu mặn thực vật ngăn chặn Na+ vận chuyển từ rễ đến thân 1.4.Họ gen OsHKT lúa 1.5.Gen OsHKT1;5 1.6.Nghiên cứu đa hình sử dụng phƣơng pháp PCR kết hợ 1.6.1 Kĩ thuật PCR 1.6.2 Giải trình tự gen 1.6.3 Phân tích tin sinh học 1.7.Nghiên cứu biểu gen sử dụng phƣơng pháp R 2.1.Đối tƣợng vật liệu nghiên cứu 2.2.Phƣơng pháp phân tích đa hình gen 2.2.1 Trồng thu mẫu 2.2.2 Tách chiết DNA tổng số Trần Xuân An 2.2.3 Khuếch đại gen PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 2.2.4 Điện di gel Agarose 2.2.5 Tinh giải trình tự gen 2.2.6 Phân tích trình tự gen cơng cụ tin sinh 2.3 Phƣơng pháp phân tích mức độ biểu gen 2.3.1 Trồng lúa thủy cảnh thu mẫu 2.3.2 Tách chiết ARN tổng số 2.3.3 Tổng hợp cDNA dùng mồi oligo T 2.3.4 Phản ứng Realtime-PCR CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân tích đa hình gen OsHKT1.5 giống lúa 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số 3.1.2 Phản ứng PCR nhân trình tự promoter trình tự mã hóa gen OsHKT1.5 3.1.2.1 Thiết kế mồi 3.1.2.2 Nhân vùng Promoter gen OsHKT1.5 3.1.2.3 Nhân vùng CDS gen OsHKT1;5 3.1.3 Phân tích đa hình vùng promoter gen OsHKT1;5 3.2 Đánh giá mức độ biểu gen OsHKT1;5 đáp ứng điều kiện mặn 3.2.1 Tách chiết RNA tổng số từ mô 3.2.2 Thiết kế kiểm tra độ đặc hiệu mồi Realtime-Actin Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ 3.2.3 Phân tích mức độ biểu gen OsHKT1;5 phƣơng pháp Realtime PCR 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 Kết luận 50 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Phụ lục Kết phân tích yếu tố cis trình tự promoter (-1500kb tính từ mã khởi đầu ATG) giống Nipponbare công cụ PlantCARE .59 Trần Xn An DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các đƣờng điều hòa chống chịu stress mặn thực vật Hình 1.2 Hai phân họ họ gen HKT Hình 1.3 Cấu trúc gen số thành viên họ gen lúa Hình 1.4 Mơ hình gen AtHKT1;1 OsHKT1;5 tách Na+ khỏi cách loại bỏ Na+ khỏi xylem Hình 1.5 Các giai đoạn phản ứng PCR Hình 1.6 Sơ đồ giải trình tự gen theo phƣơng pháp Sanger Hình 1.7 Sơ đồ giải trình tự gen theo phƣơng pháp giải trình tự tự động Hình 1.8.Biểu đồ khuếch đại Realtime-PCR Hình 3.1 Kết điện di DNA tổng số tách từ giống lúa nghiên cứu Hình 3.2 Sơ đồ cấu trúc gen đoạn sản phẩm PCR Hình 3.3 Kiểm tra độ đặc hiệu các cặp mồi sử đụng để nhân Promoter CDS gen OsHKT1;5 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR vùng promoter gen OsHKT1;5 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR vùng CDS gen OsHKT1;5 Hình 3.6 Kết so sánh trình tự axit amin Protein OsHKT1;5 Hình 3.7 Kết mơ cấu trúc protein OsHKT1;5 (A Mơ hình cấu trúc protein TrkH; B C Mơ hình cấu trúc protein OsHKT1;5 vị trí đột biến làm thay đổi axit amin) Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm tách chiết RNA tổng số giống lúa Pokkali Hình 3.9 Kết kiểm tra độ đặc hiệu các mồi sử dụng để xác định độ biểu gen OsHKT1;5 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ Hình 3.10 Biểu gen OsHKT1;5 giống lúa Nipponbare Pokkali 46 Hình 3.11 Biểu gen OsHKT1;5 rễ giống lúa Nipponbare Pokkali 47 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Khả chịu mặn số loại trồng Bảng 1.2 Các thành viên họ gen HKT lúa [39] 13 Bảng 2.1 Một số giống lúa sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gene 26 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gene 27 Bảng 2.4 Thành phần quy trình tổng hợp cDNA .30 Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng nhân vùng promoter CDS gene OsHKT1;5 34 Bảng 3.2 Sơ đồ kết so sánh trình tự nucleotide thay đổi yếu tố cis promoter gen OsHKT1;5 38 Bảng 3.3 Các yếu tố Cis thay đổi đa hình promoter gen OsHKT1;5 39 Bảng 3.4 Sơ đồ kết so sánh trình tự nucleotide CDS gen OsHKT1;5 40 Bảng 3.5 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng Realtime-PCR 44 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ concentrations in leaf and stem as physiological components of salt tolerance in Tomato”, Theor Appl Genet.; 116:pp.869–880 67 Weng H, Yoo CY, Gosney MJ, Hasegawa PM and Mickelbart MV.,(2012), “Poplar 2+ GTL1 is a Ca /calmodulin-binding transcription factor that functions in plant water use efficiency and drought tolerance” PLoS One 7:e32925 68 Xiayu Rao, Xuelin Huang, Zhicheng Zhou, and Xin Lin (2013),“An improvement of