5.1 THIẾT BỊ.
Tủ cấy vơ trùng (Laminar Flow Class II – Nuaire, USA) Tủ nuơi (hiệu Heraeus instrument, Merck.)
Tủ ấm, Memmert
Nồi áp suất (SANYO labo autoclave ) pH kế (TOLEDO, Germany)
Máy khuấy từ gia nhiệt, HB 502 và cá từ. Máy ảnh (Olympus, Japan
Máy ảnh kỹ thuật số Máy sấy
Tủ lạnh thường (SANYO SR-9R Basic , high quality) Kính hiển vi quan sát đơi Leica(LEITZ LABORLUXS ) Kính hiển vi đảo ngược pha(Nikon Eclipse TE 300, Japan) Cân điện tử, Sartorious
Buồng đếm tế bào hồng cầu
Máy ly tâm KOKUSAN (TOKYO, KOKUSAN ENSINKI, JAPAN)
5.2. DỤNG CỤ:
Pipetteman 200 - 1000µL
Hình 20: Tủ nuơi
(Tủ ấm CO2) Hình 21: Quan sát mẩu dưới kính hiển vi soi ngược.
Hình 24: Kính hiển vi quan sát đơi Leica
Hình 23: Máy ly tâm Hình 22 : Máy khuấy từ gia nhiệt
Đầu típ vơ trùng Pipetteman nhựa
Pipette thủy tinh: 5ml – 0.05ml, 10ml – 0.1ml Bĩp cao su
Erlen 50ml, 100ml, 250ml Gịn khơng thấm
Đĩa petri
Becher 50ml, 100ml, 250ml Kéo nhọn và kéo thẳng (loại nhỏ) Pince cong và pince thẳng (loại nhỏ) Ống tiêm và kim tiêm
Lamelle và buồng đếm tế bào hồng cầu NEUBAUER Ống ly tâm
Bình xịt cồn và bình xịt nước cất
Bình kim loại chứa cồn đựng dụng cụ thao tác vơ trùng
Đèn cồn
Hộp quẹt
Khay rác
Quần áo bảo hộ vơ trùng và găng tay vơ trùng.
Hình 25: Đầu tuýp, Pippetteman, Buồng đếm tế bào hồng cầu. Hình 26: Hộp tuýp vơ trùng, Bình Roux, Ống ly tâm lớn và nhỏ, Ống tiêm
5.3.HỐ CHẤT
Dung dịch PBS(-).
Dung dịch trypsin 0.25%. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mơi trường AMNIOMAXTM-C100 Basal Medium, với L- Glutamine (Cat. No. 17001-082, Lot. No. 1145148, 90ml / 13.15 USD) cĩ bổ sung AMNIOMAXTM-C100 Supplement (Cat. No. 12556-015, 15 ml / 29.25 USD), (GIBCOBRL). Bổ sung 20% huyết thanh (FBS).
Mơi trường DMEM (DULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM), với L-Glutamine và 1000 mg Glucose/L, khơng cĩ Phenol Red và Sodium Bicarbonate. Product Number::D-2902 (SIGMA). Bổ sung 20% huyết thanh (AHS).
Mơi trường EMEM . Cĩ bổ sung huyết thanh 20% (AHS)
+ MEM with Hank’s Salts, with L-glutamine
+ Cat. No. 21575-022
+ Lot. No. 3073244. A. CHUẨN BỊ HỐ CHẤT
*./Chuẩn bị PBS(-) (Phosphate Buffered Saline free Ca2+ , Mg2+ .)
+ NaCl 10g. + KCl 0,25g + Na2HPO4.12H2O: 3,6g + K2HPO4 : 0,255g + Nước cất: đủ 1.000ml + Hấp khử trùng ở 125oC trong 30 phút. + Bảo quản lạnh ở 4oC.
*./ Chuẩn bị Trypsin 0,25% từ trypsin 1%.
+ Dùng PBS(-) đã được hấp khử trùng pha lỗng trypsin 1% với tỉ lệ: 40:10 , ta thu được 50ml trypsin 0,25%.
B. VƠ TRÙNG DỤNG CỤ VÀ HỐ CHẤT. *./ Dụng cụ
Dụng cụ bằng thuỷ tinh và kim loại được vơ trùng bằng cách hấp khử trùng hơi nước với autoclave (121oC 1atm trong 30 phút)
Dụng cụ nhựa lau, rửa nước thường, rối bằng cất hoặc lau cồn 70o, để khơ tự nhiên và chiếu đem chiếu xạ cho vào bao nilong giữ vơ trùng: chai cấy, đầu tuýp, ống ly tâm… trước khi sử dụng chiếu UV 30 phút.
