Thử nghiệm phân lập và tạo dòng nguyên bào sợi từ mô phôi thai người

MỤC LỤC GIỚI THIỆU VỀ ĐỀ TÀI 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .4

Thử nghiệm phân lập nguyên bào sợi từ moâ phơi người Tiền Văn Sến BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC TIỀN VĂN SẾN THỬ NGHIỆM PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG NGUYÊN BÀO SI TỪ MÔ PHÔI THAI NGƯỜI KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC – Y DƯC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS BS TRẦN CÔNG TOẠI BS NHAN NGỌC HIỀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 7/2004 Trang Thử nghiệm phân lập nguyên bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến MỤC LỤC GIỚI THIỆU VỀ ĐỀ TÀI ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU LƯC SỬ NUÔI CẤY TẾ BÀO LƯC SỬ NUÔI CẤY NGUYÊN BÀO SI 2.1 Ở VIỆT NAM : 2.2 SƠ LƯC VỀ KINH NGHIỆM NUÔI CẤY NGUYÊN BÀO SI TRÊN THẾ GIỚI CÁC NGUỒN MÔ DÙNG ĐỂ NUÔI CẤY NGUYÊN BÀO SI 12 3.1 Ở GIAI ĐOẠN PHÔI THAI 12 3.2 Ở GIAI ĐOẠN SAU SINH 12 3.3 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI – TÍNH CHẤT CHỨC NĂNG CỦA NGUYÊN BÀO SI 13 3.3.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA NGUYÊN BÀO SI 13 3.3.2 CHỨC NĂNG CỦA NGUYÊN BÀO SI 14 3.3.3 KHẢ NĂNG BIỆT HÓA VÀ TÁI BIỆT HÓA CỦA NGUYÊN BÀO SI 15 3.3.4 NGUYÊN BÀO SI – ĐẦU MỐI TẠO RA MỢ, SẸO VÀ SỰ VIÊM 17 3.3.5 KHAÛ NĂNG GÓP PHẦN SỬA CHỬA VẾT THƯƠNG, TÁI TẠO MÔ BỊ TỔN THƯƠNG CỦA NGUYÊN BÀO 19 3.3.6 NGUYÊN BÀO SI - SẢN XUẤT NHÂN TỐ TĂNG TRƯỞNG, CẢM ỨNG BIỆT HÓA 23 3.3.7 NGUYÊN BÀO SI - CHỨC NĂNG TIẾP LIỆU, CHẾ TIẾT COLLAGENE, LÀM GIÁ THỂ THU NHẬN TẾ BÀO MẦM 24 3.4 SỰ LIÊN HỆ GIỮA NGUYÊN BÀO SI VÀ TẾ BÀO TRUNG MÔ 25 TRỨNG LÀM TỔ BÌNH THƯỜNG 26 TRỨNG LÀM TỔ BẤT THƯỜNG (LẠC CHỖ) 27 CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY SƠ CẤP 29 PHƯƠNG PHÁP CẤY CHUYỀN – TẠO DÒNG, THU NHẬN VÀ LƯU TRỮ DÒNG TẾ BÀO MỤC TIÊU 30 7.1 CẤY CHUYỀN TẾ BÀO 30 7.2 TẠO VÀ THU NHẬN DÒNG TẾ BÀO MỤC TIÊU TRÊN MÔI TRƯỜNG THẠCH BẰNG VÒNG RINGS 31 7.3 BẢO QUẢN TẾ BÀO 32 Trang Thử nghiệm phân lập ngun bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến 7.4 HOẠT HÓA TẾ BÀO 32 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY 32 8.1 MÔI TRƯỜNG VÀ CÁC YẾU TỐ BỔ SUNG 32 8.2 YẾU TỐ BỀ MĂT CỦA CHAI NUÔI - GIÁ THỂ 33 8.3 YẾU TỐ VẬT LÝ 34 8.3 ÁP SUẤT THẨM THẤU 34 8.3 NHIỆT ĐỘ 34 8.3.3 TÍNH NHỚT 35 8.3 ÁP LỰC SỨC CĂNG BỀ MẶT VÀ SỰ TẠO BỌT 35 8.4 YẾU TỐ HÓA HỌC 35 8.4.1 OXYGEN 35 8.4.2 CO2 36 8.4.3 PH 36 8.4.4 DUNG DỊCH ĐỆM 37 8.5 MÔI TRƯỜNG TỦ NUÔI 37 TỈ LỆ MÔI TRƯỜNG VỚI MẬT ĐỘ TẾ BÀO ĐEM NUÔI, LƯNG MÔ ĐEM CẤY 38 10 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 38 10.1 MÔI TRƯỜNG 38 10.2 MOÄT VÀI LOẠI MÔI TRƯỜNG THƯỜNG ĐƯC SỬ DỤNG TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO VÀ MÔ ĐỘNG VẬT 39 11 TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA NGUYÊN BÀO SI 41 CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỐI TƯNG NGHIÊN CỨU 43 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 2.1 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 43 2.2 CÁC MỤC TIÊU CẦN KHẢO SÁT 43 TRÌNH TỰ THÍ NGHIỆM 44 CÁC QUI TRÌNH CHÍNH ĐƯC SỬ DỤNG TRONG TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM 45 4.1 VÔ TRÙNG DỤNG CỤ HÓA CHẤT 45 4.2 VÔ TRÙNG NƠI TẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 45 