bài thực hành số 2 sắc ký cột và sắc ký bản mỏng
22/02/2006 Lê Văn Dăng ĐHSP THỰC HÀNH HÓA HỮU CƠ Thí nghiệm tổng hợp Hữu Cơ TH TH Ự Ự C HA C HA Ø Ø NH HO NH HO Ù Ù A H A H Ư Ư ÕU CƠ ÕU CƠ Th Th í í nghie nghie ä ä m m to to å å ng ng hơ hơ ï ï p p H H ư ư õu õu Cơ Cơ 22/02/2006 Lê Văn Dăng ĐHSP SẮC KÝ CỘT VÀ SẮC KÝ BẢN MỎNG SẮC KÝ CỘT VÀ SẮC KÝ BẢN MỎNG 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit LêVănĐăng-KhoaHoá-ĐHSP II- CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CÁC CHẤT HỮU CƠ A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 1- Sơ lược về sắc kí : Sắc kí là quá trình tách cấu tử của một hỗn hợp dựa vào việc các cấu tử này sẽ phân bố khác nhau giữa pha tónh và pha động. Pha tónh có thể là cột nhồi (sắc kí cột), mà pha động là dung môi hữu cơ sẽ di chuyển ngang qua. Pha tónh có thể là một lớp mỏng (sắc kí bảng mỏng) chất hấp phụ được tráng lên một nền phẳng bằng vật liệu thủy tinh, nhôm, lúc đó pha động sẽ được hút thấm lên lớp mỏng nhờ lực hút mao dẫn. 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit LêVănĐăng-KhoaHoá-ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ Trong sắc kí phân bố pha tónh là một lớp chất lỏng thật mỏng được hấp thụ lên bề mặt của một chất mang rắn, trơ, còn pha động là chất lỏng (sắc kí phân bố lỏng - lỏng) hoặc chất khí (sắc kí khí). Trong cả hai trường hợp, sự tách sẽ tùy thuộc nhiều vào sự phân bố của dung chất giữa hai pha. Trên thực tế, quá trình này rất phức tạp do có sự tác động qua lại giữa việc các cấu tử được hấp thụ lên chất mang và việc tách cấu tử đó ra trong suốt quá trình sắc kí. Trong sắc kí hấp phụ pha động thường là chất lỏng và pha rắn là chất hấp phụ rắn, nhuyễn; việc tách ở đây dựa vào sự hấp phụ có chọn lọc một số hợp chất nào đó của hỗn hợp lên bề mặt của chất rắn (sắc kí rắn - lỏng : dùng resin trao đổi ion để tách các hợp chất có tính axit hoặc bazơ như aminoaxit hoặc aminophenol). 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit LêVănĐăng-KhoaHoá-ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ Ngoài ra còn có sắc kí lọc gel, việc tách các hợp chất dựa vào sự khác biệt về kích thước của các hợp chất. Trong kó thuật này, pha tónh là những hạt gel có dạng hình cầu, có những lỗ rỗng với kích thước qui đònh (nhà sản xuất có đủ cỡ để lựa chọn cho phù hợp với chất mình cần tách). Các hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ sẽ chui vào trong các lỗ rỗng của các hạt gel và được giữ lại trong hạt gel, nghóa là được giữ lại trong cột; các hợp chất có khối lượng phân tử lớn hơn nên không thể chui vào trong các lỗ rỗng của các hạt gel sẽ bò đuổi ra khỏi cột sắc kí trước tiên. Kỹ thuật này áp dụng cho các hợp chất có khối lượng phân tử lớn như protein, peptit, enzym, hormon 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit LêVănĐăng-KhoaHoá-ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : Sắc kí cột là một phương pháp hiện đại, tinh vi để tách các cấu tử hóa học ra khỏi hỗn hợp chủa chúng. Nếu lựa chọn đúng các điều kiện, người ta có thể tách hầu hết các chất bất kì một hỗn hợp nào. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chúng ra, bao gồm : - Lựa chọn chất hấp phụ. - Sự lựa chọn dung môi giải li. - Kích thước cột sắc kí, khối lượng chất hấp phụ, lượng mẫu chất được dùng. - Vận tốc giải li. 