Thử nghiệm phân lập và tạo dòng nguyên bào sợi từ mô phôi thai người

MỤC LỤC GIỚI THIỆU VỀ ĐỀ TÀI 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .4

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

EGFD

TIỀN VĂN SẾN

THỬ NGHIỆM PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG NGUYÊN BÀO SỢI

TỪ MÔ PHÔI THAI NGƯỜI

KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC – Y DƯỢC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS BS TRẦN CÔNG TOẠI BS NHAN NGỌC HIỀN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 7/2004

MỤC LỤC GIỚI THIỆU VỀ ĐỀ TÀI

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 LƯỢC SỬ NUÔI CẤY TẾ BÀO .5

2 LƯỢC SỬ NUÔI CẤY NGUYÊN BÀO SỢI 6

2.1 Ở VIỆT NAM : 6

2.2 SƠ LƯỢC VỀ KINH NGHIỆM NUÔI CẤY NGUYÊN BÀO SỢI TRÊN THẾ GIỚI 6

3 CÁC NGUỒN MÔ DÙNG ĐỂ NUÔI CẤY NGUYÊN BÀO SỢI .12

3.1 Ở GIAI ĐOẠN PHÔI THAI .12

3.2 Ở GIAI ĐOẠN SAU SINH 12

3.3 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI – TÍNH CHẤT CHỨC NĂNG CỦA NGUYÊN BÀO SỢI .13

3.3.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA NGUYÊN BÀO SỢI 13

3.3.2 CHỨC NĂNG CỦA NGUYÊN BÀO SỢI 14

3.3.3 KHẢ NĂNG BIỆT HÓA VÀ TÁI BIỆT HÓA CỦA NGUYÊN BÀO SỢI 15

3.3.4 NGUYÊN BÀO SỢI – ĐẦU MỐI TẠO RA MỠ, SẸO VÀ SỰ VIÊM .17

3.3.5 KHẢ NĂNG GÓP PHẦN SỬA CHỬA VẾT THƯƠNG, TÁI TẠO MÔ BỊ TỔN THƯƠNG CỦA NGUYÊN BÀO 19

3.3.6 NGUYÊN BÀO SỢI - SẢN XUẤT NHÂN TỐ TĂNG TRƯỞNG, CẢM ỨNG BIỆT HÓA 23

3.3.7 NGUYÊN BÀO SỢI - CHỨC NĂNG TIẾP LIỆU, CHẾ TIẾT COLLAGENE, LÀM GIÁ THỂ THU NHẬN TẾ BÀO MẦM 24

3.4 SỰ LIÊN HỆ GIỮA NGUYÊN BÀO SỢI VÀ TẾ BÀO TRUNG MÔ .25

4 TRỨNG LÀM TỔ BÌNH THƯỜNG 26

5 TRỨNG LÀM TỔ BẤT THƯỜNG (LẠC CHỖ) 27

6 CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY SƠ CẤP 29

7 PHƯƠNG PHÁP CẤY CHUYỀN – TẠO DÒNG, THU NHẬN VÀ LƯU TRỮ DÒNG TẾ BÀO MỤC TIÊU 30

7.1 CẤY CHUYỀN TẾ BÀO 30

7.2 TẠO VÀ THU NHẬN DÒNG TẾ BÀO MỤC TIÊU TRÊN MÔI TRƯỜNG THẠCH BẰNG VÒNG RINGS .31

7.3 BẢO QUẢN TẾ BÀO 32

7.4 HOẠT HÓA TẾ BÀO 32

8 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY 32

8.1 MÔI TRƯỜNG VÀ CÁC YẾU TỐ BỔ SUNG 32

8.2 YẾU TỐ BỀ MĂT CỦA CHAI NUÔI - GIÁ THỂ 33

8.3 YẾU TỐ VẬT LÝ .34

8.3 1 ÁP SUẤT THẨM THẤU 34

8.3 2 NHIỆT ĐỘ 34

8.3.3 TÍNH NHỚT 35

8.3 4 ÁP LỰC SỨC CĂNG BỀ MẶT VÀ SỰ TẠO BỌT 35

8.4 YẾU TỐ HÓA HỌC .35

8.4.1 OXYGEN .35

8.4.2 CO2 36

8.4.3 PH 36

8.4.4 DUNG DỊCH ĐỆM 37

8.5 MÔI TRƯỜNG TỦ NUÔI 37

9 TỈ LỆ MÔI TRƯỜNG VỚI MẬT ĐỘ TẾ BÀO ĐEM NUÔI, LƯỢNG MÔ ĐEM CẤY 38

10 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 38

10.1 MÔI TRƯỜNG 38

10.2 MỘT VÀI LOẠI MÔI TRƯỜNG THƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO VÀ MÔ ĐỘNG VẬT 39

11 TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA NGUYÊN BÀO SỢI .41

CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 43

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43

2.1 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 43

2.2 CÁC MỤC TIÊU CẦN KHẢO SÁT 43

3 TRÌNH TỰ THÍ NGHIỆM 44

4 CÁC QUI TRÌNH CHÍNH ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM 45

4.1 VÔ TRÙNG DỤNG CỤ HÓA CHẤT 45

4.2 VÔ TRÙNG NƠI TẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 45

4.3 CÁC QUY TRÌNH CHUNG XỬ LÝ MẪU THÍ NGHIỆM 46

4.4 CÁC QUY TRÌNH CỤ THỂ CHO NUÔI CẤY (CÁC PROTOCOLS) 48

4.5 TIÊU CHUẨN CHỌN MẪU MÔ THÍ NGHIỆM 54

4.6 TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ CHỌN NGUỒN MÔ MỤC TIÊU 55

4.7 TIÊU CHUẨN LOẠI TRỪ MẪU MÔ THÍ NGHIỆM 55 4.8 TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP,

MÔI TRƯỜNG ĐỂ LOẠI TRỪ 56

4.9 CÁC YẾU TỐ CẦN NGHIÊN CỨU .56

4.10 SỐ LẦN THÍ NGHIỆM .57

4.11 KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP THU THẬP SỐ LIỆU .57

4.12 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU .57

5 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU .58

1.1 KẾT QUẢ NUỐI CẤY SƠ CẤP .63

1.2 KẾT QUẢ NUÔI CẤY THỨ CẤP – CẤY CHUYỀN 65

1.3 HÌNH ẢNH GHI NHẬN ĐƯỢC TRONG CÁC ĐỢT NUÔI CẤY 66

2 SỐ LIỆU VÀ HÌNH ẢNH GHI NHẬN ĐƯỢC SAU KHI CẤY CHUYỀN 68

2.1 BẢNG SỐ LIỆU, VÀ HÌNH ẢNH (NGÀY 14/6) 68

2.2 BẢNG SỐ LIỆU, VÀ HÌNH ẢNH (NGÀY 15/6) 69

2.3 BẢNG SỐ LIỆU, VÀ HÌNH ẢNH (NGÀY 16/6) 71

2.4 BẢNG SỐ LIỆU, VÀ HÌNH ẢNH (NGÀY 17/6) 72

2.5 BẢNG SỐ LIỆU, VÀ HÌNH ẢNH (NGÀY 18/6) 74

2.6 BẢNG SỐ LIỆU, VÀ HÌNH ẢNH (NGÀY 21/6) 75

II BÀN LUẬN 76

1 SO SÁNH BẢNG SỐ LIỆU TRÊN CÙNG MÔI TRƯỜNG 76

2 SO SÁNH BẢNG SỐ LIỆU GIỬA CÁC MÔI TRƯỜNG .79

3 NHỮNG ĐIỂM KHÁC BIỆT CỦA CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỠNG ĐẾN KẾT QUẢ NUÔI 81

4 LÝ DO LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP VÀ KẾT LUẬN MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU TRONG BA MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG 82

5 CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ẢNH HƯỞNG ĐẾN KẾT

Section 1.01 QUẢ TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM 85

6 NHỮNG THUẬN LỢI TRONG

TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM 86 7 SO SÁNH HÌNH DẠNG CÁC LOẠI TẾ BÀO

DẠNG NGUYÊN BÀO SỢI 87

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

I KẾT LUẬN .93 II KIẾN NGHỊ 94

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ khi có con người tồn tại, cho đến khi con người nhận thức được sự tồn tại của mình là loài duy nhất, được ban tặng khả năng tư duy sáng tạo vô tận trong số các loài cùng tồn trong tự nhiên và sự tồn tại của mỗi người là duy nhất và là thiêng liêng Mỗi người sẽ không được lặp lại sự tồn tại của mình lần thứ hai trong tiến trình lịch sử Và do đó, bệnh tật-chết chóc và thiên tai là thứ đáng kinh hãi trong suốt quá trình tồn tại của loài người từ thời sơ khai đến nay cũng như trong cuộc đời của mỗi người Theo xu hướng chung, lúc nào con người cũng muốn tư duy, khám phá, và chinh phục thiên nhiên Ngay cả những hiện tượng sinh lý tự nhiên diễn ra trong chính bản thân con người của mình Các hiện tượng và vạn vật xung quanh đều trở thành đối tượng vô tận để con người tư duy Con người không ngừng lao động sáng tạo, từ đời này sang đời khác Kết quả đáp lại cho những công lao lao động ngàn đời đó là một nền khoa học tiên tiến và hiện đại