4.3 CÁC QUY TRÌNH CHUNG XỬ LÝ MẪU THÍ NGHIỆM 46 4.4 CÁC QUY TRÌNH CỤ THỂ CHO NUÔI CẤY (CÁC PROTOCOLS) 48 4.5 TIÊU CHUẨN CHỌN MẪU MÔ THÍ NGHIỆM 54 4.6 TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ CHỌN NGUỒN MÔ MỤC TIÊU 55 4.7 TIÊU CHUẨN LOẠI TRỪ MẪU MÔ THÍ NGHIỆM 55 4.8 TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP, Trang Thử nghiệm phân lập ngun bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến MÔI TRƯỜNG ĐỂ LOẠI TRỪ 56 4.9 CÁC YẾU TỐ CẦN NGHIÊN CỨU 56 4.10 SỐ LẦN THÍ NGHIỆM 57 4.11 KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP THU THẬP SỐ LIỆU 57 4.12 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 57 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 58 5.1 THIẾT BỊ 58 5.2 DUÏNG CUÏ 59 5.3 HOÁ CHẤT 61 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN I KẾT QUẢ 63 KẾT QUẢ GHI NHẬN TRONG CÁC ĐT NUÔI CẤY 63 1.1 KEÁT QUẢ NUỐI CẤY SƠ CẤP 63 1.2 KẾT QUẢ NUÔI CẤY THỨ CẤP – CẤY CHUYỀN 65 1.3 HÌNH ẢNH GHI NHẬN ĐƯC TRONG CÁC ĐT NUÔI CẤY 66 SỐ LIỆU VÀ HÌNH ẢNH GHI NHẬN ĐƯC SAU KHI CẤY CHUYỀN 68 2.1 BẢNG SỐ LIỆU, VÀ HÌNH ẢNH (NGÀY 14/6) 68 2.2 BẢNG SỐ LIỆU, VÀ HÌNH ẢNH (NGÀY 15/6) 69 2.3 BẢNG SỐ LIỆU, VÀ HÌNH ẢNH (NGÀY 16/6) 71 2.4 BẢNG SỐ LIỆU, VÀ HÌNH ẢNH (NGÀY 17/6) 72 2.5 BẢNG SỐ LIỆU, VÀ HÌNH AÛNH (NGAØY 18/6) 74 2.6 BAÛNG SỐ LIỆU, VÀ HÌNH ẢNH (NGÀY 21/6) 75 II BÀN LUẬN 76 SO SAÙNH BẢNG SỐ LIỆU TRÊN CÙNG MÔI TRƯỜNG 76 SO SÁNH BẢNG SỐ LIỆU GIỬA CÁC MÔI TRƯỜNG 79 NHỮNG ĐIỂM KHÁC BIỆT CỦA CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỢNG ĐẾN KẾT QUẢ NUÔI 81 LÝ DO LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP VÀ KẾT LUẬN MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU TRONG BA MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG 82 Trang Thử nghiệm phân lập ngun bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ẢNH HƯỞNG ĐẾN KẾT Section 1.01 QUẢ TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM 85 NHỮNG THUẬN LI TRONG TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM 86 SO SÁNH HÌNH DẠNG CÁC LOẠI TẾ BÀO DẠNG NGUYÊN BÀO SI 87 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN 93 II KIẾN NGHỊ 94 Trang Thử nghiệm phân lập ngun bào sợi từ mô phơi người ĐẶT Tiền Văn Sến VẤN ĐỀ Từ có người tồn tại, người nhận thức tồn loài nhất, ban tặng khả tư sáng tạo vô tận số loài tồn tự nhiên tồn người thiêng liêng Mỗi người không lặp lại tồn lần thứ hai tiến trình lịch sử Và đó, bệnh tật-chết chóc thiên tai thứ đáng kinh hãi suốt trình tồn loài người từ thời sơ khai đến đời người Theo xu hướng chung, lúc người muốn tư duy, khám phá, chinh phục thiên nhiên Ngay tượng sinh lý tự nhiên diễn thân người Các tượng vạn vật xung quanh trở thành đối tượng vô tận để người tư Con người không ngừng lao động sáng tạo, từ đời sang đời khác Kết đáp lại cho công lao lao động ngàn đời khoa học tiên tiến đại Ngày nay, người có sống tiện nghi, có khả chế ngự thiên tai Với khoa học tiên tiến, đại, người sản xuất hàng loạt công cụ để cải tạo thiên nhiên, sản xuất lượng dư thừa sản phẩm phục vụ cho tiện ích Trong thời đại thông tin điện tử, Công nghệ Thông Tin giúp người cách xa hàng vạn dặm liên lạc nhìn thấy Dù có tài ba đến đâu, dù chịu chung số phận là: tuân theo qui luật sinh lý chung (sinh, lão, bệnh, tử) Và chân lý tồn người trái đất này, điều trái đất thể tồn thái dương hệ phải