DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN

Thực hành Dược liệu B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ BỘ MÔN DƯỢC LIỆU- DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN -- BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH DƯỢC LIỆU DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: ĐỖ NAM QUAN TIỂU NHÓM – LIÊN THÔNG CĐ-ĐH DƯỢC 13A Nguyễn Lê Nhật Linh Hồ Linh Phương Trần Ngọc Thiên Vy Đỗ Công Hậu Đặng Thị Thùy Dung Dương Thị Ngọc Em Cần Thơ, 2019 Thực hành Dược liệu B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN I CƠ SỞ LÝ THUYẾT Khái niệm Saponin: Saponin nhóm glycosid có cấu trúc triterpen steroid, thường gặp thực vật gặp động vật SAPONIN = ĐƯỜNG + AGLYON TRITERPEN TETRACYCLIC STEROID PENTACYCLIC Tính chất Saponin có số tính chất chung tạo bọt bền lắc với nước, làm vỡ hồng cầu nồng độ thấp, độc cá, tạo phức với cholesterol hay với chất B-hydroxy steriod Các tính chất dùng để định tính đánh giá saponin Các saponosid thường dễ tan ethanol, methanol, butanol, nước hỗn hợp cồn nước; khó tan khơng tan dung mơi phân cực Dạng aglycon (sapogenin) ngược lại, dễ tan dung môi hữu phân cực, tan nước Các tính chất thường dùng để chiết xuất tinh chế saponin Trong định tính, saponin thường chiết cồn (EtOH, MeOH) với độ cồn khác nhau, cô dịch chiết đến đậm đặc kết tủa saponin dung môi phân cực ether, aceton,…Cũng tinh chế saponin cách phân bố nước n-BuOH bão hoà nước Với thử nghiệm tính tạo bọt, tính phá huyết sử dụng dung dịch chiết nước mà khơng cần tinh chế Thực hành Dược liệu B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A Các thử nghiệm tạo bọt, phá huyết, độc cá… thường dùng để nhận định saponin Các phản ứng hoá học sử dụng mức độ đặc hiệu thấp so với nhóm hợp chất khác Sắc ký lớp mỏng Để định tính saponin người ta dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng R f màu sắc với thước thử đặc hiệu vết sắc ký đồ yếu tố để nhận định có mặt saponin, nhóm saponin hỗn hợp phân tích Trong SKLM, Rf chất A định nghĩa tỷ số đoạn đường di chuyển A(la ) đoạn đường di chuyển dung mơi (l ) tính từ mức xuất phát mẩu thử Rfa = la / l0 Trị số Rf luôn < 1,00 lấy hai số lẻ Trong điều kiện sắc ký định, giá trị Rf chất đặc trưng chất hệ dung môi sử dụng Tuy nhiên, giá trị Rf phụ thuộc vào nhiều yếu tố (bản chất, bề dày độ hoạt hoá pha tĩnh pha động, mức độ bão hồ dung mơi, độ ẩm nhiệt độ môi trường…) Để đánh giá saponin dược liệu, số bọt (CSB), số phá huyết ( CSPH) hay dùng Chỉ số bọt: số pha loãng cần thiết 1g dược liệu để tạo lớp bọt cao 1cm sau ngưng lắc 15 phút, tiến hành điều kiện quy định Chỉ số phá huyết: số mililit dung dịch đệm cần thiết để hoà tan saponin có 1g dược liệu gây phá huyết hoàn toàn loại máu chọn, tiến hành điều kiện quy định II 1.1 NỘI DUNG THỰC HÀNH Nguyên vật liệu thí nghiệm Dụng cụ, hóa chất thuốc thử Cồn 70% - H2SO4 đậm đặc Methanol - Dung dịch NaCl 0.9% Ether ethylic - Thuốc thử vanillin sulfủic (VS) pha Anhydrid acetic 1.2 Dược liệu Đinh lăng (Polyscias fruticosa L, Araliaceae) - Bồ kết (Fructus Gleditschiae) già Bồ Kết (Gledítchia fera (Lour.) Merr., Fabaceae) Thực hành 2.1 Định tính tạo bọt - - 2.2 Cho 1,0g dược liệu vào bình nón 50ml, thêm vào 20ml cồn 70% Thực hành Dược liệu B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A 2.3 2.4 2.5 2.6 Đun nhẹ bếp cách thuỷ phút lọc nóng qua Thực hành Dược liệu B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 Cho dịch chiết vào chén sứ, bốc dung mơi cách thuỷ khoảng 2-3 ml Lấy 10 giọt dịch chiết đậm đặc cho vào ống nghiệm có sẳn 10ml nước cất Thực hành Dược liệu B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A 2.13 2.14 Dùng ngón tay bịt miệng ống nghiệm lặc mạnh theo chiều đứng ống nghiệm phút (30 lần lắc) 2.15 2.16 2.17 2.18 2.19 Thực hành Dược liệu B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A 2.20 Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt đánh giá kết 2.21 Sau 15 phút (+) 2.23 2.22 2.25 Sau 30 phút (++) 2.24 Định tính phản ứng hố học (phản ứng Liebermann – Burchard) Tiếp tục dùng hai chén dược liệu trên, cô bếp cách thuỷ đến cắn thật khô Để nguội 2.26 Cho vào cắn 1ml anhydrid acetic 2ml CHCl3, khuấy kỹ cho tan nhầm cắt phần đường phân tử lại aglycon tan Cloroform Lọc pipet Pasteur bịt bông, cho dung dịch vào ống nghiệm khô 2.27 Thực hành Dược liệu 2.28 B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A 2.29 2.31 Để ống nghiệm nghiên giá, dùng pipet cho thật nhẹ nhàng khoảng 1ml H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm 2.32 2.33 Mơ tả: + Ống nghiệm có chứa dược liệu Đinh lăng: mặt ngăn cách lớp có màu từ nâu đậm lớp dung dịch phía có màu xanh rêu 2.34 + Ống nghiệm có chứa dược liệu Bồ kết: mặt ngăn cách lớp có màu từ nâu đậm lớp dung dịch phía có màu nâu đỏ 2.35 2.36 Nhận xét: Phản ứng dương tính 2.37 Kết luận: mẫu dịch chiết Đinh lăng Bồ kết có chứa saponin 2.38 Định tính sắc ký lớp mỏng 2.38.1 Chuẩn bị mỏng Thực hành Dược liệu B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A Dùng tráng sẵn silica gel, dùng bút chì 2B kẻ đường thẳng cách mép 1-1,5cm đường thẳng cách mép 0.5cm Đánh dấu điểm cần chấm 2.39 2.39.1 Chuẩn bị bình sắc ký dung mơi 2.40 Bình sắc ký rửa để thật khơ Lót miếng giấy lọc quanh lòng bình sau cho có khoảng trống dọc theo bình để quan sát sắc ký bên Cho hệ dung môi CHCl3 - MeOH – H2O (65:35:10; lớp dưới) vào bình sắc ký cho lớp dung mơi bình cao khoảng 0.5cm Đậy nắp bình sắc ký, đặt nơi phẳng, để yên 15-30 phút cho bão hồ dung mơi 2.41 2.42 2.43 2.43.1 Chuẩn bị mẫu thử Cho khoảng 0.5g bột dược liệu 5ml methanol vào ống nghiệm, đun cách thuỷ vòng 10 phút 2.44 Thực hành Dược liệu B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A 2.45 2.46 Lọc qua phễu cho dịch lọc vào chén sứ, cô đến cắn 2.47 Hoà cắn vào vài giọt MeOH, dùng dung dịch làm mẫu thử cho sắc ký lớp mỏng 2.48 2.48.1 Đưa mẫu lên mỏng khai triển Dùng mao quản lấy mẫu, chấm lên mỏng thành vạch gọn cách mép mép 1-1.5cm (phải chắn vết chấm cao mức dung mơi bình sắc ký) 2.49 2.50 Chờ cho vết chấm bay hết MeOH, đưa mỏng vào bình sắc ký đậy nắp bình Khi dung mơi chạy cách mép khoảng 0.5cm lấy mỏng ra, để nhiệt độ phòng sấy nhẹ khô dung môi 2.51 10 Thực hành Dược liệu B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A 2.52 2.53 2.54 2.54.1 Phát - Soi đèn UV254nm 2.55 2.56 2.57 2.58 2.59 11 Thực hành Dược liệu B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A 2.60 - Soi đèn UV365nm 2 2.61 Với bước sóng 365nm ta quan sát Đinh lăng có vết Bồ kết có vết 2.62 Nhúng nhanh mỏng vào khai chứa thuốc thử vanillin-sulfuric (Thuốc thử vanillinsulfuric hốn hợp đồng thể tích dung dịch: (a) dung dịch vanillin 1% cồn tuyệt đối (b) dung dịch sulfuric 5% cồn tuyệt đối) để đứng mỏng khay thật khô thuốc thử sấy nhẹ - - 2.63 2.64 2.65 12 Thực hành Dược liệu 2.66 B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A Sau nóng mỏng 105 độ C vài phút • Tính Rf : 2.67 2.68 - - 2.69 ĐL BK 2.70 Đinh Lăng : 2.71 + Rf (1) = 7.3/8 = 0.91 2.72 + Rf (2) = 6.8/8 = 0.85 2.73 + Rf (3) = 2/ = 0.25 Bồ Kết : 2.74 + Rf (1) = 7.2 / = 0.9 13 Thực hành Dược liệu 2.75 2.76 2.77 B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A + Rf (2) = 6.8 /8 = 0.85 + Rf (3) = 5.2 / = 0.65 + Rf (4) = 3.1 / = 0.39 14 ... 20ml cồn 70% Thực hành Dược liệu B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A 2.3 2.4 2.5 2.6 Đun nhẹ bếp cách thuỷ phút lọc nóng qua Thực hành Dược liệu B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 Cho dịch chiết vào... B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A 2.13 2.14 Dùng ngón tay bịt miệng ống nghiệm lặc mạnh theo chiều đứng ống nghiệm phút (30 lần lắc) 2.15 2.16 2.17 2.18 2.19 Thực hành Dược liệu B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A 2.20 Để yên... 2.51 10 Thực hành Dược liệu B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A 2.52 2.53 2.54 2.54.1 Phát - Soi đèn UV254nm 2.55 2.56 2.57 2.58 2.59 11 Thực hành Dược liệu B6_TN2_LTCĐ-ĐH D13A 2.60 - Soi đèn UV365nm 2 2.61 Với