Ngày nay, con người có một cuộc sống tiện nghi, có khả năng chế ngự được thiên tai Với nền khoa học tiên tiến, hiện đại, con người có thể sản xuất hàng loạt công cụ để cải tạo thiên nhiên, sản xuất được lượng dư thừa các sản phẩm phục vụ cho tiện ích Trong thời đại thông tin điện tử, Công nghệ Thông Tin giúp những con người cách xa nhau hàng vạn dặm có thể liên lạc và nhìn thấy nhau

Dù có tài ba đến đâu, dù là bất cứ ai cũng đều chịu chung số phận là: tuân theo qui luật sinh lý chung (sinh, lão, bệnh, tử) Và đó là chân lý về sự tồn tại của con người trên trái đất này, điều đó cũng như trái đất đã thể hiện sự tồn tại của nó trong thái dương hệ này là phải quay xung quanh mặt trời theo một quỹ đạo nhất định và có chu kỳ Nhưng có lẽ giới hạn của chân lý về sự tồn tại của mỗi người có giới hạn đó có nguy cơ bị sụp đổ khi mà Di Truyền Học đã có thể can thiệp đến tận cùng nguồn gốc của sự sống

Một khi Công Nghệ Sinh Học có bước đột phá, phát triển vượt bậc, có thể tạo ra cơ quan thay thế, có thể sử dụng liệu pháp gen để chửa bệnh, có thể sử dụng liệu pháp di truyền để cải thiện tuổi thọ của con người, thì lúc đó, bệnh tật và chết chóc có lẽ, sắp sửa, sẽ không còn là nỗi kinh hoàng của bao người, bao thế hệ Nhiều người, nhiều nhà khoa học trên thế giới đang kỳ vọng về những sự tốt đẹp đó Mỗi người trong chúng ta có lẽ đều đang trong trạng thái hoài nghi, bàng hoàng và lo lắng đến những điều may rủi, nhưng ít nhiều gì cũng đều sẽ mong đợi điều đó xảy ra

Theo xu hướng phát triển tri thức chung của thế giới, Công Nghệ Sinh HọÏc là ngành khoa học phát triển kế tục ngành Công Nghệ Thông Tin , để có thể phát triển mạnh mẽ thì ngành Công Nghệ Sinh HọÏc phải nhờ vào sự hỗ trợ đắc lực của ngành Công Nghệ Thông Tin Trong khi giới hạn và đỉnh cao của Công Nghệ Thông Tin không ngừng được tiệm cận thì Công Nghệ Sinh HọÏc đang chập chững bước đi

Nhiều nước trên thế giới như: Mỹ, Pháp, Bỉ, … đã có bề dầy kinh nghiệm nghiên cứu và đầu tư cho Công Nghệ Sinh HọÏc trên nửa thế kỷ nay Sử dụng công nghệ nuôi cấy tế bào động vật cũng như nuôi cấy tế bào người để phục vụ cho y học, sản xuất dược phẩm (insulin, interferon, …) và thử thuốc Các nghiên cứu nuôi cấy nguyên bào sợi người đã được thực hiện thành công tại các nước như Mỹ, Pháp, Bỉ qua nuôi cấy tế bào nước ối, nuôi cấy tế bào da, gai

nhau, mô thai sẩy [Beechm Group Ltd, GB1525022]

Mọi thứ phải bắt đầu từ cái sơ khai nhất, từ không biết cho tới biết, từ không có cho tới có, từ không thể cho đến có thể, nhất là đối với ngành khoa học ngiên cứu cơ bản như: nuôi cấy tế bào động vật Nuôi cấy tế bào người hầu như chưa có thành tựu đáng kể ở Việt Nam

Tế bào nguyên bào sợi người là loại tế bào dễ dàng nuôi cấy nhất so với các loại tế bào khác cùng loài Vả lại, nó có tiềm năng ứng dụng vô cùng phong phú, như:

+ Là loại tế bào tiềm năng, kém biệt hóa, có thể biệt hóa thành tế bào xương, ứng dụng trong trong sản xuất vật liệu cấy ghép

+Sử dụng để nghiên cứu di truyền, sản xuất vacxin,… +Sử dụng để thu nhận tế bào mầm

Vì những lý do đó, nguyên bào sợi người được chọn làm đối tượng nghiên cứu

Tuy nhiên, gần đây, nhờ vào việc áp dụng qui trình nghiên cứu của nước ngoài, ở Việt Nam mới bước đầu thành công trong nuôi cấy, tế bào máu ngoại vi, tế bào ối…, nhưng những nghiên cứu về chuẩn hóa qui trình nuôi cấy, phân lập và tạo dòng tế bào người vẫn chưa có nơi nào thực hiện nghiên cứu thành công.(Ở Việt Nam)

Bắt nguồn từ những lý do đó, chúng tôi lao vào tập nghiên cứu: Phương pháp nuôi cấy, phân lập và tạo dòng Nguyên Bào Sợi từ phôi thai người Thực hiện đề tài này nhằm đạt được các mục tiêu sau:

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

2 1 MỤC TIÊU TỔNG QUÁT

Nghiên cứu nuôi cấy tế bào Nguyên Bào Sợi từ phôi thai người Thử nghiệm nuôi cấy, phân lập và tạo dòng nguyên bào sợi người từ phôi thai ngoài lấy từ bệnh viện phụ sản Từ Dũ

2.2 MỤC TIÊU CHUYÊN BIỆT:

1./ Xây dựng qui trình nuôi cấy Nguyên Bào Sợi người từ phôi thai 2 Đánh giá hiệu quả nuôi cấy Nguyên bào sợi người trên ba môi trường: AMNIOMAX, EMEM, DMEM

3./ Xác định những yếu tố liên quan đến quá trình nuôi cấy: biện pháp vô trùng, liều lượng môi trường…

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 LƯỢC SỬ NUÔI CẤY TẾ BÀO [15] * Giới thiệu chung về nuôi cấy

Nuôi cấy mô được thực hiện vào đầu thế kỷ 20 (Harrison 1907, Carrel

1912) như là một phương pháp để nghiên cứu về đặc tính của tế bào động vật

một cách độc lập khỏi những biến đổi của hệ thống có thể xảy ra trong các thí nghiệm ở điều kiện bình thường cũng như có xuất hiện stress Cũng như tên gọi, kỹ thuật này đầu tiên được thực hiện với các mẫu mô, và tốc độ tăng sinh của chúng cha SSSäm Bởi vì nuôi cấy những tế bào lúc mới bắt đầu là như vậy và

đây cũng là lãnh vực chủ yếu trong hơn 50 năm, tên gọi «nuôi cấy mô» vẫn được

dùng mặc dù lĩnh vực này đã được mở rộng từ thập niên 1950 khi sử dụng những tế bào nuôi cấy tách rời

Harrison đã chọn ếch là nguồn mô đầu tiên để nuôi cấy bởi vì nó là

động vật biến nhiệt, và do đó không cần phải nuôi ủ Hơn nữa, sự tái tạo mô thì phổ biến ở những động vật có xương sống bậc thấp, ông hi vọng rằng sự phát triển của chúng sẽ dễ dàng hơn là với mô động vật có vú Kỹ thuật của ông đã

gây nên một làn sóng chú ý về nuôi cấy mô in vitro, vài người thực hiện sau đã

theo ví dụ của ông để lựa chọn đối tượng Sự thúc đẩy của y học buộc người ta quan tâm đến các loài động vật ổn nhiệt có quá trình phát triển bình thường và bệnh lý gần giống với con người Ban đầu phôi gà được sử dụng nhiều nhưng sau đó loài gặm nhấm dễ nuôi và thuần nhất về mặt di truyền đã được chọn làm đối tượng nghiên cứu Trong khi phôi gà có thể cho nhiều dạng tế bào trong nuôi cấy sơ cấp, mô gặm nhấm thuận lợi trong việc tạo ra các dòng tế bào liên tục

Từ sự xác định rằng những khối u của người có thể tạo nên dòng tế bào liên tục (như Hela được Gey và cộng sự thiết lập năm 1952), khuyến khích

sự chú ý về mô của người, sau đó vào năm 1961, Hayflick và Moorhead thực

hiện những nghiên cứu về những tế bào bình thường có đời sống xác định

Sự phát triển của nuôi cấy mô như là một kỹ thuật tinh vi hiện đại nhờ vào sự cần thiết của hai nhánh chính nghiện cứu về y học: tạo vaccin kháng virus và nghiên cứu về ung thư Sự tiêu chuẩn hóa các điều kiện và các dòng tế bào để sản xuất và thí nghiệm virus rõ ràng đã thúc đẩy sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô hiện đại, cụ thể là tạo ra một lượng lớn tế bào phù hợp cho các phân tích sinh hóa Cùng với sự phát triển của những kỹ thuật khác đã tạo nên những sản phẩm môi trường và huyết thanh đáng tin cậy được thương mại hóa, và kiểm soát tốt hơn về ngoại nhiễm với các kháng sinh và thiết bị làm sạch không khí, làm nuôi cấy mô có thể được quan tâm rộng rãi