quay xung quanh mặt trời theo quỹ đạo định có chu kỳ Nhưng có lẽ giới hạn chân lý tồn người có giới hạn có nguy bị sụp đổ mà Di Truyền Học can thiệp đến tận nguồn gốc sống Trang Thử nghiệm phân lập ngun bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến Một Công Nghệ Sinh Học có bước đột phá, phát triển vượt bậc, tạo quan thay thế, sử dụng liệu pháp gen để chửa bệnh, sử dụng liệu pháp di truyền để cải thiện tuổi thọ người, lúc đó, bệnh tật chết chóc có lẽ, sửa, không nỗi kinh hoàng bao người, bao hệ Nhiều người, nhiều nhà khoa học giới kỳ vọng tốt đẹp Mỗi người có lẽ trạng thái hoài nghi, bàng hoàng lo lắng đến điều may rủi, nhiều mong đợi điều xảy Theo xu hướng phát triển tri thức chung giới, Công Nghệ Sinh HọÏc ngành khoa học phát triển kế tục ngành Công Nghệ Thông Tin , để phát triển mạnh mẽ ngành Công Nghệ Sinh HọÏc phải nhờ vào hỗ trợ đắc lực ngành Công Nghệ Thông Tin Trong giới hạn đỉnh cao Công Nghệ Thông Tin không ngừng tiệm cận Công Nghệ Sinh HọÏc chập chững bước Nhiều nước giới như: Mỹ, Pháp, Bỉ, … có bề dầy kinh nghiệm nghiên cứu đầu tư cho Công Nghệ Sinh HọÏc nửa kỷ Sử dụng công nghệ nuôi cấy tế bào động vật nuôi cấy tế bào người để phục vụ cho y học, sản xuất dược phẩm (insulin, interferon, …) thử thuốc Các nghiên cứu nuôi cấy nguyên bào sợi người thực thành công nước Mỹ, Pháp, Bỉ qua nuôi cấy tế bào nước ối, nuôi cấy tế bào da, gai nhau, mô thai sẩy [Beechm Group Ltd, GB1525022] Mọi thứ phải sơ khai nhất, từ biết, từ có, từ có thể, ngành khoa học ngiên cứu như: nuôi cấy tế bào động vật Nuôi cấy tế bào người chưa có thành tựu đáng kể Việt Nam Trang Thử nghiệm phân lập nguyên bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến Tế bào nguyên bào sợi người loại tế bào dễ dàng nuôi cấy so với loại tế bào khác loài Vả lại, có tiềm ứng dụng vô phong phú, như: + Là loại tế bào tiềm năng, biệt hóa, biệt hóa thành tế bào xương, ứng dụng trong sản xuất vật liệu cấy ghép +Sử dụng để nghiên cứu di truyền, sản xuất vacxin,… +Sử dụng để thu nhận tế bào mầm Vì lý đó, nguyên bào sợi người chọn làm đối tượng nghiên cứu Tuy nhiên, gần đây, nhờ vào việc áp dụng qui trình nghiên cứu nước ngoài, Việt Nam bước đầu thành công nuôi cấy, tế bào máu ngoại vi, tế bào ối…, nghiên cứu chuẩn hóa qui trình nuôi cấy, phân lập tạo dòng tế bào người chưa có nơi thực nghiên cứu thành công.(Ở Việt Nam) Bắt nguồn từ lý đó, lao vào tập nghiên cứu: Phương pháp nuôi cấy, phân lập tạo dòng Nguyên Bào Sợi từ phôi thai người Thực đề tài nhằm đạt mục tiêu sau: Trang Thử nghiệm phân lập ngun bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU MỤC TIÊU TỔNG QUÁT Nghiên cứu nuôi cấy tế bào Nguyên Bào Sợi từ phôi thai người Thử nghiệm nuôi cấy, phân lập tạo dòng nguyên bào sợi người từ phôi thai lấy từ bệnh viện phụ sản Từ Dũ 2.2 MỤC TIÊU CHUYÊN BIỆT: 1./ Xây dựng qui trình nuôi cấy Nguyên Bào Sợi người từ phôi thai Đánh giá hiệu nuôi cấy Nguyên bào sợi người ba môi trường: AMNIOMAX, EMEM, DMEM 3./ Xác định yếu tố liên quan đến trình nuôi cấy: biện pháp vô trùng, liều lượng môi trường… Trang Thử nghiệm phân lập ngun bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU LƯC SỬ NUÔI CẤY TẾ BÀO [15] * Giới thiệu chung nuôi cấy Nuôi cấy mô thực vào đầu kỷ 20 (Harrison 1907, Carrel 1912) phương pháp để nghiên cứu đặc tính tế bào động vật cách độc lập khỏi