*./ Hố chất.
Vơ trùng hĩa chất sự dụng bằng phin lọc (Filter) như: trypsin,
PBS(-),DMEM, Huyết thanh.
Dùng mơi trường cao thịt pepton và mơi trường thạch máu để kiểm tra độ vơ trùng của dung dịch và mơi trường nuơi và hĩa chất sau khi pha.
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.
I. ./. KẾT QUẢ:
Từ 9/3 đến 21/6/2004 : Chúng tơi đã thực hiện và thu được kết quả như sau:
1. Tĩm tắt kết sơ lược quả thu được trong tiến trình thí nghiệm. 1.1./ Kết quả nuối cấy sơ cấp.
+ Đợt I: Tại phịng Di Truyền Học – Bệnh viện Phụ sản Từ Dũ. Hai lần thử nghiệm tổng quát: So sánh ba phương pháp, và so sánh ba mơi trường:
*./ Lần thứ nhất (9/3):
Nuơi thành cơng, tế bào mọc bám rất tốt, chỉ 24 giờ sau khi cấy đã cĩ xuất hiện lác đác những 5 tế bào đơn dạng nguyên bào sợi trong trường hợp nuơi nguyên phát và nuơi từ dịch rửa. Tế bào mọc bám tốt nhất là nuơi cấy nguyên phát và nuơi từ dịch rửa, duy trì mẫu nuơi để quan sát được khoảng 30 ngày (đến ngày 9/4) kể từ ngày cấy, rồi bỏ.
*./ Lần thứ hai (23/3):
Cĩ tế bào mọc bám trên cả ba phương pháp và ba loại mơi trường nhưng đến ngày thứ ba sau khi cấy dấu hiệu nhiễm đã thể hiện: mơi trường trong chai cấy bị đổi màu nhanh chĩng, trở nên đục, quan sát mẫu thấy lút nhút vi sinh vật, ghi nhận hình ảnh bị nhiểm xong rồi bỏ.
+ Đợt II: Tại phịng Mơ Phơi – Trung tâm Đào tạo Cán Bộ Y Tế Thành phố Hồ Chí Minh. Hai lần thử nghiệm tổng quát: So sánh ba phương pháp, và so sánh ba mơi trường:
*./ Lần thứ nhất (27/4): (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khơng cĩ dấu hiệu mọc, mà chỉ thấy cĩ mơ bám đáy chai, quan sát đến ngày 6/5 khơng thấy cĩ dấu hiệu mọc, rồi bỏ.
*./ Lần thứ hai (8/5):
Nuơi thành cơng, tế bào ở cả ba phương pháp đều mọc rất tốt: Tế bào mục tiêu (Nguyên bào sợi) biểu hiện mọc rõ ràng chỉ sau 24 giờ nuơi (tách bằng trypsin). Trường hợp mẫu nuơi từ dịch tách bằng trypsin, với mật độ tế bào nuơi ban đầu từ khoảng: 106 – 107 tế bào/ ml, tế bào mọc bám rất tốt sau 24 giờ. Cịn nếu mật độ tế bào khơng đạt yêu cầu, tức là dưới 106 tế bào/ ml thì khoảng từ 2 – 3 ngày sau mới cĩ biểu hiện mọc. Ở đây, tế bào mục tiêu biểu hiện mọc rõ ràng vào khoảng ba ngày sau khi cấy (trường hợp mẫu nuơi nguyên phát và nuơi từ dịch rửa); mọc tốt nhất là:
Ở chai :AMNIOMAX – trypsin, 9 ngày sau khi cấy (17/5) tế bào phát triển mạnh nhất chiếm từ 80% - 90% diện tích bề mặt chai cấy, đến ngày 21/5 cĩ dấu hiệu tế bào chết, duy trì được đến ngày 7/6, cịn lại lác đác vài tế bào dạng hình cầu (trịn) ;
Và ở chai: AMNIOMAX – nguyên phát, 13 ngày sau khi cấy (21/5) tế bào mọc lan ra từ các mảnh mơ chiếm đầy diện tích bề mặt chai cấy khoảng 70% - 80% , và tăng lên đến khoảng 90% - 100% diện tích bề mặt chai cấy (10/6) và thời điểm cĩ xuất hiện nhiều tế bào mới mọc lan ra: dạng hình trịn (dạng cầu) hay hình dài (dạng que) và cĩ cả dạng tế bào phân ra nhiều nhánh ( 2, 3, hoặc 4 nhánh ), ngày 11/6 ghi nhận hình ảnh lần cuối. Đến ngày 12/6, thực hiện cấy truyền từ chai AMNIOMAX – nguyên phát ra ba loại mơi trường, đếm mật độ tế bào/ quang trường 10X, quan sát từng ngày và ghi nhận hình ảnh minh họa.
