4. CÁC QUI TRÌNH CHÍNH ĐƯỢC SỬ DỤNG
4.4. CÁC QUY TRÌNH CỤ THỂ CHO NUƠI CẤY
[32].
A./ Protocol nuơi cấy sơ cấp trên ba mơi trường cho mỗi phương pháp:
+ AMNIOMAXTM-C100 20% FBS
+ DMEM 20% AHS
+ EMEM 20% AHS
Đã sử dụng ba phương trong nuơi cấy sơ cấp nuơi cấy sơ cấp: (1)nuơi cấy mơ (cắt bằng cơ học); (2)nuơi cấy mơ + tế bào rời (cắt bằng cơ học:dịch rửa); (3)nuơi cấy tế bào rời (tách bằng trypsin 25%, trong 30 phút). *./ Các bước thao tác chung:
Thu lấy phơi thai ngồi chứa trong tai vịi (hoặc một phần mơ phơi) từ phịng mổ vơ trùng, cho vào chai nhựa nhỏ vơ trùng chứa 5ml mơi trường EMEM.
1./ Mẫu thu được trên đường vận chuyển về được bảo quản lạnh trong thùng đựng cĩ chứa nước đá.
2./ Chuyển mẫu vào tủ cấy vơ trùng đã được chuẩn bị đầy đủ dụng cụ thao tác vơ trùng, đựng mẫu trong đĩa Petri chứa 5-10 ml PBS(-). Lọc rửa tai vịi cho sạch máu. Rồi chuyển sang đĩa Petri khác cĩ chứa 5-10 ml PBS(-) để mổ tách lấy phơi.
3./ Vi phẩu tai vịi, thu phơi thai. Rửa mẫu từ 2 – 3 lần cho sạch máu. Rồi chuyển sang đĩa Petri khác cĩ chứa một ít PBS(-) khoảng từ 2 – 3 ml. 4./ Cắt nhuyễn sao cho mẫu mơ thu được cĩ kích thước từ 1 đến 3 mm3 bằng kéo nhỏ và pince cong.
1 / Dùng pipette nhựa hút dịch rửa, chia đều cho mỗi ống ly tâm, mỗi ống 1ml dịch rửa.
2/ Đem ly tâm 1000 vịng/phút trong 10 phút.
3/ Mười phút sau, hút bỏ dịch trong bên trên bằng pipette nhựa, thu cặn.
4/ Huyền phù cặn bằng mơi trường tương ứng với mỗi ống: + Ống 1: 1ml AMNIOMAXTM-C100 20% FBS
+ Ống 2: 1ml DMEM 20% AHS
+ Ống 3: 1 ml EMEM 20% AHS
5/ Rồi đem ủ trong tủ nuơi ở 36,5 oC với 5% CO2
6/ Sau 24 giờ, quan sát, và thêm 3ml mơi trường mỗi loại cho mỗi chai nuơi.
7/ Quan sát mẫu định kỳ, cách 24 giờ quan sát 1 lần, theo dõi hiện tượng ghi nhận số liệu.
8/ Kỳ hạn thay mơi trường: 1ml ứng với 1 ngày sau thay; 3 ml ứng với 3 ngày sau mới thay mơi trường.
A.2./ Nuơi cấy tế bào rời (tách bằng trypsin 25%, trong 30 phút).
1/ Chọn mẫu mơ cĩ kích thước trội nhất (từ 2 – 3 mm3) cho vào erlen loại 20 ml cĩ chứa sẳn cá từ. Rồi bổ sung 10 ml trypsin 0,25%.
2/ Đem khuấy từ gia nhiệt: 200 vịng/phút, trong 15 phút, ở 36oC . 3/ Mười lăm phút sau, đem dịch tách trypsin chứa trong erlen vào tủ cấy, để yên cho cặn lắng, dùng pipette nhựa rút dịch trypsin trong cĩ chứa tế bào rời vừa được tách ra, cho vào ống li tâm; khi đĩ, mẫu tách trypsin gồm hai phần:
+ Phần cặn (nếu cịn dư): Bổ sung thêm 10 ml trypsin 0.25% vào erlen chứa cặn. Đem khuấy từ gia nhiệt: 200 vịng/phút, trong 15 phút, ở 36oC. Phịng khi mật độ khơng đạt yêu cầu: khi mật độ dưới 106 tế bào/1ml dịch.
+ Phần dịch trong: Đem ly tâm 1000 vịng/phút trong 10 phút. Bỏ dịch trong bằng cách dùng pipette nhựa, thu cặn tế bào sau li tâm, huyền phù cặn trong 2 ml EMEM 20% AHS bằng pipetteman. Rút một ít dịch cho vào buồng đếm, đem đếm, phần dịch tế bào cịn lại ủ lạnh ở 4oC.
+ Nếu mật độ đạt yêu cầu: khi mật độ trên khoảng 106 – 107 tế bào/1ml thì pha lỗng đem nuơi.[Cách pha lỗng:phụ lục]
+ Nếu mật độ khơng đạt yêu cầu, đem dịch tách trypsin lần hai cho vào tủ cấy, để yên cho cặn lắng, thu lấy dịch trong, ly tâm 1000 vịng/phút trong 10 phút. Bỏ dịch trong bằng cách dùng pipette nhựa, thu cặn tế bào sau li tâm, huyền phù cặn trong 1,5 ml huyết thanh bằng pipetteman. Hịa nhập hai dịch tế bào rời với nhau đem đếm.
Lưu ý: Thường thì sử dụng mơi trường đem nuơi cĩ chứa huyết thanh (FBS, AHS) hoặc mơi trường cơ bản (cĩ thành phần dinh dưỡng thấp nhất) cĩ chứa huyết thanh để lưu trữ cặn tế bào rời sau khi ly tâm từ dịch tách trypsin. Ở đây, ta sử dụng mơi trường EMEM để lưu trữ trong khi chờ đợi, đem dịch cặn tách được đi đếm mật độ tế bào; hoặc trong khi chờ tách tiếp lần hai. Vì ta đang thử nghiệm cấy mẫu trên ba loại mơi trường ba khác nhau nên sử dụng mơi trường dinh dưỡng kém (cơ bản) thì sẽ ít ảnh hưởng đến kết quả so sánh hơn.
4/ Xong, tính tốn mật độ, rồi pha lỗng mật độ tế bào để đạt được mật độ là: 106 – 107 tế bào/1ml. Tổng thể tích dịch mơi trường cĩ chứa mật độ tế bào đã được pha lỗng đạt chuẩn (106 – 107 tế bào/1ml) là: 5ml. Thực hiện pha lỗng dịch trong mỗi mơi trường ứng với mỗi chai nuơi, để đưa vào ba chai nuơi ( bình roux):
+ Bình roux 1: 5ml dịch AMNIOMAXTM-C100 20% FBS (cĩ chứa mật độ tế bào đạt chuẩn)
+ Bình roux 2: 5ml dịch DMEM 20% AHS (cĩ chứa mật độ tế bào đạt chuẩn)
+ Bình roux 3: 5ml dịch EMEM 20% AHS (cĩ chứa mật độ tế bào đạt chuẩn)
5/ Rồi đem ủ trong tủ nuơi ở 36,5 oC với 5% CO2
6/ Sau 24 giờ, quan sát, và thêm 5 ml mơi trường mỗi loại cho mỗi chai nuơi.
7/ Quan sát mẫu định kỳ, cách 24 giờ quan sát 1 lần, theo dõi hiện tượng ghi nhận số liệu.
8/ Kỳ hạn thay mơi trường: 1ml ứng với 1 ngày sau thay; 3 ml ứng với 3 ngày sau mới thay mơi trường.
A.3./ Nuơi cấy mơ (cắt bằng cơ học)
Gấp chọn mẫu mơ cĩ kích thước nhỏ (từ 1 – 2 mm3) bằng pince cong cho vào mỗi bình Roux loại 25 cm2 đã được bổ sung sẳn 1ml mơi trường cĩ chứa huyết thanh, với số lượng mơ yêu cầu là: 20 – 30 mẫu mơ/chai cấy loại 25 cm2.
+ Bình 1: 1ml AMNIOMAXTM-C100 20% FBS
+ Bình 2: 1ml DMEM 20% AHS + Bình 3: 1 ml EMEM 20% AHS
1./ Rồi đem ủ trong tủ nuơi ở 37 oC với 5% CO2
2./ Sau 24 giờ, quan sát, và thêm 3ml mơi trường mỗi loại cho mỗi chai nuơi.
3./ Quan sát mẫu định kỳ, cách 24 giờ quan sát 1 lần, theo dõi hiện tượng ghi nhận số liệu.
4./ Kỳ hạn thay mơi trường: 1ml ứng với 1 ngày sau thay; 3ml ứng với 3 ngày sau mới thay.
Lưu ý: Khi tế bào mọc lan rộng từ: 50 – 90% diện tích bề mặt chai nuơi, nên thay mơi trường mỗi lần là: 5 ml, áp dụng cho cả ba phương pháp cho cả ba phương pháp.
*/ Phương pháp đếm mật độ tế bào trong buồng đếm hồng cầu.
+ Đếm mật độ tế bào trong buồng đếm hồng cầu loại : 25 ơ lớn.
*./ Quy tắc đếm: Đếm tế bào trong mỗi ơ lớn theo phương pháp: Cận rìa trên- trái thì đếm, áp dụng cho cả 5 ơ đếm; Cận rìa phải-dưới thì bỏ, khơng đếm.
+ Đếm số tế bào trên buồng đếm ở các vị trí: A, B, C, D, E. Ví dụ: A = 28; B = 34; C = 30; D = 34; E = 32. + Tính tổng số tế bào đếm được trong buồng đếm.
N = 28 + 34 + 30 + 34 + 32 = 160 tế bào rời. +Số tế bào trung bình đếm được trong một ơ lớn.
A B
E
n = 160 / 5 = 32 tế bào/ 1 ơ lớn.
+ Một ơ lớn cĩ 16 ơ nhỏ, mỗi ơ nhỏ cĩ thể tích Vn = 1/4000 mm3. + Số tế bào trung bình đếm được trong một ơ nhỏ.
n’ = 32/ 16 = 2 tế bào / 1 ơ nhỏ.
+ Mật độ tế bào cĩ trong 1ml (1ml = 1000 mm3 ) dịch huyền phù là: C = n / V =( 2 / (1/4000))*1000 = 8.106 tế bào/1ml.
+ Trong trường hợp dịch huyền phù sử dụng lớn hơn 1ml, chẳng hạn a ml thì lấy kết quả vừa tìm được nhân cho a lần.
+ Mật độ tế bào là: a*8.106 tế bào/1ml.
+ Cĩ một cách tính mật độ nhanh hơn cũng cho ra kết quả tương tự:[Phụ lục]
C = N*5*104. tế bào/ml.
+ Trong trường hợp dịch huyền phù sử dụng lớn hơn 1ml, chẳng hạn a ml thì lấy kết quả vừa tìm được nhân cho b lần.
C = b*N*5*104. tế bào/ml.
*/ Phương pháp pha lỗng:
+ Pha lỗng dịch tế bào tách được với mơi trường nuơi. Với mật độ yêu cầu là: 106 – 107 tế bào/ml.
+ Sử dụng phương pháp pha lỗng bậc 10, với tỉ lệ là: 1ml dịch cộng 9ml dịch mơi trường.
B./ Protocol nuơi cấy thứ cấp – cấy truyền.
*./ Chọn biện pháp tách tế bào nuơi sơ cấp bằng trypsin rồi cấy truyền.
1./ Cần thiết đốt sơ bằng đèn cồn trước khi thao tác cấy truyền.
2./ Đổ bỏ mơi trường cũ trong bình roux cĩ tế bào sơ cấp bám đáy (vào bercher đựng nước thải).
3./ Dùng pipette hút 2ml PBS(-) cho vào roux, lắc nhẹ để rửa sạch tế bào chết và huyết thanh, đổ bỏ PBS(-), lập lại 2 lần.
4./ Dùng pipette khác hút 2ml trypsin cho vào bình roux. Để bình roux trên lịng bàn tay, lắc nhẹ qua lại khoảng 50 lần (chú ý khơng để nắp bình roux chạm tay).
5./ Đổ bỏ trypsin, cầm bình roux bằng tay phải và vổ nhẹ vào lịng bàn tay trái để tế bào tách khỏi vách bình roux.
6./ Hút 3ml AMNIOMAXTM-C100 cho vào bình roux, tráng đều lên bề mặt bình roux cĩ tế bào.
7./ Hút vào mỗi bình roux mới bình 4ml mơi trường AMNIOMAXTM- C100 20% FBS, 4ml mơi trường DMEM 20% AHS, 4ml mơi trường DMEM 20% FBS.
8./ Dùng pipette 1ml gắn vào bĩp cao su (loại nhỏ) hút sục mơi trường phun đều vào bề mặt bình roux cĩ tế bào để huyền phù tế bào.
9./ Hút vào mỗi bình roux mới 1ml dịch huyền phù tế bào. Tổng cộâng dịch chứa trong mỗi bình roux mới là: 5ml mơi trường cĩ chứa tế bào. Lắc nhẹ, ủ ở 36,5oC trong tủ nuơi.
10./ Sau 48 giờ, đổ bỏ mơi trường cũ cho vào bình roux 5ml mơi trường mới để loại bỏ trypsin và những tế bào chết.
*./ Lưu ý: một bình roux chứa đầy tế bào cĩ thể cấy chuyền sang 3 hoặc 4 bình roux mới.