2 LƯỢC SỬ NUÔI CẤY NGUYÊN BÀO SỢI 2 1 Ở Việt Nam :

Ở nước ta nói chung công việc nuôi cấy tế bào động vật còn khá mới mẽ, nhất là nuôi cấy tế bào ở người vẫn còn sơ khai

Ở bệnh viện phụ sản Từ Dũ, Phòng Di Truyền Học đã và đang thực

hiện thành công việc nuôi cấy nguyên bào sợi trên môi trường

AMNIOMAX-TC100 từ nước ối: 15-16 tuần [15], thực hiện dịch vụ chẩn đoán di truyền trước

sinh [Phòng Di Truyền, bệnh viện phụ sản Từ Dũ]

Ở Trường Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Phòng Sinh Lý Động Vật, đang trên tiến trình nuôi cấy nguyên bào sợi từ da người bị bỏng

2.2 Sơ lược về kinh nghiệm nuôi cấy nguyên bào sợi trên thế giới [15]

Ngoài môi trường dinh dưỡng cơ bản, nhu cầu chính yếu của tế bào dạng nguyên bào sợi cũng như nguyên bào sợi là cần giá bám để mọc lan ra, những tế bào này có tính linh động yếu và tính độc lập khi mật độ tế bào còn thấp Để hiện diện được, nó cũng như những tế bào biểu mô cần có sự cảm ứng trực tiếp giữa tế bào với tế bào mới có thể sống sót và phát triển được tối ưu để tạo thành cụm tế bào

Ba nhóm protein chuyển biến màng chính yếu được thể hiện liên quan đến tính cảm ứng giữa tế bào với tế bào, giữa tế bào với giá thể:

+ Phân tử cảm ứng gắn bám giữa tế bào với tế bào là: CAMs (độc

lập với Ca2+); và cadherins (phụ thuộc vào Ca2+) – nó thể hiện tương tác cơ bản giữa các tế bào đồng loại Tính tự cảm ứng như: những phân tử giống nhau thì

mọc đối ứng tương tác lẫn nhau Điều này được phát hiện bởi: Edelman, 1986,

1988; bởi Rosenman và Gallatin, 1991

+ Mối tương tác giữa tế bào và giá thể trong môi trường nuôi cấy được thể hiện qua đoạn đính gắn (integrins)của tế bào, thụ thể của tế bào gắn bám với những phân tử chất nền như là: fibronectin, laminin, collagen, những sợi này sẽ liên kết với các tế bào tạo ra đường nối rõ ràng đặc hiệu, thường chứa đựng trong những sợi này gồm có: RGD (arginine, glycine, aspartic acid) Điều

này được phát hiện bởi: Yamada, 1991 Mỗi đoạn đính (integrins) gồm có: tiểu

đơn vị α và tiểu đơn vị β Cả hai sợi này đều có tính đa dạng cao, được sinh ra nhiều đáng kể, tạo ra sự đa dang giữa các đoạn đính gắn (integrins)

+ Nhóm thứ ba của phân tử gắn bám tế bào là: sự chuyển biến những proteoglycans màng, cũng dựa trên sự tương tác giữa các thành tố chất nền với nhau, như là: tương tác với những proteoglycans khác hoặc callogen

Nhưng không gắn đặc hiệu với sợi RGD (arginine, glycine, aspartic acid)

Có một số sự kiện chuyển biến proteoglycans màng có chức năng hoạt động như là: cơ quan thụ cảm nhân tố tăng trưởng với ái lực yếu Điều này được

phát hiện bởi: Klagsbrun và Baird, 1991

Sự kiện không kết tụ của mô có nghĩa là: thể hiện một sự gắn bám thành lớp đơn trong nuôi cấy Do trong quá trình tăng sinh có sự hiện diện của protease tiêu hủy một số chất nền ngoại bào, và thậm chí có lẽ làm suy thoái sự chuyển biến protein màng, mà protein màng đó sẽ cảm ứng với chất nền ngoại bào Khi đó, nó sẽ cho phép các tế bào tách biệt thành mỗi cái riêng rẽ

Những tế bào ngoại bì và nội bì thường đề kháng với sự không kết tụ hơn, có nghĩa là: chúng có khuynh hướng mọc chồng chéo lên nhau, tạo ra dạng tế bào phức hợp; hoặc chèn lấp lẫn nhau thành đám

Trong khi những tế bào trung mô thì phụ thuộc vào sự tương tác với chất nền hơn là sự liên kết gian bào Vì lý do đó, nên dễ dàng mọc tách riêng biệt ra thành lớp đơn Chính vì lý do này, mà tế bào phải tái tổng hợp protein chất nền trước khi chúng gắn bám; hoặc là phải được cung cấp một giá thể có chất nền được lót bọc sợi liên kết

Trong nuôi cấy sơ cấp, quan sát những tế bào lớp đơn, Hence đã lập ra

sự liên hệ giữa tỉ lệ mật độ và sự chuyển đổi của tế bào, liên quan đến cách sử dụng chất nền để bám:

Trong nuôi cấy lớp đơn, nếu tế bào còn môi trường sử dụng và giá thể để bám, thì chúng sẽ không khép kín sự tiếp xúc với những tế bào khác

Trong trường hợp nuôi cấy lớp đơn, khi môi trường và không gian nuôi cấy đã hết, nếu ủ để lâu hơn vài giờ thì những bước chọn lọc khuynh hướng phát triển khác nhau sẽ xảy ra:

+ Những tế bào mà nó dễ dàng nhận cảm với giới hạn, mật độ phát triển thì sẽ ngừng phân chia

+Trong khi đó, bất cứ những tế bào nào mà nó bị chuyển dạng thì sẽ không nhận cảm được giới hạn mật độ phát triển Chúng sẽ có khuynh hướng phát triển vượt bậc, phát triển quá qiới hạn

+Khi giữ mật độ tế bào ở mức độ thấp, bằng cách tạo ra sự cấy truyền thường xuyên, sẽ giúp ích cho việc giữ ổn định kiểu hình bình thường của tế bào trong môi trường nuôi cấy, như là trường hợp nuôi nguyên bào sợi chuột nếu cấy truyền thường xuyên giúp không rơi vào trạng thái dễ dàng chuyển dạng Khi mà mật độ tế bào ở mức độ quá cao thì tại thời điểm đó, ở nơi đó, sự chuyển dạng tự phát sẽ làm cho tế bào có khuynh hướng phát triển quá giới hạn

[Torado và Green, 1963]

Một vài diễn biến chức năng chuyên biệt được biểu hiện rõ ràng trong nuôi cấy sơ cấp , đặc điểm này thể hiện khi nuôi cấy trở nên nhập dòng (các dòng tế bào khác nhau hòa hợp cùng phát triển trên cùng môi trường nuôi cấy) Ở giai đoạn này, nuôi cấy sẽ thể hiện trạng thái khép kín dày đặc nhất và vẫn còn tình trạng đa dang về thể loại tế bào

Sau lần đầu tiên cấy truyền, nuôi cấy nguyên phát trở nên - được biết gần như là một dòng tế bào, và có lẽ sẽ được nhân lên sau vài lần cấy truyền nữa

Và sau mỗi lần cấy truyền thành công, thành phần của quần thể, sẽ có khả năng tăng sinh mạnh mẽ hơn Hầu như nhanh hơn và tăng dần đến một mức độ tối ưu nào đó, và rồi không tăng sinh nữa; hoặc các tế bào tăng sinh chậm chạp lại trong trường hợp này mật độ tế bào sẽ bị làm loãng ra và thưa đi Và điều này là sự kiện nổi bật nhất sau lần đầu tiên cấy truyền Ở những vùng khác nhau sẽ cho khả năng tăng sinh khác nhau Và xu hướng là: những tế bào bị tổn thương bởi trypsin sẽ có khuynh hướng chuyển dạng tế bào

Mặc dù vậy, một sự chọn lọc dòng về kiểu hình và kiểu gen tiếp tục được thực hiện trong môi trường nuôi Bởi lẽ, sau cấy truyền lần thứ ba, chỉ các

loại tế bào điển hình có khả năng chịu đựng cao thì mới tăng sinh nhanh chóng và mạnh mẽ

Trong trường hợp có sự hiện diện của huyết thanh mà không có điều kiện chọn lọc chuyên biệt, thì những tế bào thuộc trung mô được dẫn xuất từ mô liên kết như: nguyên bào sợi và những nhân tố thuộc mạch máu thường phát triển mạnh mẽ, tăng lên quá mức trong môi trường nuôi cấy Từ những nghiên cứu này đã đưa ra một số dòng tế bào rất hữu dụng như là:

+ W138: Nguyên bào sợi từ phổi phôi người.[15]

+ BHK21: Nguyên bào sợi chuột đồng con.[15]

Phần lớn các dòng tế báo có thể nhân lên không làm thay đổi hiện trạng của tế bào, do có sự giới hạn số lượng thế hệ của tế bào Bên cạnh đó, chúng có thể chết hoặc nhân lên thành dòng tế bào liên tục Khả năng một dòng nào đó phát triển thành dòng tế bào liên tục có thể phản ánh khả năng biến đổi di truyền của nó Qua đó cho phép ta chọn lọc dòng tế bào theo trình tự cấy truyền nối tiếp nhau

Nguyên bào sợi người duy trì số lượng thể bội chỉnh áp đảo, đánh giá thông qua tuổi đời nuôi cấy của chúng và không bao giờ cho ra dòng tế bào liên tục [15]

Trong khi đó, nguyên bào sợi của chuột và những tế bào nuôi cấy từ những mô bướu của người và những động vật khác thì thường cho ra thể bội không chỉnh; và song song điều đó, cho ra dòng tế bào liên tục trong nuôi cấy với tần số hoàn toàn cao Sự biến đổi trong nuôi cấy và cho ra dòng tế bào liên

tục phổ biến gọi là: “ sự chuyển dạng trong nuôi cấy thí nghiệm (in vitro

transformation)”

Có nhiều loại tế bào không cho ra dòng tế bào liên tục Trong số những loại tế bào này có nguyên bào sợi người; là loại tế bào, bình thường, duy trì thể bội chỉnh trong suốt tuổi đời thế hệ (thường khoảng 50 thế hệ) Khi hết

tuổi đời, tế bào nguyên bào sợi người sẽ ngừng phân chia, gọi là thời điểm biến động Mặc dù vậy chúng vẫn có khả năng duy trì sự tồn tại khoảng 18 tháng sau đó, trong trường hợp được cung cấp đủ chất dinh dưỡng

Bảng 1: Các dòng tế bào nguyên bào sợi

Tên Hình thái Nguồn gốc Tuổi đời Mô Mức bội thể Tính chất Tham khảo từ Dòng tế bào xác định

MRCS Nguyên bào sợi Phổi người Phôi thai Bình thường Lưỡng bội thể

Mẫn cảm với sự nhiễm virút ở người

[Jacobs,1970]

MRC9 Nguyên bào sợi Phổi người Phôi thai Bình thường Lưỡng bội thể

Mẫn cảm với sự nhiễm virút ở người

[Jacobs,1979]

WI138 Nguyên bào sợi Phổi người Phôi thai Bình thường Lưỡng bội thể

Mẫn cảm với sự nhiễm virút ở người

[Hayflick và Moorhead, 1961]

IMR90 Nguyên bào sợi Phổi người Phôi thai Bình thường Lưỡng bội thể

Mẫn cảm với sự nhiễm virút ở người

[Nichols và cộng sự, 1977] Dòng tế Tế bào liên tục

A9 Nguyên bào sợi Dưới da chuột Trưởng thành Ung thư Thể bội lẽ Dẫn xuất từ L929 [Littlefield, 1964] BHK21,

C13 Nguyên bào sợi

Thận chuột

syrian Mới sinh

Bình thường

Chuyển dạng bởi virút polyoma

[Macpherson và Stoker, 1962]

CHOK1 Nguyên bào sợi

Buồng trứng chuột đồng trung quốc

Trưởng thành

Bình

thường Lưỡng bội thể

Kiểu nhân đơn giản

[Puck và cộng sự, 1958]

STO Nguyên bào sợi Chuột Phôi thai Bình

thường Thể bội lẽ

Sử dụng làm lớp đơn để thu nhận tế bào gốc phôi

[Bernstein,1975]

LS Nguyên bào sợi Chuột Trưởng

thành Ung thư Thể bội lẽ

Phát triển trong dịch huyền phù, dẫn xuất từ L929

[Paul và Struthers]

S180 Nguyên bào sợi Chuột Trưởng

thành Ung thư Thể bội lẽ

Làm màng sàn lọc trong hóa trị liệu ung thư

[Dunham và Stewart,1953]

ST3-L1 Nguyên bào sợi Chuột Thụy Sĩ Phôi tha Bình thường Thể bội lẽ

Biệt hóa thành tế bào mỡ

[Green và Kehinde,1974]

3T3 A31 Nguyên bào sợi Chuột

BALB/c Phôi tha

Bình

thường Thể bội lẽ

Cảm ứng tiếp xúc, sẳn sàng chuyển dạng

[ Aaronson vàTodaro,1968]

NRK49F Nguyên bào sợi Chuột nước Trưởng thành Bình thường Thể bội lẽ

Cảm ứng phát triển trong dịch treo bởi những nhân tố chuyển dạng

[Delarco và Todaro, 1978]

3./ CÁC NGUỒN MÔ DÙNG ĐỂ NUÔI CẤY NGUYÊN BÀO SỢI

[2],[7],[16]

Để nuôi cấy nguyên bào sợi người, ta có thể sử dụng mẫu mô từ nhiều nguồn khác nhau ở trên cơ thể người, Ở đâu có mô liên kết thì ở đó có tồn tại nguyên bào sợi Mô liên kết đảm nhiệm chức năng chống đỡ cơ học cho mô khác, trao đổi chất giữa máu và mô, tích lũy, dự trữ năng lượng, bảo vệ cơ thể chống nhiễm khuẩn, tham gia vào sự tái tạo sau khi bị tổn thương

Mô liên kết thực hiện chức năng nuôi dưỡng các mô khác Tất cả các chất từ máu đi tới tế bào của các mô đều thông qua mô liên kết

3.1./ Ở giai đoạn phôi thai

Lấy từ: + Gai nhau

+ Nước ối (giai đoạn từ 15–16 tuần là nhiều nguyên bào sợi nhất.) + Ở mô phôi thai ngoài hoặc mô phôi thai sẩy, trong giai đoạn dưới 12 tuần Mô quan tâm là Trung mô: Trung bì cận trục, Trung bì trung gian, Trung bì tấm bên ( lá thành, lá tạng )

3.2./ Ở giai đoạn sau sinh (hay ở người trưởng thành)

+ Mô phổi.[14] + Mô tim.[19] + Mô gan [15]

+ Thanh mạc (màng bụng).[8] + Màng sụn, màng xương.[8] + Chất nền tủy xương.[22] + Thận.[15], [30]

Hình 1: Ảnh mô tả các đốt: đốt xương, đốt cơ, đốt da

+ Tử cung.[16], [30]

Nhưng ở đây ta chỉ quan tâm tới mô phôi thai ngoài dưới 12 tuần tuổi Vì đây là nguồn mô tìm năng nhất, chứa nhiều tế loại tế bào có nguồn gốc từ trung mô, như các đốt phôi, trong đó có nguyên bào sợi với tỉ lệ rất cao

*./ Sự tạo xương và sụn từ đốt phôi

Mỗi đốt phôi sẽ tiếp tục phân ra thành ba loại đốt: đốt phôi

xương, đốt phôi cơ và đốt phôi da Phía trong cùng là đốt xơ (scleroderm), còn

gọi là đốt xương, sẽ tạo xương sống và xương sườn Phía bên ngoài là đốt

cơ-da (dermomyotome) sẽ phân ra làm đốt cơ (myotome) tạo cơ và đốt da

(dermatome) tạo hạ bì của da (căn bì)

Các tế bào trung mô nằm

rải rác trong lớp trung mô có khả năng

biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác

nhau như: nguyên bào sợi, nguyên bào

sụn, nguyên bào xương … Cũng chính

trung mô (trung bì tấm bên) tạo ra: trung bì lá thành và trung bì lá tạng (thuộc

trung bì tấm bên) Một số trung mô vùng đầu có nguồn gốc mào thần kinh Các xương hình thành khởi đầu từ những mảnh trung mô có hình dạng

xương tương lai Từ trung mô, các xương được tạo theo sự cốt hóa nội sụn hoặc sự cốt hóa nội màng

3.3./ Đặc điểm hình thái – tính chất chức năng của nguyên bào sợi.[9] 3.3.1./ Đặc điểm hình thái của nguyên bào sợi:

Hình dạng của tế bào có thể bị thay đổi do những yếu tố vật lý (bề

mặt) nơi mà chúng gắn bám Dưới kính hiển vi điện tử, nguyên bào sợi là những

tế bào non, ít biệt hóa Nguyên bào sợi thường có dạng hình thoi, ít nhánh và

ngắn, kích thước không quá 20–25 micromet, nhân bầu dục hoặc hình cầu có

một hoặc vài hạt nhân Nhân của nguyên bào sợi cô đặc được kéo dài ra Bào

tương ưa base nhạt, lưới nội bào, ti thể phát triển Nguyên bào sợi có khả năng

phân chia mạnh, tế bào có thể di động yếu nhờ siêu sợi actin và myosin ở ngoại

vi bào tương Tế bào có những nhánh là chân giả dạng sợi

3.3.2./ Chức năng của nguyên bào sợi

Hình dáng cấu trúc vật lý của tế bào đem lại những chức

năng đặc biệt đối với việc tổng hợp và tiết ra các đại phân tử, đảm nhận nhiều

chức năng quan trọng trong cơ thể như:

+ Tổng hợp các chất như phân tử collagen, proteoglycans,

glycoprotein và sợi elastin bằng quá trình ngoại tiết để tạo sợi liên kết, tổng hợp glycosaminoglycan, tổng hợp một phần glycoprotein

+ Tham gia vào quá trình tái tạo

+ Tạo tế bào sợi trưởng thành, tế bào mỡ, tế bào sụn, tế bào

+ Khả năng thực bào của nguyên bào sợi rất thấp

*./ Tế bào sợi trưởng thành là những tế bào đã biệt hoá, có dạng hình thoi dài, đô

*./Khoảng đời: Nguyên bào sợi tồn tại 6 -7 tháng trong quá trình nghiên

cứu in vitro.[3]

3.3.3/ Khả năng biệt hóa và tái biệt hóa của nguyên bào sợi.[31]

Đây là nguyên bào sợi đơn, bằng cách thay đổi hình dạng tế bào,

nó có thể tạo ra tất cả các thành phần của mô liên kết Dòng tế bào gốc của

nguyên bào sợi cũng tham gia vào sản xuất ra những nguyên bào tạo xương của

mô xương, tạo ra tế bào mỡ của mô mỡ, tạo ra nguyên bào tạo sụn của mô sụn

Nguyên bào sợi được nhìn thấy ở đây là phần mặt nổi, được nhìn từ trên xuống

Hình 4: Aûnh mô tả khả năng biệt hóa của nguyên bào sợi [10]

Hình 5: Nguyên bào sợi đơn[31]

Hình ảnh phác họa thể hiện rõ ràng hơn hình dạng tự nhiên của nó hơn là

quan sát trực tiếp trên kính hiển vi soi ngược Những nguyên bào sợi bám đáy thì trông giống như ở trên, thường có dạng que nhọn và đường viền không tuân

theo một dạng nhất định nào cả.(Hình 4)

Thông thường thì chúng được qui cho là có dạng “hình sao” Hãy để ý rằng, một số có

tế bào chất mở rộng thành nhánh và thành

dải dài Những nhánh bào chất tiếp nối

với nhau bằng sợi collgen (bình thường

khó nhìn thấy được), và đóng vai trò chính trong việc duy trì và sửa chửa những sợi này.[Hình 17]

Tầm quan trọng của nguyên bào sợi chưa thể đánh giá hết được

Chúng hiện diện ngay trong trạng thái phát triển bình thường, và cả lúc hàn gắn và sửa chửa vết thương Ngày ngày, chúng tham gia hoạt động sinh lý của các mô và các cơ quan trong cơ thể Nguyên bào sợi đảm nhiệm nhiều chức năng

Nguyên bào sợi có thể khử biệt hóa để trở về trạng ở giai đoạn sớm trong tiến trình phát triển của nó Và sau đó, lặp lại sự biệt hóa đó (tái biệt hóa) để tạo ra

một số loại tế bào khác

Ví dụ: nguyên bào sợi có thể thoái triển trong tiến trình tồn tại của

chúng, chuyển đổi cơ cấu và biệt hóa thành nguyên bào tạo xương, để góp phần vào sản xuất xương, hoặc biệt hóa tạo nguyên bào tạo sụn, hoặc thậm chí khi cần thiết chúng có thể chuyển thành tế bào mỡ

Nguyên bào sợi trong mô lên kết có khả năng tạo sẹo khi có tổn thương mô

Hình 6 : Nguyên bào sợi ghi nhận trong thí

nghiệm Đợt II, lần 2

Khi biệt hóa thành nguyên bào sụn , chúng không chỉ tạo ra các sợi

collogen và sợi elastin để đáp ứng cho loại mô sụn mà còn tạo ra chất nền rất

tốt Dưới kính hiển vi thường, tế bào sẽ khó quan sát được rõ ràng một khi chúng không được nhuộm chất nhuộm đặc hiệu; nhưng ở trạng thái vi ảnh dưới

kính hiển vi soi ngược,thỉnh thoảng chúng ta vẫn có thể nhận ra được nhân của

nó và có thể thấy được ranh giới rõ ràng của từng tế bào Chất nhuộm đặc hiệu

sẽ làm nổi bật bào chất có tính axit tự nhiên của nó, làm cho ta dễ dàng xác định được nguyên bào sợi dưới kính hiển vi quang học

Sự can thiệp của nguyên bào sợi với hoạt động của chúng có thể gây

ra một số chứng bệnh lâm sàn nổi bậc như: gây bệnh thiếu vitamin C ở người

(bệnh Scurvy) Một khi thiếu vitamin C, nguyên bào sợi không tổng hợp được

sợi collalgen bằng con đường đặc hiệu, hậu quả gây ra một loạt các chứng bệnh

có liên quan, như: viêm loét da, thiếu máu, chứng phù thủng, viêm nướu răng,

gãy răng, chảy máu màng tuyến nhầy Phục hồi lượng vitamin C cần thiết sẽ cho phép nguyên bào sợi tự điều trị những chứng bệnh bất thường này

3.3.4/ Nguyên bào sợi – đầu mối tạo ra mỡ, sẹo và sự viêm.[30]

Thường thì các nhà khoa học cho rằng nguyên bào sợi – chỉ là những

tế bào mà nó hình thành nên cấu trúc mô cơ bản - và nó còn là khung giàn tạm

thời cho nhiều loại tế bào quan trọng khác leo bám Không những thế, các nhà

khoa học thuộc trung tâm University of Rochester Medical Center đã khám

phá ra rằng: nguyên bào sợi đã được biệt hóa cao về chức năng và thể hiện vai trò của chúng trong cách thức hình thành sẹo, tích luỹ mỡ và xuất hiện trong đáp ứng viêm có hại, mà nó gây bất lợi ở người

Kết quả nghiên cứu giúp ích rất nhiều cho bác sĩ hiểu rõ tại sao ở một

số người bị bệnh sẹo hóa quanh vùng cơ quan nội tạng thiết yếu ảnh hưởng đến

sự sống còn [30] Điều đó có thể dẫn đến chứng bệnh quan trọng ở một số cơ

quan như: mắt, phổi, tim, thận hay ở ruột Điều này cũng giải thích sự lành hóa

vết thương

Tiến sĩ Richard P.Phipps nói:“Đây là chỉ là kết quả lần đầu tiên

chứng minh được rõ ràng rằng: chính các loại nguyên bào sợi người có thể phát triển thành các loại tế bào tạo ra sẹo hay tạo ra mỡ” Theo lời tác giả và các

giáo sư: ”Thực ra, kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã thể hiện rằng: những

nguyên bào sợi đã chứng tỏ có khả năng giúp cho các nhà khoa học tạo ra một công cụ chẩn đoán hữu dụng, mà đầu mối nghiên cứu đang được cung cấp từ những chứng bệnh đang trong tình trạng nguy cấp hoặc những ai đang nằm mê mang, la liệt bởi những vết thương bất thường”

Trong những thập niên gần đây, các nhà khoa học thường cho rằng: các tế bào nguyên bào sợi, tất cả đều giống nhau Tuy nhiên nhóm nghiên cứu

của P.Phipps bắt đầu khảo sát những tiểu quần thể nguyên bào sợi Xem, lý do

nào khiến chúng có khả năng trở nên chuyên biệt hóa chức năng; và được gọi là:

nguyên bào tạo cơ hay nguyên bào tạo mỡ

Nguyên bào tạo cơ: thường thì không thể hiện rõ ràng trong những

mô khỏe mạnh nhưng chúng trở nên hoạt động tích cực sau cuộc phẫu thuật

hoặc sau tổn thương Khi rơi vào tình trạng không kiểm soát được nguyên bào

tạo cơ sẽ dẫn đến sự hóa xơ ở một số cơ quan như :gan, thận, phổi và tim

Nguyên bào tạo mỡ : không có vai trò trong việc hình thành sẹo

nhưng lại phát triển tạo ra những tế bào mỡ và dẫn đến chứng bệnh ở mắt và

tích luỹ những mô mỡ có hại ở gan, lách và tuỷ xương

Trong phòng thí nghiệm, nhóm nghiên cứu của P.Phipps điều khiển thí nghiệm trên nguyên bào sợi lấy từ mô ở mắt và mô ở tử cung người [28]

Họ đã tách nguyên bào sợi ra và xử lý những tế bào này với những tác nhân kích ứng

Hình 7: Ảnh minh họa cho quá trình hàn gắn xương có sự tham gia của nguyên bào sợi[12]