the 2ˆ(–delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis”, Biostat Bioinforma Biomath 3(3): pp.71–85 69 Yang O, Popova OV, Süthoff U, Lüking I, Dietz KJ, Golldack D, (2009), “The Arabidopsis basic leucine zipper transcription factor AtbZIP24 regulates complex transcriptional networks involved in abiotic stress resistance”.Gene 436:pp.45–55 70 Yoo JH, Park CY, Kim JC, Heo WD, Cheong MS, Park HC, Kim MC, Moon BC, Choi MS, Kang YH, Lee JH, Kim HS, Lee SM, Yoon HW, Lim CO, Yun DJ, Lee SY, Chung WS and Cho MJ., (2005), “Direct interaction of a divergent CaM isoform and the transcription factor, MYB2, enhances salt tolerance in Arabidopsis”, J Biol Chem 280: pp.3697–3706 71 Yuan HJ, Ma Q, Wu GQ, Wang P, Hu J and Wang SM., (2015), “ZxNHX controls Na⁺ and K⁺ homeostasis at the whole-plant level in Zygophyllum xanthoxylum through feedback regulation of the expression of genes involved in their transport”, Ann Bot 2015 Feb;115(3):495-507 72 Zhang H-X, Blumwald E., (2001), “Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit”, Nature Biotechnol.; 19:765–768 Trang web 73 74 http://www.fao.org https://ncbi.nlm.nih.gov 58 Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ Phụ lục Kết phân tích yếu tố cis trình tự promoter (-1500kb tính từ mã khởi đầu ATG) giống Nipponbare công cụ PlantCARE CAAT-box Site Name AACA_mot if AC-II ATCTmotif Box Box I CAAT-box CAAT-box CAAT-box CAAT-box CAAT-box CAAT-box Organism Position Strand -124 + -1086 -357 -998 + -493 -1305 + -1399 + -1397 + -1347 -1337 + -1298 -1297 -1193 - Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ CAAT-box Brassica rapa CAAT-box Arabidopsis thaliana CAAT-box Brassica rapa CAAT-box Glycine max CAAT-box Hordeum vulgare CAAT-box Hordeum vulgare CAAT-box Arabidopsis thaliana CAAT-box Hordeum vulgare CAAT-box Glycine max CAAT-box Arabidopsis thaliana CAAT-box Arabidopsis thaliana CAAT-box Hordeum vulgare CAAT-box Brassica rapa CAAT-box Brassica rapa CAAT-box Hordeum vulgare CAAT-box Hordeum vulgare CAAT-box Hordeum vulgare -987 + -974 -695 + -693 -692 -583 + -533 -509 + -490 -489 -425 -345 -317 -299 + -253 + -236 -223 + Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ -117 CAAT-box CGTCAmotif CGTCAmotif ERE GAREmotif Hordeum vulgare + Hordeum vulgare -1172 + Hordeum vulgare Dianthus caryophyllus -380 - Brassica oleracea -1306 + GT1-motif Arabidopsis thaliana -112 MBS Arabidopsis thaliana -935 MNF1 Zea mays -414 MNF1 Zea mays O2-site Zea mays O2-site Zea mays O2-site Skn1_motif Zea mays Oryza sativa Sp1 Oryza sativa + -973 -265 + -1108 -594 -799 + -1104 + -808 + -403 TATA-box TATA-box Brassica napus TATA-box Arabidopsis thaliana Nicotiana tabacum TATA-box Brassica oleracea + ATATAAT core promoter element around -30 of transcription start Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ TATA-box Arabidopsis thaliana TATA-box Glycine max TATA-box Brassica napus TATA-box Arabidopsis thaliana TATA-box Brassica napus TATA-box Arabidopsis thaliana TATA-box Arabidopsis thaliana TATA-box Lycopersicon esculentum TATA-box Arabidopsis thaliana TATA-box Helianthus annuus TATA-box Ac TATA-box Arabidopsis thaliana TATA-box Arabidopsis thaliana TATC-box TC-rich repeats TGACGmotif TGACGmotif Oryza sativa Nicotiana tabacum Hordeum vulgare Hordeum vulgare -286 -284 + -282 -281 -280 -279 -208 + -206 -194 -101 -99 + -69 + -67 + -843 -53 -1172 -380 + Trần Xuân An TGG-motif TGGCAmotif box S box S circadian circadian Luận văn thạc sĩ Helianthus annuus + Triticum aestivum - Arabidopsis thaliana - Arabidopsis thaliana - Lycopersicon esculentum - Lycopersicon esculentum - Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ ... điều hịa biểu gen ảnh hưởng đến mức độ chống chịu stress mặn thực vật (Hình 1.1) Khi có stress mặn, gen liên quan đến trình đáp ứng biểu mức cao gen liên quan đến hấp thu ion vô cơ, gen Trần... ? ?Phân tích tính đa hình v mức đ biểu gen OsHKT1;5 mã hóa cho protein vận chuyển ion lúa (Oryza sativa)? ?? với mục đích: Trần Xuân An Luận văn thạc sĩ - Phân tích đa hình gen OsHKT1;5 số giống lúa. .. sinh trưởng bảo vệ quan quan trọng tích lũy ion gây độc già yếu [12] Khả chịu mặn nhiều thực vật tỷ lệ nghịch với mức độ tích lũy Na+ thân, đặc biệt lương thực lúa mì gạo, có khả chịu mặn [60]