+ Đợt III: Tại phịng Mơ Phơi – Trung tâm Đào tạo Cán Bộ Y Tế Thành phố Hồ Chí Minh. Hai lần thử nghiệm trên một phương pháp, so sánh ba mơi trường.
Quan sát từng ngày, cứ cách 24 giờ quan sát một lần, đến ngày 7/6 vẫn cũng chỉ thấy cĩ mơ bám mà khơng cĩ tế bào mọc. Cho đến ngày 13/6, quan sát thấy vài tế bào mọc lan ra từ mảnh mơ, khi quan sát tồn diện bề mặt chai cấy thấy khơng quá 50 tế bào và mọc lan ra từ một mảnh mơ duy nhất, các mảnh mơ cịn khơng cĩ biểu hiện mọc, và cĩ một dạng tế bào duy nhất dạng hình que, quan sát đến ngày 15/6 khơng cĩ biểu hiện gì đặc biệt, rồi bỏ.
*./ Lần thứ hai (15/6):
Nuơi cấy trên giếng, sau 24 giờ quan sát trên cả ba mơi trường cĩ lác đác vài tế bào mọc lan ra từ mơ, số lượng tế bào cĩ chiều hướng gia tăng. Quan sát thí nghiệm, ghi nhận hình ảnh lần cuối và đồng thới chấm dứt cả tiến trình thí nghiệm.
1.2. Kết quả nuơi cấy thứ cấp – cấy chuyền.
Thực hiện cấy chuyền từ chai cấy AMNIOMAX – nguyên phát ra ba loại mơi trường: AMNIOMAX, DMEM, EMEM cĩ bổ sung 20% huyết thanh. Sau 24 giờ, và cứ cách 24 giờ quan sát mẫu, đếm mật độ tế bào tại 5 vị trí trên chai cấy rồi lấy giá trị trung bình ở quang trường 10X. Ghi nhận hình ảnh của ba chai ở mỗi lần quan sát. Rồi chấm dứt thí nghiệm.
Mật độ tế bào khi tách bằng trypsin, trước khi cấy chuyền vào chai cấy mới (trước pha lỗng) là: 4,35.106 tế bào/ ml.
*./ Cách tính: Số tế bào đếm trong 5 ơ lớn:[Phụ lục B] A = 7; B = 10; C = 17; D = 10; E = 14. N = 7 + 10 + 17 + 10 + 14 = 58 tế bào/ 5 ơ lớn. N’ = 5*58 = 290 tế bào/buồng đếm. Mật độ tế bào/1ml: C = 290*104 tế bào/1ml. Với độ pha lỗng a = 1,5 lần thì: C’ = 1,5*290*104 = 4,35*106 tế bào/1ml.
*./ Pha lỗng để đủ thể tích cho vào ba chai cấy: Sử dụng 1,5 ml AMNIOMAXTM-C100 20% FBS là mơi trường dinh dưỡng cao, cĩ thành phần bổ trợ, cĩ chứa huyết thanh để ức chế trypsin trong lúc cấy truyền. Đem đếm mật độ cĩ: C’ = 4,35*106 tế bào/1ml. Bổ sung thêm 1,5 ml AMNIOMAXTM- C100 20% FBS nữa để được 3ml và chia đều cho ba chai cấy như sau:
+ Chai AMNIOMAX: 1ml dịch huyền phù (cĩ FBS) + 4ml AMNIOMAXTM-C100 20% FBS.
+ Chai DMEM: 1ml dịch huyền phù (cĩ FBS) + 4 ml DMEM 20% AHS.
+ Chai EMEM: 1ml dịch huyền phù (cĩ FBS) + 4 ml EMEM 20% AHS.
*./ Mật độ ở mỗi chai sau pha lỗng đem nuơi là:
C’’ = n/v = (0.5*4,35*106 / 5) = 0,435*106 (tế bào/5ml mơi trường). *./ Sau 24 giờ, sau khi cấy truyền (13/5), quan sát chỉ thấy lác đác vài tế bào ở cả ba chai; Cách 48 giờ (14/5) sau khi cấy truyền số lượng tế bào trên quang trường 10X, bắt đầu tăng lên đáng kể, bắt đầu quan sát và đếm mật độ. 1.3. Hình ảnh ghi nhận được trong các đợt nuơi cấy.
*./ Đợt I: Các hình ảnh tế bào nuơi cấy mọc lan ra mơ nguyên phát lần 1 đợt I.
Trang 73
*./ Đợt II: Các hình ảnh tế bào nuơi cấy mọc lan ra mơ nguyên phát lần 2 đợt II.
Trang 74
14.6
35%
16% 49%
AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEM 20% AHS EMEM 20% AHS
*./ Đợt III: Các hình ảnh tế bào nuơi cấy mọc lan ra mơ nguyên phát lần 2 đợt III.
2. SỐ LIỆU VÀ HÌNH ẢNH GHI NHẬN ĐƯỢC SAU KHI CẤY TRUYỀN. 2.1.Bảng số liệu, và hình ảnh (ngày 14/6) 2.1.Bảng số liệu, và hình ảnh (ngày 14/6)
Bảng 3: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vị trí trên chai / Mơi trường AMNIOMAX DMEM EMEM
1 4 1 4
2 2 0 2
3 1 1 3
4 1 1 4
5 3 2 2
Mật độ trung bình/quang trường 10X 2,2 1 3
Hình 29: Ảnh tế bào lan ra tư ø mơ, nuơi cấy sơ cấp
*./ Các ảnh minh họa cho các tế bào sau cấy chuyền, quan sát ngày 14/6. Thứ tự ảnh: A-D-E. (Ứng với: AMNIOMAX-DMEM-EMEM).
Hình 30: Ảnh nuơi cấy thứ cấp, 14/6: A-D-E
2.2. Bảng số liệu, và hình ảnh (ngày 15/6) Bảng 4:
Vị trí trên chai / Mơi trường AMNIOMAX DMEM EMEM
1 10 3 4
2 4 2 5
3 9 2 12
4 11 3 7
5 9 4 18
Mật độ trung bình/quang trường 10X 8,6 2,8 9,2
*./ Nhận xét 1:
Ngày đầu (14/6), số lượng tế bào đếm được ở trên ba mơi trường, cĩ độ chênh lệch khơng cao. Nhìn tổng thể, tế bào mọc trên các chai cấy là rất chậm (đã sau 48 giờ sau khi cấy chuyền), cĩ lẽ mật độ tế bào đem cấy chuyền khơng đạt tỉ lệ như yêu cầu (106 – 107). Nhưng tế bào mọïc bám trên mơi trường EMEM 20%AHS thì nhiều hơn so với hai mơi trường cịn lại, số lượng tế bào mọc trên mơi trường DMEM 20%FBS là ít nhất.
*./ Các ảnh minh họa cho các tế bào sau cấy chuyền, quan sát ngày 15/6. Thứ tự ảnh: A-D-E. (Ứng với: AMNIOMAX-DMEM-EMEM).
Hình 31: Ảnh nuơi cấy thứ cấp, 15/6: A-D-E *. Nhận xét 2:
Ngày 15/6, cách sau 72 giờ sau khi cấy chuyền. Mật độ tế bào trên quang trường 10X ở trường hợp mơi trường: AMNIOMAX và EMEM tăng lên rất đáng kể; duy chỉ mật độ tế bào trên quang trường 10X ở DMEM tăng lên rất chậm. Biểu đồ 2: 15.6 42% 14% 44%
2.3./ Bảng Số Liệu Và Hình Aûnh (Ngày 16/6) Bảng 5:
Biểu đồ 3
*./ Các ảnh minh họa cho các tế bào sau cấy chuyền, quan sát ngày 16/6. Thứ tự ảnh: A-D-E. (Ứng với: AMNIOMAX-DMEM-EMEM).
16.6
38%
11% 51%
AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEM 20% AHS EMEM 20% AHS (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
*./ Nhận xét 3:
Ngày 16/6, cách sau 96 giờ sau khi cấy chuyền. Mật độ tế bào ở cả ba chai cấy đều tăng lên, nhiều nhất là mật độ tế bào trên mơi trường EMEM, kế đến là ở mơi trường AMNIOMAX, mật độ tế bào tăng ít nhất là ở mơi trường DMEM.
Vị trí trên chai / Mơi trường AMNIOMAX DMEM EMEM
1 15 4 16
2 7 3 15
3 12 4 20
4 13 3 13
5 13 3 18
Hình 32: Ảnh nuơi cấy thứ cấp, 16/6: A-D-E 2.4./ Bảng Số Liệu Và Hình Aûnh (Ngày 17/6)
Bảng 6 Biểu đồ 4 17.6 29% 3% 68%
AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEM 20% AHS EMEM 20% AHS
*./ Quan sát xong, rồi thay mơi trường cho ba chai cấy truyền vào ngày 17/6.
Vị trí trên chai / Mơi trường AMNIOMAX DMEM EMEM
1 9 1 30
2 6 0 12
3 7 0 21
4 9 2 17
5 10 1 17
*./ Các ảnh minh họa cho các tế bào sau cấy chuyền, quan sát ngày 17/6. Thứ tự ảnh: A-D-E. (Ứng với: AMNIOMAX-DMEM-EMEM).
Hình 33: Ảnh nuơi cấy thứ cấp, 17/6: A-D-E *./ Nhân xét 4:
Ngày 17/6, cách sau 120 giờ sau khi cấy chuyền (tức là cách 5 ngày sau khi cấy chuyền, đến ngày cuối cùng của kỳ hạn thay mơi trường). Mật độ tế bào trên quang trường 10X ở mơi trường EMEM tăng lên, vượt trội. Trong khi đĩ mật độ tế bào trên quang trường 10X ở hai mơi trường: AMNIOMAX, DMEM giảm so với 24 giờ trước đĩ, cĩ lẽ do cạn kiệt nguồn dinh dưỡng mà chưa được bổ sung, và cộng thêm mơi trường trở nên cũ cũng là một nguyên nhân gĩp phần gây ảnh hưởng đến sự giảm xúc mật độ ở hai trường hợp trên. Cịn trường hợp, trên mơi trường EMEM cĩ nguồn dinh dưỡng dồi dào hơn mơi trường DMEM cĩ thể là do sự pha trộn giữa: 1ml AMNIOMAX và 4ml EMEM và đồng thời sử dụng huyết thanh người (AHS) làm chất bổ trợ trong mơi trường EMEM. Khi pha trộn hai mơi trường trên lại với nhau đồng nghĩa với sự kết hợp đồng thời hai hỗn hợp bổ trợ: FBS và AHS trong cùng một mơi trường. Cĩ lẽ, vì lẽ đĩ mà hỗn hợp các dịng tế bào, trong đĩ cĩ nguyên bào sợi phát triển rất tốt và tế bào mọc bám vượt trội trên EMEM được pha trộn, tốt hơn so với ngay cả tế bào mọc tên mơi trường AMNIOMAX.
2.5./ Bảng Số Liệu Và Hình Aûnh (Ngày 18/6) Bảng 7:
*./ Các ảnh minh họa cho các tế bào sau cấy chuyền, quan sát ngày 18/6. Thứ tự ảnh: A-D-E. (Ứng với: AMNIOMAX-DMEM-EMEM).
18.6
36% 6%
58%
AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEMAH% AHS EMEM 20% AHS
*./ Nhận xét 5:
Ngày 18/6, tức là cách 1 ngày (24 giờ) sau khi thay mơi trường. Mật độ tế bào trên quang trường 10X ở cả ba mơi trường tiếp tục tăng so với ngày 1 trước đĩ (cách đĩ 24 giờ). Tế bào được phục hồi khả năng tăng sinh, do đĩ mật độ tế bào trên quang trường 10X ở mơi trường: AMNIOMAX, DMEM tăng lên mà khơng bị giảm xuống tiếp tục. Cịn mật độ tế bào trên quang trường 10X ở EMEM thì khơng ngừng được nhân lên.
Vị trí trên chai / Mơi trường AMNIOMAX DMEM EMEM (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1 17 2 45
2 17 4 22
3 25 4 37
4 35 5 44
5 16 2 33
Mật độ trung bình/quang trường 10X 22 3,4 36,2
Hình 34: Ảnh nuơi cấy sơ cấp, 18/6: A-D-E 2.6./ Bảng Số Liệu Và Hình Aûnh (Ngày 21/6)
Bảng 8: Biểu đồ 6 21.6 37% 1% 62%
AMNIOMAXTM-C100 20% FBS DMEM 20% AHS EMEM 20% AHS
Vị trí trên chai / Mơi trường AMNIOMAX DMEM EMEM
1 21 1 39
2 400 1 100
3 13 1 200
4 23 2 150
5 11 2 300
Mơi trường 14/6 15/6 16/6 17/6 18/6 21/6 AMNIOMAX 2,2 8,6 12 8,2 22 93,6
*./ Các ảnh minh họa cho các tế bào sau cấy chuyền, quan sát ngày 21/6. Thứ tự ảnh: A-D-E. (Ứng với: AMNIOMAX-DMEM-EMEM).
II. BÀN LUẬN:
1. So sánh bảng số liệu trên cùng mơi trườngA. Trên Cùng Mơi Trường: Amniomax.