Các nhà khoa học này khảo sát cách mà tế bào có thể được chuyển

đổi để trở thành : hoặc tế bào sản xuất sẹo (Myofibroblast), hoặc tế bào sản xuất mỡ (Lipofibroblast)

Cuối cùng họ đã khám phá ra những thụ thể bề mặt và nhờ vào đó mà bề mặt tế bào đã xác định được cách thức để nguyên bào sợi có tiềm năng chuyển đổi và thực hiện chức năng chuyên hóa

Thực tế cho thấy rằng những nguyên bào sợi mà nó biểu lộ thụ thể bề

mặt Thy-1, một loại protein liên quan đến sự phát triển chức năng, và có thể trở

thành nguyên bào cơ

Trong truờng hợp ngược lại, những loại nguyên bào sợi mà bề mặt

không có thụ thể Thy-1 (CD90), sẽ có tiềm năng phát triển trở thành nguyên bào

tạo mỡ [39]

P.Phipps nói, sắp tới, nhóm của ông ta sẽ cố gắng hoàn tất nguyên

cứu cách thức chuyển đổi tính chất của nguyên bào sợi Họ hy vọng nghiên cứu có thể dẫn tới tạo ra thuốc hoặc protein có khả năng đóng khoá thụ thể chấm dứt việc tích luỹ mỡ hay tạo sẹo bất lợi

3.3.5 Khả năng góp phần sửa chửa vết thương, tái tạo mô bị tổn

thương của nguyên bào sợi [12]

a./ Sửa chửa vết đứt gãy đơn giản ở xương

Gồm các

bước sau:

Bước 1:

Khối tụ máu

hình thành: Khi xương bị

gãy mạch máu trong chính

bản thân xương đó bị vở, rồi máu từ mạch đến bao quanh vùng mô đó, hình thành: vết bị đứt gãy và khối băng huyết Kết quả là: khối tụ máu hay còn gọi là khối máu được kết vón, hình thành tại vị trí đứt gãy Sau đó một thời gian ngắn, các tế bào xương do bị tước mất nguồn dinh dưỡng nên bắt đầu chết dần và mô tại vị trí đứt gãy đó trở nên: sưng tấy, đau và sự viêm bắt đầu hình thành rõ ràng

Bước 2:

Khối sụn sợi chai cứng hình thành : Sự kiện tiếp theo là hình

thành nên mô hạt mềm Điều đó xảy ra vào khoảng tuần thứ 3 – 4 kế tiếp Có moat vài sự kiện khác nữa giúp hình thành mô hạt, ban đầu được gọi là mô chai mềm: ở đó mao mạch mọc tiến dần vào khối tụ máu và thực bào cũng tiến vào lấn chiếm khu vực bị tổn thương này, bắt đầu dọn sạch cặn rác Cũng trong lúc

đó, nguyên bào sợi và nguyên bào xương mọc lan vào; và bắt đầu công việc kết cấu lại xương Các nguyên bào sợi sản xuất sợi collagen để làm cầu nối xuyên

qua vết đứt gãy và cuối cùng chấp nối lại xương bị gãy Song song đó, đã diễn ra

một vài sự biệt hóa biệt hóa cho ra nguyên bào tạo sụn, rồi nguyên bào tạo sụn

chế tiết chất nền sụn Bên trong khối mô sửa chửa này, nguyên bào tạo xương

bắt đầu hình thành xương dạng xốp Những sự kiện xảy ra tiếp theo sau đó là:

mao mạch cung cấp, chế tiết chất dịch làm cho nền tạo sụn phình ra bên ngoài;

sự kiện diễn ra sau đó nữa là sự vôi hóa xảy ra Toàn bộ khối mô sửa chửa này, bay giờ được gọi là khối sụn sợi chai, đóng vai trò như bó thanh nẹp xương bị

gãy Vị trí mà ở đó trực tiếp xảy ra sự chấp nối cuối cùng vùng xương bị gãy

được gọi là khối sẹo sợi bên trong (internal callus); Phần mà nó nhô ra khỏi bề mặt bình thường của xương gọi là khối sẹo sợi bên ngoài (external callus)

Bước 3:

Mấu thể chai hình thành: Nguyên bào tạo xương và nguyên bào tủy

tiếp tục di trú vào trong, tăng sinh số lượng nhanh chóng trong khối sẹo sụn

(fibrocartilaginous callus) Kết quả của sự chuyển đổi là làm biến đổi dần dần

sẹo xương chai cứng xốp Sự kiện này xảy ra len lõi bên trong xương Sự kiện tạo mấu thể chai cũng bắt đầu từ tuần thứ 3 – 4 sau tổn thương, và tiếp tục diễn ra cho tới khi có được sự liên kết xương cứng chắc – điều này được hình thành sau đó từ 2 -3 tháng

Bước 4:

Cấu tạo lại: Bắt đầu xuyên suốt từ khi mấu thể xương chai hình thành và diễn tiến trong nhiều tháng tiếp theo sau đó, mấu thể xương chai được xây doing lại Chất liệu thừa thải dôi ra bên ngoài, trong quá trình sửa chửa thân xương, bên trong hốc tủy xương sẽ được loại bỏ đi, và xương đặc ở thành sẽ được xây dựng lại thành trụ xương Cấu trúc cuối cùng của việc cấu tạo lại là: giống nguồn xương ban đầu trước khi bị gãy bởi vì nó đáp ứng lại với chất kích thích kiến tạo cùng loại

b./ Sửa chửa vết rách đứt đơn giản ở da:

Các bước sửa chửa cơ bản ở da giống như ở xương, đều có sự tham gia của nguyên bào sợi trong quá trình lành hóa vết thương

Sửa chửa mô hoặc hàn gắn vết thương, xảy ra theo 2 cách thức

chính:bằng cách tái sinh và bằng sự xơ hoá

Tái sinh là sự thay thế mô bị phá hủy bằng những loại tế bào tương tự

hoặc giống như những tế bào trước đó

Ở những nơi mà sự hoá xơ xảy ra, thì sự xơ hóa đó sẽ bọc lấy vị trí cần

sửa chửa bằng mô liên kết có sợi Đó chính là sự hình thành mô sẹo Trước khi những sự kiện này xảy ra, thì còn phụ thuộc vào:

(1)Loại mô bị hư hại

(2) Và, độ nghiêm trong của sự tổn thương (tùy loại vết thương)

Người ta thường nói: cắt sạch (vết rạch) thì mô hàn gắn vết thương dễ dàng hơn là mô bị rách (vết cắt khía mép sẻ không đều).Mô tổn thương sẽ thiết lập thành dãy bằng phẳng trong vùng bị tổn thương, khi đó, vùng tổn thương sẽ trở thành vùng vận động

Đầu tiên, mao mạch ở vùng đó trở nên tăng tính thấm rất mạnh, và cho phép dịch kẽ tăng lên làm kết vón proteinvà các chất hoạt hóa trong chất nền lọt ra khỏi vùng bị tổn thương đi vào dòng máu

Sau đó, protein kết vón được tiết ra và kết lại thàng cục, ngừng mất máu, giữ mép cạnh vùng bị tổn thương lại với nhau, và tạo hàng rào bảo vệ một cách hiệu quả ở vùng bị tổn thương, ngăn chặn vi khuẩn hoặc những chất gây hại khác lan ra khỏi vùng bị tổn thương vào những vùng mô lân cận Ở đó, sự kết vón bộc lộ ra ngoài bề mặt da, nhanh chóng khô đi và cứng dần, tạo vảy

Trong bước tiếp theo, mô hạt hình thành Mô hạt là một mô mỏng màu hồng kết hợp với mao mạch máu mà ở đó sẽ phát triển thành mạch máu lan vào vùng bị tổn thương bắt đầu từ những mạch máu không bị tổn thương Những mao mạch ở đây thì giòn, dễ vỡ, và máu chảy tự do khi khi vảy bị xâm phạm (chóc) Bình thường thì vảy bị tiêu dần, và khép vùng da bị tổn thương

Mô hạt còn bao gồm cả đại thực bào, chính loại tế bào này là nguyên nhân gây ra khuynh hướng kết vón protein, đồng thời lúc đó mô liên kết tổng hợp sợi collagene (hình thành mô sẹo), và các tế bào mô liên kết (chính nguyên bào sợi) tổng hợp sợi collagen (tạo mô sẹo) cố định làm cầu kết nối qua lỗ khuyết

Trong khi những sự kiện này đang diễn ra, bề mặt ngoại bì bắt đầu tái sinh bằng cách mọc lan xuyên qua bên dưới mô hạt, vừa xác khít bên dưới sẹo, và tách rời ngay sau đó Kết quả cuối cùng là tái sinh đầy bề mặt ngoại bì.[hình] mà ở đó mô sẹo được lót ở bên dưới Vết sẹo có thể nhìn thấy hoặc thấy một vết trắng mảnh, điều đó phụ thuộc vào mức độ trầm trọng của vết thương

Hình 8: Ảnh minh họa cho quá trình hàn gắn da có sự tham gia của nguyên

bào sợi[12]