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit LêVănĐăng-KhoaHoá-ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : a) Chất hấp phụ : Lựa chọn chất hấp phụ tùy theo loại mẫu chất cần phân tích bằng sắc kí cột. Xenlulozơ, tinh bột, đường dùng cho các nguyên liệu nguồn gốc thực vật, có chứa các nhóm chức nhạy cảm với các tương tác axit, bazơ. Silicat magie dùng để tách các chất đường, steroit, tinh dầu Silica gel, alumin, florisil là loại được sử dụng rộng rãi áp dụng cho các nhóm chức như hiđrocacbon, ancol, xeton, este, axit cacboxylic, hợp chất azo, amin Alumin tính axit có pH = 4 thường dùng để tách các hợp chất có tính chất axit như axit cacboxylic, aminoaxit. Alumin kiềm có pH = 10 để tách các amin. Alumin trung tính để tách nhiều lọai nguyên liệu không có tính axit và cũng không có tính bazơ. 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit LêVănĐăng-KhoaHoá-ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : a) Chất hấp phụ : Cần biết rằng khi cho bột alumin hoặc silicagel vào một dung dòch có chứa một hợp chất hữu cơ, thì các phân tử của hợp chất hữu cơ đó sẽ bò hấp thu hoặc bò dính vào các hạt alumin. Có nhiều loại lực hút làm cho các phân tử hữu cơ dính vào hạt alumin, các lực hút này thay đổi tùy loại. Phân tử không phân cực sẽ gắn vào hạt alumin bởi lực hút Van-Đec-Van (Van-Der-Waasl) là loại lực hút yếu; thường thì phân tử không phân cực sẽ không gắn chặt vào alumin ngoại trừ khi chúng có khối lượng phân tử cực lớn. Các tương tác không tác thông dụng là các tương tác thường thấy trong các phân tử phân cực. Lực giảm dần của các lọai nối được xếp như sau : Sự thành lập muối > liên kết phối trí > liên kết hiđro > tương tác lưỡng cực > Van-Đec-Van. 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit LêVănĐăng-KhoaHoá-ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : a) Chất hấp phụ : Lực nối thay đổi tùy loại hợp chất. Hợp chất mang các nhóm Đònh chức có tính phân cực càng mạnh sẽ càng bám chặt vào silica gel hoặc alumin. Về nguyên tắc, những hợp chất không phân cực sẽ đi ngang qua cột mau hơn những hợp chất phân cực là do nó có ái lực yếu đối với chất hấp phụ. Nếu chất hấp phụ gắn chặt tất cả các phân tử của dung chất, thì các chất đó sẽ không thể di chuyển xuống cột; ngược lại, nếu chọn phải một dung môi quá phân cực dùng để dung li, thì dung môi này sẽ giải li tất cả các dung chất (kể cả chất phân cực và chất không phân cực) ra khỏi cột và như thế thì không thể thực hiện được sự tách li bằng sắc kí cột 20/8/2006 Hợp chất isoprenoit LêVănĐăng-KhoaHoá-ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : a) Chất hấp phụ : Có nhiều lọai chất hấp phụ dùng cho sắc kí cột, được phân loại tùy theo khả năng bám của chúng vào các phân tử phân cực; được sắp xếp theo mức độ tăng dần như sau : Giấy, xenlulozơ, tinh bột, đường, Na 2 CO 3 , CaCO 3 , Ca 3 (PO 4 ) 2 , MgCO 3 , Ca(OH) 2 , silica gel, florisil (MgSiO 3 ), MgO, alumin (kiềm, axit, trung tính), than hoạt tính. Các loại thường dùng có bán sẵn là alumin, hoặc silica gel với kích cỡ hạt gel 50-239m sẽ giúp cho việc nhồi cột tương đối chặt chẽ và đạt được vận tốc giải li vừa phải dưới tác động của sức hút trọng lực [...]... tan và giải li một số chất hấp phụ 20 /8 /20 06 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : c) Kích thước cột sắc kí và lượng chất hấp phụ : Kích thước cột sắc kí và lượng chất hấp phụ cần được lựa chọn thích đáng để có thể tách tốt các mẫu cần sắc kí Thông thường, khối lượng phân tử chất hấp phụ phải nặng gấp 25 -50 lần khối lượng mẫu chất cần sắc kí và cột sắc. .. isoprenoit c khi nạp mẫu vàno cộ-tKhoa Hoá - ĐHSP bỏ trướ 20 /8 /20 06 Hợp Lê Vă Đăng 2- SẮC KÍ CỘT : f) Kỹ thuật nạp mẫu vào đầu cột : Để nạp mẫu vào cột, phải theo tiến trình sau đây: mở khóa cột để hạ mực dung môi xuống bằng sát với mực chất hấp phụ đang có trong cột, khóa cột lại, dùng một ống nhỏ giọt để hút dung dòch mẫu cho vào đầu cột (đầu của ống nhỏ giọt rẽ xung quanh thành trong của cột phía gắn với... khí Tiếp tục vừa rót chất sệt vào cột, vừa khỏ nhẹ, đến khi rót hết số lượng chất sệt vào cột Lưu ý trong quá trình nạp cột, dung môi vẫn liên tục chảy đều đều ra khỏi cột hứng vào bese đặt dưới cột và sẽ được dùng để rót trở lại lên đầu cột Cho dung môi chảy ra, rồi rót trở lại đầu cột vài ba lần để giúp cho việc nạp cột được chặt chẽ Lưu ý, luôn giữ không được để cho cột khô nghóa là nếu dung môi... dưới cột có một bese hứng, dưới đáy cột có đặt một lớp bông gòn mỏng khoảng 2- 3 mm, lớp bông gòn này có tác dụng giữ cho chất hấp phụ không tuột ra khỏi cột Cho một loại dung môi không phân cực như benzen vào 1 /2 cột rồi để đó, chuẩn bò chất hấp phụ để nạp vào cột theo hai phương pháp; phương pháp khô và phương pháp sệt 20 /8 /20 06 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- ... chảy thành dòng nhỏ xuống dung môi trong cột) , vừa khỏ nhẹ vào thành cột Khi chất hấp phụ đạt đến chiều cao cần thiết trong cột thì ngưng không cho thêm nữa Tiếp tục cho dung mọi chảy ngang qua chất hấp phụ vài lần như mô tả ở phần nhồi cột theo phương pháp sệt 20 /8 /20 06 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP 2- SẮC KÍ CỘT : f) Kỹ thuật nạp mẫu vào đầu cột : Nếu mẫu chất là chất lỏng cần làm... li 20 /8 /20 06 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP 2- SẮC KÍ CỘT : Dung môi Mẫu chất Silica gel Bông gòn Máy cô quay (Rotary Evaporator) dùng để cất đuổi dung môi Cấu tử sau khi tách cùng vớ i dung mô i Bình hứng dung mô i 20 /8 /20 06 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP 2- SẮC KÍ CỘT : h) Cô lập các chất đã được tách ra bởi sắc kí cột : Khối lượng Mũi 1 0 2 4 6 Mũi 3 Mũi 2 8... đi việc tách Đa số các trường hợp, vận tốc giải li nằm trong khoảng 5-50 giọt/ phút 20 /8 /20 06 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : e) Kỹ thuật nhồi cột : Cần tuân theo các kỹ thuật hướng dẫn để có được cột nhồi chặt chẽ, đồng đều, không bọt khí, không nứt gãy Cột sắc kí là một ống thủy tinh dưới đáy có một robinet khóa; cột được bắt vào giá ở vò trí... vết gọn, rõ, sắc nét thì cần triển khai hệ thống gồm hỗn hợp dung môi, thí dụ như hỗn hợp toluenmetanol, hoặc hexan-etyl axetat 20 /8 /20 06 Hợp chất isoprenoit Lê Văn Đăng - Khoa Hoá - ĐHSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : b) Lựa chọn dung môi giải li : Cần hiểu kết quả phân tích trên sắc kí bảng mỏng sẽ tốt, đẹp hơn trên sắc kí cột Toluen là loại dung môi có độ phân cực trung bình và có thể áp... chất cần sắc kí và cột sắc kí và cột sắc kí cần có kích cỡ là chiều cao phần chất hấp phụ trong cột sắc kí cần thỏa tỉ lệ chiều cao 8 : 1 Tuy nhiên, đối với các hợp chất khó tách thì có thể dùng cột lớn hơn và lượng chất hấp phụ nhiều hơn Mẫu sắc kí Khối lượng chất Đường kính cột Chiều cao (gam) hấp phụ (gam) (mm) cột (mm) 0,01 0,3 3,5 30 0,1 3,0 7,5 60 1,0 30,0 16 130 20 /8 /20 06 Hợp chất isoprenoit Lê... phụ và dung môi giải li Muốn vậy, phải nhờ kỹ thuật sắc kí bảng mỏng (xem phần sắc kí bản mỏng) với bảng alumin hoặc silica gel, nếu không tách tốt mới phải tìm loại chất hấp phụ khác Thiết lập một loạt thử nghiệm với những bình triển khai sắc kí bảng mỏng trong mỗi bình chứa một trong các dung môi với độ phân cực tăng dần : hexan, benzen, clorofom, ete etylic, axetat etyl, axeton, metanol Các tấm bảng . H H ư ư õu õu Cơ Cơ 22 / 02/ 2006 Lê Văn Dăng ĐHSP SẮC KÝ CỘT VÀ SẮC KÝ BẢN MỎNG SẮC KÝ CỘT VÀ SẮC KÝ BẢN MỎNG 20 /8 /20 06 Hợp chất isoprenoit LêVănĐăng-KhoaHo - HSP II- CÁC PHƯƠNG PHÁP. hòa tan và giải li một số chất hấp phụ 20 /8 /20 06 Hợp chất isoprenoit LêVănĐăng-KhoaHo - HSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : c) Kích thước cột sắc kí và lượng . khí và làm nứt gãy cột ; cột gãy thì khả năng tách của cột kém đi. 20 /8 /20 06 Hợp chất isoprenoit LêVănĐăng-KhoaHo - HSP A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 2- SẮC KÍ CỘT : b)