Sắc ký lớp mỏng dược liệu chứa saponin

Sắc ký lớp mỏng dược liệu chứa saponin

GVHD: Ths Đỗ Văn Mãi I TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG - Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) kĩ thuật sắc kí dùng để tách chất hỗn hợp - Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm: •Pha tĩnh lớp mỏng chất hấp phụ, thường silica gel, aluminium oxide, cellulose phủ mặt phẳng chất trơ •Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích hòa tan dung mơi thích hợp hút lên sắc kí mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa tính phân cực thành phần dung dịch QUAN KÝ LỚP MỎNG HệI.sốTỔNG di chuyển Rf làVỀ đạiSẮC lượng đặc trưng quan trọng mức độ tách Hệ số di chuyển Rf tính theo cơng thức: Trong đó: - a khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết mẫu thử, tính cm - b khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung mơi đo đường vết, tính cm - Rf: Chỉ có giá trị từ đến l I TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG Khi Rf = chất tan hồn tồn khơng di chuyển, Rf = chất tan di chuyển tốc độ dung mơi Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến Rf quan trọng là:  Chất lượng hoạt tính chất hấp thụ  Bề dày lớp mỏng  Chất lượng độ tinh khiết pha động I TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG - Một số cải tiến kết hợp phương pháp truyền thống để tự động hóa vài bước, làm tăng độ dung giải sắc kí lớp mỏng cho số liệu xác  Phương pháp gọi sắc kí lớp mỏng hiệu cao (high performance TLC - HPTLC) II Các bước chuẩn bị sắc ký lớp mỏng - Chọn chất hấp phụ: tương tự sắc ký cột dùng chất hấp phụ silicagel, nhôm oxit, bột cellulose, tinh bột, sephadex - Để cho chất hấp phụ bám vào phiến kính, người ta cho thêm chất dính vào chất hấp phụ Chất dính thường CaSO4 với tỷ lệ khoảng 10% II Các bước chuẩn bị sắc ký lớp mỏng - Chuẩn bị phiến kính lớp mỏng chất hấp phụ kính: •Các phiến kính thường có cỡ 20x5 cm, 20x20 cm, 7,5x2,6 cm Rửa sạch, sấy khô trước rải • Cân 5g bột silicagel cho vào cối nghiền với 10ml nước cất, lượng rải phiến kính cỡ 20x5cm Sau rải lên phiến kính tay máy • Để khơ nhiệt độ phòng sau sấy 1000C từ 30 - 120 phút tuỳ theo yêu cầu Độ dày chuẩn lớp mỏng 0,25 - 0,30 mm II Các bước chuẩn bị sắc ký lớp mỏng - Chuẩn bị mẫu thử: giống sắc ký giấy, mẫu thử cần có cách chuẩn bị riêng để loại bỏ tạp chất cô đặc mẫu - Dùng ống vi quản chấm mẫu cách bờ phiến kính khoảng 1-2 cm Vết chấm phải nhỏ, đường kính - mm cách xa cm Một số dụng cụ cho SKML  Bình triển khai Một số dụng cụ cho SKML  Bảng mỏng tráng sẳn 10 III Một vài hệ dung môi dùng để khai triển silicagel-G: 3.mỏng Saponin kiềm: a) Chloroform – ethanol – dung dịch amoniac 1% nước (2:2:1) b) Ethanol – pyridin – nước (3:1:3) 14  Dung môi phải loại tinh khiết, thường dùng hỗn hợp 2-3 dung môi Các dung môi xếp theo thứ tự mạnh dần (sức đẩy, phản hấp phụ): hexan, heptan, cyclohexan, carbon tetraclorid, benzen, cloroform, butyl acetat, ether, ethyl acetat, pyridin, aceton, ethanol, methanol, nước 15 IV Tiến hành SKLM  Chiết xuất tinh chế sơ Saponin  Chấm dung dịch mỏng  Triển khai SKLM  Cách phát 16 17 Chấm mẫu thử  Kẻ vạch thẳng nằm ngang bút chì, cách mép mỏng 1cm làm vạch xuất phát  Dùng mao quản hay micropipet chấm vết dung dịch thử dung dịch chuẩn lên Các vết phải cách cách mép mỏng cm 18 Triển khai SKLM  Quá trình cho pha động chạy, kéo mẫu phân tích di chuyển pha tĩnh  Đặt mỏng vào bình sắc ký bão hồ dung mơi pha động, mép phía chấm mẫu nhúng vào dung môi động không cho điểm chấm mẫu chạm trực tiếp vào dung môi động  Sau dung môi chạy nửa hay 2/3 mỏng ta lấy để khô hay sấy khô 19 Cách phát  Dựa vào tính phá huyết cách tráng lớp gelatin – máu (hòa tan g gelatin 100 ml dung dịch NaCl 9% ở 60 0C.Khi nguội đến 400C thêm máu bò loại fibrin) phun dung dịch treo máu 2% loại fibrin mỏng  Các vết saponin cho vết mầu nhạt hồng đỏ 20 Cách phát  Các thuốc thử dùng cho loại saponin sapogenin nên sau phun cần phải sấy 10 phút 1100C quan sát mầu ánh sáng thường ánh sáng tử ngoại (365nm):  Thuốc thử Carr – Price (dung dịch SbCl3 bão hòa chloroform)  Thuốc thử Liebermann – Burchard  Thuốc thử Salkowski, acid phosphomolibic 10% ethanol, acid phosphotungstic 20% ethanol, dung dịch acid phosphoric 50% nước, dung dịch vanillin – sulfuric  Các vết saponin cho mầu khác nhau, tùy loại thuốc thử saponin 21 Cách phát  Saponin nhóm spirostan màu thuốc thử Sannié (dung dịch A: vanillin 1% cồn, dung dịch B: anhydrid acetic + H2SO4 12:1)  Phun dung dịch sấy 1200 trong phút sau phun dung dịch B, vết saponin có mầu vàng  Đối với nhóm spirostan nhóm steroid alcaloid dùng thuốc thử Carr – Price để phân biệt dẫn chất có nối đơi khơng có nối đơi vị trí C-5 Các dẫn chất C5 có mầu đỏ 200C tím đỏ sau sấy 1050C 22 Cách phát  Cũng phân biệt loại dẫn chất thuốc thử Marquis (0,2 ml dung dịch formaldehyd 37% nước + 10 ml H 2SO4), có loại dẫn chất C5 cho phản ứng  Các saponin nhóm spirosolan solanidan phát thuốc thử Dragendorff 23 V Ứng dụng công dụng SKLM  Ứng dụng:      24 Định tính Định lượng (phải có chất chuẩn) Phát thành phần hỗn hợp, định tính điểm Theo dõi thành phần chất Phân lập chất V Ứng dụng công dụng SKLM  Công dụng:      25 Xét nghiệm độ tinh khiết hóa chất phóng xạ dược khoa Xác định sắc tố tế bào thực vật Phát thuốc trừ sâu, thuốc diệt trùng thức ăn Nhận biết hóa chất chất cho sẵn Giám sát phản ứng hữu VI Các tượng ý muốn thường gặp SKLM cách khắc phục 26 Nguồn tham khảo  http://www.duoclieu.org/2012/01/kiem-nghiem-duoc-lieu-chua-saponin-bang.html  http://www.duoclieu.org/2012/07/phuong-phap-sac-ky-duoc-lieu.html  http://123doc.org/document/1030224-ap-dung-phuong-phap-sac-ky-cot-va-sac-ky-lop-mong-vao-giang-day-hoa-hoc-phothong.htm 27 Thank you 28 ...I TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG - Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) kĩ thuật sắc kí dùng để tách chất hỗn hợp - Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm: •Pha tĩnh lớp mỏng chất hấp... kí lớp mỏng cho số liệu xác  Phương pháp gọi sắc kí lớp mỏng hiệu cao (high performance TLC - HPTLC) II Các bước chuẩn bị sắc ký lớp mỏng - Chọn chất hấp phụ: tương tự sắc ký cột dùng chất hấp... dày lớp mỏng  Chất lượng độ tinh khiết pha động I TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG - Một số cải tiến kết hợp phương pháp truyền thống để tự động hóa vài bước, làm tăng độ dung giải sắc kí lớp mỏng