Các mô khác nhau có khả năng tái sinh rất khác nhau Biểu mô cũng giống như biểu bì da và biểu mô nhầy tái sinh rất tốt Cơ vân tái sinh kém, Trong tất cả các mô: mô cơ tim và mô thần kinh bên trong não và trong tủy sống được thay thế chỉ duy nhất bởi mô sẹo

Mô sẹo liên kết rất bền chắc, nhưng thiếu đi tính linh hoạt so với tất cả các mô bình

thường, có lẽ thậm chí quan trọng hơn thế nữa, là khả năng không phục hồi chức năng bình thường củ mô mà nó thay thế Vì vậy nếu sẹo hình thành trong vách của màng bao, vách của tim hoặc những tổ chức cơ khác, điều đó có lẽ that nguy hiểm cho chức năng của cơ quan đó

3.3 6 Nguyên bào sợi - sản xuất nhân tố tăng trưởng, cảm ứng biệt hóa.[13]

Phương pháp thiết lập để nuôi cấy và thu nhận tế bào mục tiêu, nhất là nhằm thu nhận những tế bào tiềm năng như: tế bào mầm, tế bào gốc, các nguyên bào ở người, thì phải làm sao tạo ra được môi trường nuôi cấy như là môi trường ở trong trạng thái in vivo của người Có nghĩa là thành phần của môi

trường nuôi cấy được cung cấp phải đạt đến trạng thái ex vivo (thành phần của

môi trường nhân tạo có đầy đủ nhân tố dinh dưỡng, tăng trưởng như ở trong huyết

tương của người ) thì lúc đó mới đáp ứng được nhu cầu cho các nguyên bào tăng

trưởng lan rộng Trong môi trường nuôi cấy có chứa đựng bao gồm: nguyên bào,

tế bào gốc, tế bào sinh dưỡng và các nhân tố tăng trưởng Khi đó, trong quá trình thí nghiệm nuôi cấy, môi trường nuôi cấy phải thay thế thường xuyên và liên tục, đúng kỳ hạn với một tỉ lệ thích hợp để duy trì hiệu quả môi trường, giúp cho các nguyên bào tăng sinh, lan rộng; ở một vị trí nào đó trong đám tế bào sinh

dưỡng có các nguyên bào sợi được chuyển dạng sẽ có khả năng chế tiết ít nhất

một nhân tố tăng trưởng Mà nhân tố tăng trưởng này điều khiển trực tiếp quá trình tăng sinh biệt hóa của các tế bào gốc và các nguyên bào khác

Ở những nơi được cho là có sự chuyển dạng của các nguyên bào sợi thì

ít nhất một trong số các yếu tố tăng trưởng sau được chế tiết: từ IL1 đến IL7,

GM-CSF, G-CSF, MCSF, nhân tố tăng trưởng cơ bản của nguyên bào sợi

(bFGF), PDGF, EFG, TGF-α , TGF-β , erythropoietin và những nhân tố tăng

trưởng khác, để duy trì các nhân tố tăng trưởng ở mức độ mong muốn phù hợp với nhu cầu của tế bào trong dịch môi trường nuôi cấy

3.3.7 Nguyên Bào Sợi - Chức Năng Tiếp Liệu, Chế Tiết Collagene, Làm Giá Thể Thu Nhận Tế Bào Mầm [38]

Hình bào s

Hình 9: Ảnh minh họa dùng nguyên bào sợi để thu nhận tế bào mầm [38]

3.4 SỰ LIÊN HỆ GIỮA NGUYÊN BÀO SỢI VÀ TẾ BÀO

TRUNG MÔ

Nguyên bào sợi là một trong những hậu duệ của tế bào trung mô

Mặc dù khả năng biệt hoá của nguyên bào sợi thành tế bào xương, sụn, cơ, mỡ kém hơn tế bào gốc trung mô (MSCs), nhưng đó là tế bào phát triển nhanh, mạnh trong điều kiện môi trường đơn giản, nên thường được chọn trong nuôi cấy nghiên cứu

4 TRỨNG LÀM TỔ BÌNH THƯỜNG

Trứng làm tổ trong niêm mạc tử cung mẹ ở giai đoạn phôi nang Màng trong suốt phải thoái triển khi trứng làm tổ

Phôi nang vùi vào lớp chức năng của nội mạc tử cung mẹ (ở kỳ chế tiết của chu kỳ kinh nguyệt)

Sơ đồ 1: Aûnh mô tả quá trình biệt hóa tạo các dòng tế bào của tế bào mầm trung mô [22]

Lá nuôi hợp bào ở phía cực phôi bám vào nội mạc tử cung mẹ, đáo một hố lõm để trứng loạt vào

Lá nuôi có xu hướng phát triển tới các mạch máu trong niêm mạc tử cung mẹ

Phôi thường làm tổ trong nội mạc tử cung, thành sau nhiều hơn thành trước

5 TRỨNG LÀM TỔ BẤT THƯỜNG (LẠC CHỖ)

Theo Page và cộng sự (1981) trứng làm tổ trong vòi trứng có tỉ lệ từ 1/80 – 1/25 trong các trường hợp có thai Trên 90% các trường hợp lợp chỗ là ở

vòi trứng, trong đó khoảng 60% là ở bóng và phễu của vòi Nguyên nhân trứng

làm tổ ở vòi trứng thường liên quan tới việc di chuyển của hợp tử về thân tử cung bị trở ngại, có thể là: hậu quả của viêm nhiễm tại khung chậu hoặc dính tắc sau

viêm hoặc tổn thong niêm mạc vòi trứng

Hình 10: Ảnh trứng được thụ tinh và làm tổ bình thường.[27]

Nguy cơ của trứng làm tổ ở vòi trứng là vở và chảy máu Nếu trứng làm tổ ở bóng hoặc tua vòi, phôi nang có thể rơi vào ổ bụng và làm tổ trong túi cùng trực tràng-tử cung Nếu trứng làm tổ ở đoạn eo vòi, trứng có nguy cơ rỉ máu và vở cao vì đoạn này có nhiều mạch nối tắt và cấu trúc mô ít khả năng dãn

Trứng làm tổ trong cổ tử cung rất hiếm gặp

Phôi có thể làm tổ ngay tại buồng trứng hoặc trong ổ bụng, nhưng hiếm gặp.[Hình]

Hình11: Ảnh trứng được thụ tinh và làm tổ trong tai vòi (thai ngoài ) [25]

*./ Chiều dài của bào thai và trọng lượng thai nhi theo phỏng chừng (ước

lượng) bởi luật của Haase (1875).[5]

Bảng 2 :

Chiều dài của bào thai

Tháng thứ 1: 1 cm Tháng thứ 2: 4 cm Tháng thứ 3: 9 cm Tháng thứ 4: 16 cm Tháng thứ 5: 25 cm Tháng thứ 6: 30 cm Tháng thứ 7: 35 cm Tháng thứ 8: 40 cm Tháng thứ 9: 45 cm Tháng thứ 10: 50 cm

Trọng lượng của bào thai

Tháng thứ 1: 1-2 g Tháng thứ 2: 14-15 g Tháng thứ 3: 90-100 g Tháng thứ 4: 120g Tháng thứ 5: 280-300g Tháng thứ 6: 600-700g Tháng thứ 7: 1000-1100g Tháng thứ 8: 1800g Tháng thứ 9: 2500g

Tháng thứ 10: 3200g

*./ Một số hình ảnh thai ngoài tử cung

Hình13: Phôi ở trong màng ối giai đoạn 4 tuần tuổi: (Ax3), (Bx18) [16] Hình12: Phôi ở trong tai vòi giai

đoạn 4 tuần tuổi: (Ax3), (Bx13) [16]

6 CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY SƠ CẤP

Nuôi cấy sơ cấp gồm:

+Nuôi cấy mô Tách bằng cơ học

+Nuôi cấy tế bào rời Tách bằng bằng hóa chất.Hóa chất gồm có: trysine, Collagenase, Papain, Chymotrypsin

Sơ đồ 2: Phác đồ phác họa về các phương pháp nuôi cấy sơ cấp.[15]

PRIMARY EXPLANTS

PRIMARY EXPLANTS Hình15 : Phôi ở trong túi màng đệm giai đoạn 8 tuần tuổi:(Ax3),

(Bx1).[16] Hình14: Phôi ở trong tai vòi

giai đoạn 8 tuần tuổi.[16]

7 PHƯƠNG PHÁP CẤY TRUYỀN – TẠO DÒNG, THU NHẬN VÀ LƯU

TRỮ DÒNG TẾ BÀO MỤC TIÊU

7.1 Cấy chuyền tế bào

1) Đổ bỏ môi trường cũ trong bình roux có tế bào (vào bercher đựng nước thải)

2) Dùng pipette hút 2ml PBS(-) cho vào roux, lắc nhẹ để rửa sạch tế bào chết và huyết thanh, đổ bỏ PBS(-), lập lại 2 lần