biến đổi hệ thống xảy thí nghiệm điều kiện bình thường có xuất stress Cũng tên gọi, kỹ thuật thực với mẫu mô, tốc độ tăng sinh chúng cha SSSäm Bởi nuôi cấy tế bào lúc bắt đầu lãnh vực chủ yếu 50 năm, tên gọi «nuôi cấy mô» dùng lónh vực mở rộng từ thập niên 1950 sử dụng tế bào nuôi cấy tách rời Harrison chọn ếch nguồn mô để nuôi cấy động vật biến nhiệt, không cần phải nuôi ủ Hơn nữa, tái tạo mô phổ biến động vật có xương sống bậc thấp, ông hi vọng phát triển chúng dễ dàng với mô động vật có vú Kỹ thuật ông gây nên sóng ý nuôi cấy mô in vitro, vài người thực sau theo ví dụ ông để lựa chọn đối tượng Sự thúc đẩy y học buộc người ta quan tâm đến loài động vật ổn nhiệt có trình phát triển bình thường bệnh lý gần giống với người Ban đầu phôi gà sử dụng nhiều sau loài gặm nhấm dễ nuôi mặt di truyền chọn làm đối tượng nghiên cứu Trong phôi gà cho nhiều dạng tế bào nuôi cấy sơ cấp, mô gặm nhấm thuận lợi việc tạo dòng tế bào liên tục Trang 10 Thử nghiệm phân lập nguyên bào sợi từ moâ phôi người Tiền Văn Sến 157.8 160 140 120 93.6 100 80 60 36.2 40 20 2.2 14/6 8.6 2.8 15/6 9.2 12 16.4 3.4 16/6 AMNIOMAXTM-C100 20% FBS *./ Nhận xét 9: 19.4 8.2 0.8 17/6 DMEM 20% AHS 22 3.4 18/6 1.4 21/6 EMEM 20%AHS Biểu đồ 10 (1).AMNOOMAX: Mật độ tế bào tăng theo thời gian đầu nuôi cấy Chỉ trừ kiện ngày 17/6, ngày thứ sau cấy chuyền, mật độ tế bào bị giảm đột ngột Ngay sau đó, thay môi trường, quan sát ngày mật độ tế bào không ngừng tăng lên Chứng tỏ loại môi trường liều lượng môi trường sử dụng cho cấy truyền nuôi cấy sơ cấp phù hợp, không đủ mật độ tế bào cao ( mọc bám 70% diện tích chai cấy), cần lưu ý tới đổi màu củamôi trường quan sát (2).DMEM: Mật độ tế bào tăng vòng – ngày đầu sau thay môi trường, chuyển qua ngày thứ ngày thứ kỳhạn thay môi trường tế bào bắt đầu có tượng suy thoái Chứng tỏ liều lượng 5ml DMEM ứng với ngày thay không phù hợp Cần thiết phải điều chỉnh lại ml môi trường DMEM vòng - ngày thay, có lẽ phù hợp Tốc độ mật độ tế bào mọc môi trường DMEM xa môi trường laiï; Có lẽ dinh dưỡng không phù hợp nhiều lý khác mà ta chưa không kiểm soát (3).EMEM: Mật độ tế bào không ngừng tăng theo thời gian đầu nuôi cấy trường hợp EMEM Môi trường phù hợp liều lượng môi trường sử dụng phù hợp nuôi cấy thứ cấp Trang 86 Thử nghiệm phân lập nguyên bào sợi từ moâ phơi người Tiền Văn Sến Những điểm khác biệt loại môi trường ảnh hưỡng đến kết nuôi AMNIOMAX: loại môi trường thương mại, dạng dịch lỏng, chuyên sử dụng để nuôi nguyên bào sợi từ nước ối [Phòng di ttuyền học , bệnh viện phụ sản Từ Dũ], có sử dụng chất bổ trợ, huyết (FBS) Môi trường AMNIOMAX phù hợp cho nuôi cấy sơ cấp nuôi cấy thứ cấp, môi trường nguyên bào sợi mọc tốt EMEM: loại môi trường thương mại, dạng dịch lỏng, bổ sung huyết (AHS), phù hợp cho nuôi cấy thứ cấp, tế bào mọc bám tốt có pha trộn thêm AMNIOMAX (tỉ lệ 1:4) EMEM không phù hợp cho nuôi cấy sơ cấp, có nhiều lý để giải thích cho điều này, có lẽ, chủ yếu liều lượng môi trường sử dụng so với nhu cầu sử dụng tế bào DMEM: môi trường thương mại, dạng bột, pha thành môi trường dạng lỏng, bổ sung huyết (AHS) DMEM không phù hợp cho nuôi cấy sơ cấp nuôi cấy thứ cấp, có nhiều lý để giải thích cho điều này, có lẽ, chủ yếu liều lượng môi trường sử dụng so với nhu cầu sử dụng tế bào Một điều minh chứng cụ thể cho khảng định: tế bào không mọc tốt môi trường (DMEM, EMEM) lý sử dụng liều lượng môi trường không phù hợp, không đủ dinh dưỡng cho tế bào sinh trưởng phát triển là: tác giả khác sử dụng loại môi trường này, cho kết tốt, liều lượng môi trường sử dụng 5ml môi trường ứng với 2ngày thay [29] Và bạn, nhóm nghiên cứu tế bào, bạn Nguyễn Lê Xuân Trường (0018200) nuôi thành công tế bào từ phôi thai chuột môi trướng DMEM 10% FBS, liều lượng sử dụng 6ml môi trường ứng với ngaøy thay Trang 87 Thử nghiệm phân lập ngun bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến Như vậy: Ở môi trường AMNIOMAX: Liều lượng 1ml AMNIOMAX ứng với ngày nuôi trường hợp: nuôi nguyên phát, nuôi từ dịch rửa, nuôi tế bào rời tách trypsin, phù hợp Ở môi trường bản: Liều lượng 1ml DMEM, 1ml EMEM ứng với ngày nuôi trường hợp nuôi nguyên phát, nuôi từ dịch rửa, không phù hợp, cần thiết phải tăng liều lượng lên từ – ml môi trường ngày nuôi, có lẽ phù hợp Ở môi trường bản: Liều lượng 1ml DMEM, 1ml EMEM ứng với ngày nuôi trường hợp nuôi tế bào rời tách trypsin tương đối phù hợp Do từ đầu ta sử dụng 5ml môi trương nên khoảng ngày đầu sau cấy, có tế bào mọc, ngày sau tế bào chết dần, có lẽ không đủ dinh dưỡng Lý lựa chọn phương pháp kết luận môi trường tối ưu ba môi trường sử dụng * Lý lựa chọn phương pháp nuôi cấy nguyên phát sau lần thí nghiệm tổng quát: Do phương pháp có ưu điểm chủ yếu trì lâu dài dòng tế bào sơ cấp để quan sát, so sánh ; có khuyết điểm mọc chậm chậm mọc từ – ngày so với phương pháp tách trypsin tách từ dịch rửa Tế bào nuôi phương pháp nguyên phát có khả chống chịu cao trước biến động môi trường như: mọc phát triển điều kiện CO2 5% ,và ủ 36,5oC tuần (9 ngày) Tế bào nuôi phương pháp nguyên phát mọc phát triển tốt sai kỳ hạn thay môi trường lên đến ba ngày Song song đó, phương pháp tách trypsin, từ đầu tế bào bị tác động hóa chất nên sau Trang 88 Thử nghiệm phân lập ngun bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến ba ngày sai kỳ hạn thay môi trường, dề lớp đơn tế bào bong chốc chết hầu hết, lại hai cụm lác đác vài tế bào Lưu ý, hầu hết khả chịu biến động diễn môi trường AMNIOMAXTM-C100 20% FBS Nuôi cấy tế bào từ dịch rửa, khả chịu biến động điều kiện môi trường nuôi cấy cao, bị tác động (stress) lần thứ hai, là, không thay môi trường kỳ hạn hầu hết lớp đơn mọc lan bong ra, chết, giống y trường hợp tách trypsin Và dù sau nữa, phương pháp nuôi cấy từ dịch rửa hình thức tiết kiệm, tận dụng nguồn mẫu điều kiện hoi mẫu thí nghiệm Và không lựa chọn đánh giá phương pháp tối ưu Ưu điểm phương pháp tách trypsin thu lượng lớn tế bào rời , nhanh mọc (biểu mọc sau 24 giờ) tốc độ mọc nhanh, đồng loạt, Các dòng tế bào phôi tách trypsin từ đầu thể đa dạng hình thái tế bào Trong nuôi nguyên phát nuôi từ dịch rửa, đa dạng dòng tế bào biểu hiện: mật độ tế bào mọc lan tỏa trở nên cao (từ 70% - 80%) ; bị tác động biến động môi trường như: không chỗ trống để mọc lan tỏa, nguồn dinh dưỡng cạn kiện dần đến mức độ hoi, bị tác động trypsin Vì lý nêu trên, điều kiện nghiên cứu mang tính chất mô tả thử nghiệm: khảo sát, mô tả, so sánh tế bào, nên phương pháp nuôi cấy nguyên phát lựa chọn để khảo nghiệm Mục đích cuối tiến trình thí nghiệm gồm ba cấp độ: Cấp độ 1: Nuôi cho tế bào mọc bám, lan rộng trì dòng tế bào phát triển giới hạn tuổi đời hệ chuùng Trang 89 Thử nghiệm phân lập nguyên bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến Cấp độ 2: Xác định tế bào mục tiêu để ghi nhận hình ảnh; xác nhận xác hình dạng, đặc điểm tế bào mục tiêu dạng nguyên bào sợi chai cấy – đối tượng cần phân lập để đến tạo dòng Cấp độ 3: Phân lập tạo dòng nguyên bào sợi Và cuối kết dừng lại mức chừng cấp độ hai Vì lý kinh phí thời gian hạn hẹp Bên cạnh thành công nuôi tế bào mọc theo mục tiêu đề ra, giữ tế bào đạt đến mật độ cao, 90% - 100% diện tích bề mặt chai nuôi cấy chuyền được; mọc tốt mà dấu hiệu bị nhiễm; song song có hạn chế định: + Chỉ nhận diện tế bào mức độ so sánh hình ảnh tế bào mục tiêu ghi nhận với tế bào nguyên bào sợi tác giả nước ghi nhận kính hiển vi điện tử quét hay khính hiển vi quang học, nhận diện thông qua khái niệm, định nghóa đặc điểm hình thái nguyên bào sợi trình quan sát mà không xác định chắn 100% mẫu nuôi cấy đâu nguyên bào sợi thông qua dấu ấn tế bào (bộ Kít thử marker bề mặt) Có nghóa kết thí nghiệm dừng lại mức độ khảo sát, so sánh, định tính mà không đạt đến mức độ định lượng Do đó, mật độ tế bào mục tiêu xác định môi trường nuôi cấy dừng lại mức độ tương đối, mục tiêu xác định tế bào bám đáy, tạo thành lớp đơn, có khả mọc đơn lẽ + Do số lần cấy truyền dừng lại mức độ n = 1, chưa tạo dòng tế bào nhất, số lượng độ dạng tế bào có giảm xuống có biến đổi có xuất dạng tế bào * Trong đợt nuôi cấy, kết thí nghiệm cho thấy, môi trường AMNIOMAX cho phép dòng tế bào mọc tốt, dòng tế bào nguyên Trang 90 Thử nghiệm phân lập nguyên bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến bào sợi Do từ đầu, chất môi trường, môi trường giàu dinh dưỡng, môi trường thương mại chuyên cho nuôi cấy nguyên bào sợi từ nước ối (15-16 tuần tuổi) để chẩn đoán bệnh di truyền thay nhi trước sinh [Phòng di truyền, bệnh viện Từ Dũ], nên tế bào mọc môi trường tốt, đặc biệt nuôi cấy sơ cấp Đó điều hiển nhiên, không để bàn cải, Nhưng điểm hạn chế đắc tiền Mục đích so sánh môi trường khảo sát xem: môi trường (như: DMEM, EMEM), có cho dòng tế bào, dòng nguyên bào sợi phát triển phát triển tốt hay không Để xem nuôi nguyên bào sợi mọc tốt môi trường tác giả khác giới nuôi cho mọc tốt hay không Và nguyên bào sợi mọc tốt môi trường cần liều lượng kỳ hạn thay môi trường tối ưu Nếu nuôi nguyên bào sợi mọc tốt hai môi trường từ tiết kiệm chi phí nuôi cấy, chi phí nghiên cứu, hạ giá thành sản phẩm trường hợp kết nghiên cứu tới ứng dụng sản xuất, tạo sản phẩm thương mại Nhưng từ đầu, xác định không liều lượng cần thiết kỳ hạn thay môi trường phù hợp tế bào sơ cấp mọc trì phát triển hai loại môi trường Với 1ml EMEM 1ml DMEM ứng với ngày nuôi thay môi trường ít, không đủ dinh dưỡng tế bào phát triển tăng trưởng Bằng chứng rõ ràng lần nuôi , từ đầu tế bào mọc tất loại môi trường, có dấu hiệu tăng trưởng, sau từ -7 ngày nuôi dấu hiệu phát triển chấm dứt tàn lụi hai loại môi trường Điều thể rõ ràng phương pháp nuôi nguyên phát nuôi từ dịch rửa, với cách áp dụng kiểu thay môi trường: ngày thay ml môi trường, ngày thay ml môi trường, … , ngày thay ml môi trường, trì cách thay: ml môi trường Trang 91 Thử nghiệm phân lập ngun bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến ngày sau thay, kết thúc mẫu thí nghiệm Chính lẽ đó, mà có môi trường AMNIOMAX môi trường giàu dinh dưỡng cho phép tế bào mọc bám , lan rộng, phát triển tiếp sau ngày nuôi cấy (tính từ ngày cấy) 5.Các yếu tố liên quan ảnh hưởng đến kết tiến trình thí nghiệm *./ Thiếu CO2 tuần nuôi cấy Trong thí nghiệm Đợt I, lần thứ nhất, mẫu chai cấy thiếu CO2 5% tiếp diễn ngày liên tiếp mà ủ nhiệt độ 36,5oC tế bào mọc bám phát triển tốt; đặc biệt chai nuôi nguyên phát dịch rửa Lý giải thích cho điều là: nuôi mô từ phương pháp nguyên phát từ dịch rửa, tế bào từ đầu không bị tác động bỡi hóa chất, khả cảm ứng chuyển dạng, khả đáp ứng với biến động môi trường nguyên vẹn màng tế bào Hơn nữa, nguyên bào sợi loại tế bào mọc bám tốt so với loại tế bào khác, thể , tế bào nguyên bào sợi đóng vai trò chủ yếu trình sử a chửa làm lành hóa vết thương [12],[13],[30] *./ Ảnh hưởng hóa chất Tiến hành khử trùng tủ nuôi cần phải để cách ly, để thóang tủ nuôi khoảng thời gian dài (ít tuần) sử dụng tủ nuôi ủ mẫu cấy Nếu không ảnh hưởng đến phát triển tế bào ủ tủ *./ Ảnh hưởng nguồn mẫu không ổn định Có lần cấy mà không thu phôi từ nguồn mẫu đem Như Đợt III lần Những thuận lợi tiến trình thí nghiệm Do mẫu lấy từ nguồn phôi thai thông qua mổ đường bụng điều kiện phòng vô trùng nên hạn chế gần 100% nguy nhiễm mẫu cấy từ nguồn mẫu lấy bệnh viện phụ sản Từ Dũ Trang 92 Thử nghiệm phân lập ngun bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến Do áp dụng qui trình vô trùng Ngân Hàng Mô thuộc Bộ môn Mô Phôi - Trung tâm Đào tạo Cán Bộ Y Tế Thành phố Hồ Chí Minh nên nguy nhiễm từ trình thao tác hạn chế kiểm soát Nhờ vào hai lý mà trình thí nghiệm Bộ môn Mô Phôi - Trung tâm Đào tạo Cán Bộ Y Tế Thành phố Hồ Chí Minh kiểm soát nhiễm suốt trình nuôi cấy So sánh hình dạng loại tế bào dạng nguyên bào sợi A./ So sánh đặc điểm hình thái tế bào nuôi cấy từ mô phôi người với tế bào nuôi cấy từ mô phôi chuột với tế bào nuôi cấy từ gai Hình 36: Ảnh tế bào từ phôi chuột Nguyễn Lê Xuân Trường (0018200) Hình 37: Ảnh tế bào từ phôi người, Đợt II lần Hình 38: Ảnh tế bào gai người Huỳnh Duy Thảo (0018168) Hình 39 : Ảnh tế bào từ phôi người, Trang 93 Đợt II laàn Thử nghiệm phân lập nguyên bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến B./ So sánh đặc điểm hình thái tế bào trung mô nuôi cấy với lọai tế bào khác với tế bào trung mô chụp kính hiển vi điện tử quét Hình 40: Ảnh tế bào trung mô [34] Hình 41: Ảnh dòng tế bào trung mô[39] Hình 42: Tế bào mục tiêu tế bào dạng đặc biệt Hình 43: Tế bào mục tiêu tế bào dạng đặc biệt Trang 94 Thử nghiệm phân lập ngun bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến Hình 44: Ảnh phát họa tế bào trung mô từ bì[21] Hình 45: Ảnh dạng tế bào đặc biệt Hình 46: Ảnh dạng tế bào đặc biệt Trang 95 Thử nghiệm phân lập nguyên bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến Hình 47: Ảnh dạng tế bào đặc biệt Hình 48: Ảnh dạng tế bào đặc biệt Trang 96 Thử nghiệm phân lập ngun bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến C./ So sánh đặc điểm hình thái nguyên bào sợi nuôi cấy với lọai tế bào khác với nguyên bào sợi chụp kính hiển vi điện tử quét Hình 49: Ảnh nguyên bào sợi Dưới kính hiển vi điện tử quét [10] Hình 51 : Ảnh nguyên bào sợi Sử dụng thu nhận tế bào mầm.[38] Hình 50: Ảnh nguyên bào sợi Hình 52: Ảnh nguyên bào sợi Trang 97 Thử nghiệm phân lập ngun bào sợi từ mô phơi người Hình 53: Tế bào sợi ghi nhận phác họa[9] Tiền Văn Sến Hình 54: Ảnh nguyên bào sợi phác họa ghi nhận[9] Hình 55: Ảnh nguyên bào sợi kính hiển vi điện tử.[10] Hình 56:Tế bào dạng nguyên bào sợi sau cấy chuyền Hình 57:Tế bào dạng nguyên bào sợi trước cấy chuyền Trang 98 Thử nghiệm phân lập ngun bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I./ KẾT LUẬN: Như vậy, kết nghiên cứu này, xác định số vấn đề cụ thể sau: Tai vòi chứa đựng thai tử cung, trình mổ nội soi thai non tháng ( tuần tuổi) mẫu mô khó xác định đại thể Có lần cấy mà mô mục tiêu (cấy không đối tượng nghiên cứu nên tế bào mọc) Điều dược xác định sau đem phần mẫu mô cắt lát khảo sát vi thể (như Đợt III lần 1) Trong ba phương pháp phương pháp nuôi nguyên phát mẫu mô phôi thai sau tách học, để tạo mảnh mô 1-3 mm3 , cho kết nuôi tốt so với hai phương pháp lại Thời gian tế bào sống phát triển trường hợp nuôi nguyên phát lâu so với hai phương pháp nuôi lại Trong loại môi trường nuôi: AMNIOMAX, DMEM, EMEM môi trường AMNIOMAX cho kết nuôi tốt trường hợp nuôi sơ cấp so với hai môi trường lại Còn trường hợp nuôi cấy thứ cấp môi trường EMEM cho kết nuôi không AMNOMAX Trong trình cấy chuyền, hai môi trường bản: DMEM, EMEM có pha thêm AMNIOMAX với tỉ lệ 1:4 AMNIOMAX có chứa huyết sử dụng để ức chế trypsin sau tế bào bị tác động lúc cấy chuyền Kết tế bào sau cấy chuyền mọc môi trường EMEM tốt môi trường DMEM ( hai có pha thêm AMNIOMAX, pha thêm lần cấp liệu môi trường lần đầu tiên), đồng thời tế bào mọc tốt trường hợp tế bào nuôi môi trường AMNIOMAX Trang 99 Thử nghiệm phân lập nguyên bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến Cho đến lúc kết thúc thí nghiệm, tế bào sau cấy chuyền phát triển tốt (chỉ trừ trường hợp nuôi môi trường DMEM) II ./ ĐỀ NGHỊ: Do bị giới hạn thời gian nên kết đạt khiêm tốn, để đạt kết cao để sâu vào hướng ứng dụng kết nuôi cấy vào thực tiễn, có số ý kiến để kiến nghị: Chuẩn hóa qui trình nuôi cấy, xác định thêm yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy kiểm nghiệm lại liều lượng môi trừơng đề cập đến phần thảo luận Thử nghiệm nuôi cấy để xác định lại liều lượng kỳ hạn thay môi trường tối ưu cho trường hợp nuôi sơ cấp thứ cấp hai loại môi trường bản:EMEM, DMEM Thử nghiệm nuôi Nguyên bào sợi từ nguồn khác để kiểm nghiệm lại khả phương pháp hạn chế nhiễm Thử nghiệm phân lập tạo dòng phương pháp cấy chuyền liên tục đồng thời so sánh với việc phân lập tạo dòng môi trường thạch, thực cấy truyền thu nhận nguyên bào sợi vòng rings Để từ đó, xác định mức độ ảnh hưởng hóa chất lên tế bào nuôi cấy sơ cấp tế bào sau cấy chuyền Kiểm nghiệm lại tính ưu việt pha trộn môi trường nuôi cấy: AMNIOMAX + EMEM (tỉ lệ 1:4) , pha trộn FBS AHS tác động, ảnh hưởng tốc độ tăng trưởng tế bào trình nuôi cấy sơ cấp thứ cấp Sử dụng dấu ấn tế bào để xác định nguyên bào sợi marker bề mặt, hóa huỳnh quang miễn dịch Trang 100 ... xuất nguyên bào tạo xương mô xương, tạo tế bào mỡ mô mỡ, tạo nguyên bào tạo sụn mô sụn Nguyên bào sợi nhìn thấy phần mặt nổi, nhìn từ xuống Trang 21 Thử nghiệm phân lập ngun bào sợi từ mô phơi người. .. QUÁT Nghiên cứu nuôi cấy tế bào Nguyên Bào Sợi từ phôi thai người Thử nghiệm nuôi cấy, phân lập tạo dòng nguyên bào sợi người từ phôi thai lấy từ bệnh viện phụ sản Từ Dũ 2.2 MỤC TIÊU CHUYÊN BIỆT:... nuôi cấy nguyên bào sợi từ da người bị bỏng 2.2 Sơ lược kinh nghiệm nuôi cấy nguyên bào sợi giới [15] Trang 11 Thử nghiệm phân lập nguyên bào sợi từ mô phơi người Tiền Văn Sến Ngoài môi trường