3) Dùng pipette khác hút 2ml trypsin cho vào bình roux

4) Để bình roux trên lòng bàn tay, lắc nhẹ qua lại khoảng 50 lần (chú ý không để nắp bình roux chạm tay)

5) Đổ bỏ trypsin, cầm bình roux bằng tay phải vổ nhẹ vào lòng bàn tay trái để tế bào tách khỏi vách bình roux

6) Hút 2ml E’MEM cho vào bình roux, tráng đều lên bề mặt bình roux có tế bào

7) Hút vào mỗi bình roux mới bình 5ml môi trường E’MEM

8) Dùng pipette 1ml gắn vào bóp cao su (loại nhỏ) hút sục môi trường phun đều vào bề mặt bình roux có tế bào để huyền phù tế bào

9) Hút vào mỗi bình roux mới 0,5ml dịch huyền phù tế bào Lắc nhẹ, ủ ở 37,5oC trong tủ nuôi

10) Sau 24 giờ, đổ bỏ môi trường cũ cho vào bình roux 5ml môi trường mới để loại bỏ trypsin và những tế bào chết

Lưu ý: một bình roux chứa đầy tế bào có thể cấy chuyền sang 3 hoặc 4 bình

roux mới

*./ Kỹ thuật chọn dòng tế bào:

Đây là kỹ thuật dùng để tách riêng một colony tế bào trong một đĩa nuôi có nhiều dạng tế bào khác nhau

Phương pháp này thực hiện như sau:

+ Dùng dung dịch trypsin tách rời các tế bào từ đĩa nuôi cấy, tạo thành dịch huyền phù tế bào

+ Cấy tế bào vào đĩa nuôi cấy có môi trường mới với mật độ thấp khoảng 1000 tế bào/ml để các tế bào cách xa nhau trong đĩa nuôi Tuy nhiên mật độ tế bào có thể thay đổi tùy trường hợp cụ thể

Nuôi ủ tế bào đến khi chúng phát triển thành những colony riêng rẽ

Chọn một colony tế bào cần tạo dòng Cô lập colony này bằng 1 ống kim loại nặng có kích thước phù hợp Hút bỏ môi trường trong ống và tách các tế bào từ colony này bằng trypsin và cấy sang một đĩa môi trường mới Nếu cần thiết có thể thực hiện bước chọn dòng này vài lần nữa cho đến khi bảo đảm thu được

dòng tế bào từ 1 tế bào đầu tiên

7.2 Tạo Và Thu Nhận Dòng Tế Bào Mục Tiêu Trên Môi Trường Thạch Bằng Vòng Rings.[15]

Phác đồ:

Sơ đồ 3.: Phác đồ thu nhận dòng tế bào bằng vòng rings.[15]

7.3 Bảo quản tế bào [3]

1) Tách tế bào trong bình roux bằng trypsin (thao tác như trên từ 1 đến 6) 2) Huyền phù tế bào bằng cách hút sục bằng pipette 1ml với bóp cao su 3) Hút dịch huyền phù tế bào vào 2 eppendorf mỗi cái 1ml

4) Li tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC Bỏ dịch nổi

5) Cho vào mỗi eppendorf 900ml môi trường, vortex để huyền phù tế bào 6) Hút dịch huyền phù ở 2 eppendorf cho vào tube bảo quản tế bào 2ml, bổ

sung thêm 200ml DMSO, trộn đều bằng pipetman hay vortex

7) Để tube bảo quản vào hộp xốp bên trong có lót bông gòn, cho vào tủ

lạnh -70oC qua đêm (để nhiệt độ tube bảo quản tế bào hạ xuống từ từ khoảng 1oC/ phút)

8) Bảo quản tube tế bào trong Nitơ lỏng

7.4 Hoạt hóa tế bào

1) 1) Tube tế bào lấy từ nitơ lỏng được cho vào becher nước ấm 37– 38oC (có pha một ít javel để khử trùng) để giải đông

2) Cho 5ml môi trường E’MEM (10% huyết thanh) vào bình roux

3) Dùng pipetman 1ml hút trộn đều tế bào trong tube Hút dịch huyền phù tế bào cho vào bình roux (có môi trường) từng giọt một, vừa cho vừa lắc để hòa đều tế bào

4) Ủ ở 36,5oC trong tủ nuôi Sau 24 giờ, thay môi trường cũ bằng môi trường mới để loại bỏ tế bào chết và DMSO

8 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY [15] 8.1 Môi trường và các yếu tố bổ sung

Aûnh hưởng của môi trường bean ngoài lên quá trình nuôi cấy tế bào biểu hiện qua 4 con đường :

1./ Tính tự nhiên của giá thể rất có ý nghĩa trong quá trình nuôi cấy, nơi tế bào sẽ gắn bám và tăng trưởng; giá thể phù hợp tế bào tăng trưởng

mạnh – điều này tạo ra tính đồng nhất trong tăng trưởng, có thể nuôi lớp đơn trên nhiều giá thể khác nhau như: trên đĩa plastic, trên giá thể bán rắn (trong

một loại gel, collagen , agar hoặc trong nuôi cấy dịch treo)

2./ Sự cấu thành của các yếu tố lý hoá và sinh lý của môi trường 3./ Sự thiết lập về giai đoạn pha khí

4./ Aûnh hưởng của nhiệt độ ủ

Việc nuôi những tế bào từ những mảnh mô có thể được cấy chuyền và tăng sinh in vitro dẫn đến việc thử nghiệm tạo ra nhiều môi trường hơn để duy trì sự tăng trưởng của dòng tế bào liên tục và thay thế môi trường tự nhiên như : dịch chiết phôi, dịch thuỷ phân protein, lymph v.v

Sự tiếp cận để phát triển một môi trường mới bắt đầu với một môi

trường giàu chất dinh dưỡng như : Ham’s F12 [1965] hoặc môi trường 199 được bổ sung với nồng độ cao của huyết thanh (20%) và dần dần thử nghiệm giảm

bớt huyết thanh bởi sự thay đổi nồng độ của các thành phần tồn tại trong môi trường và thêm vào các yếu tố mới

8.2 Yếu tố bề măt của chai nuôi - giá thể

Phần lớn tế bào động vật có xương sống có khả năng tăng trưởng thành lớp đơn trên bề mặt nhân tạo trong điều kiện nuôi in vitro Từ những cố gắng sớm nhất, thủy tinh đã được sử dụng như là giá thể, khởi đầu do đặc tính quang học của nó, nhưng do tế bào cần dàn trãi, gắn bám lên trên một bề mặt giá thể thích hợp cho sự tăng trưởng [15] để khắc phục tình trạng này sau đó người ta đã dùng nhựa plastic do chúng có đặc tính quang học tốt và bề mặt tăng trưởng bằng phẳng, tạo ra được các đơn vị tăng trưởng tế bào và sự tái tạo trong nuôi cấy

Hiện nay đa số người ta thích dùng polystyrene Ngoài ra còn có các loại giá thể bán thấm, các loại vi giá thể và giá thể nhân tạo khác

Sự lựa chọn giá thể được quyết định dựa vào: + Khả năng sinh sản của tế bào

+ Sự tăng của tế bào trong dịch treo hoặc tạo lớp đơn + Việc nuôi nên để thông khí hay bịt kín

+ Mẫu chuẩn và mẫu thí nghiệm được thực hiện hay không + Giá cả có hợp lý

8.3 Yếu tố vật lý

8.3 1 Áp suất thẩm thấu:

Hầu hết tế bào được nuôi có một giới hạn chịu đựng khá rộng về

áp suất thẩm thấu Aùp suất thẩm thấu của huyết tương người là 290mOsm/kg và người ta cho đây là áp suất tối ưu cho những trường hợp nuôi những tế bào người in vitro, mặc dù có sự khác nhau đối với các loại tế bào khác nhau

Trong thực tế, áp suất thẩm thấu giữa 260 mOsm/kg và 320 mOsm/kg thường được chấp nhận cho hầu hết những tế bào, nhưng nên có một sự chọn lựa và nên giữ ở mức sai số: ± 10 mosm/kg

8.3 2 Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp lên sự tăng trưởng của tế bào vì nó

làm ảnh hưởng đến pH do sự gia tăng của các CO2 hoà tan ở nhiệt độ thấp và do sự thay đổi về ion và pKa của dung dịch đệm pH nên được điều chỉnh thấp hơn 0.2 đơn vị ở nhiệt độ phòng hơn là ở 36.50C là điều liện tốt nhất để tạo ra môi trường hoàn toàn với huyết thanh nếu được sử dụng và ủ mẫu qua đêm ở 36.50C

Nhiệt độ tối ưu cho tế bào nuôi phụ thuộc vào :

+ Nhiệt độ cơ thể của động vật nơi tế bào được thu nhận

+ Tuỳ thuộc vào các vùng khác nhau về nhiệt độ cơ thể ( như

da và tinh hoàn có nhiệt độ thấp hơn các vùng khác trong cơ thể )

Tất cả các yếu tố an toàn theo sau trong điều nuôi: