Khảo sát sự ức chế acetylcholinesterase trên sắc kí lớp mỏng

Khảo sát sự ức chế acetylcholinesterase trên sắc kí lớp mỏng

Mục lụ

Mục lục

Bản các từ viết tắt 1

KHẢO SÁT SỰ ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE TRÊN SẮC KÍ LỚP MỎNG 2

1 TỔNG QUAN 2

1.1 BỆNH ALZHEIMER 2

1.2 SƠ LƯỢC VỀ ACETYLCHOLINESTERASE VÀ CHẤT ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE 2

1.2.1 Acetylcholinesterase 2

1.2.2 Chất ức chế acetylcholinesterase 3

1.3 GIỚI THIỆU SẮC KÍ LỚP MỎNG [7] 6

2 KHẢO SÁT SỰ ỨC CHẾ ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE TRÊN TLC 7

2.1 THỬ NGHIỆM TRÊN TLC VỚI THUỐC THỬ MUỐI FAST BLUE B [8] 7

2.1.1 Cơ sở lý thuyết 7

2.1.2 Nguyên liệu 8

2.1.3 Dụng cụ, hóa chất và cách pha hóa chất 8

2.2.3.1 Dụng cụ và hóa chất 8

2.2.3.2 Cách pha các dung dịch 8

2.1.4 Quy trình thực hiện 9

2.1.5 Kết quả 9

2.2 THỬ NGHIỆM TLC VỚI THUỐC THỬ ELLMAN 11

2.2.1 Khảo sát sự ức chế cho kết quả dương tính thật [9] 11

2.2.3.3 Cơ sở lý thuyết 11

2.2.3.4 Nguyên liệu 12

2.2.3.5 Hóa chất, dụng cụ và cách pha hóa chất 12

2.2.3.6 Phương pháp 13

2.2.3.7 Kết quả 14

2.2.2 Khảo sát sự ức chế cho kết quả dương tính giả [10] 16

2.2.3 Khảo sát sự ức chế enzyme bằng sắc kí bản mỏng hiệu năng cao [11,12,13] 19

3 TỔNG KẾT 22

TÀI LIỆU THAM KHẢO 23

acetylthiocholine iodidebovine serum albumin5,5’- dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)sắc kí lớp mỏng hiệu năng caosắc kí lớp mỏng

5-thio-2-nitrobenzoate

KHẢO SÁT SỰ ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE TRÊN

SẮC KÍ LỚP MỎNG

Bệnh Alzheimer là bệnh thoái hóa thần

kinh phổ biến được đặc chưng bởi sự giảm

nồng độ chất dẫn truyền thần kinh

acetylcholine (ACh) trong não bộ Một số điều

trị lâm sàn của bệnh Alzheimer là kích thích

thụ thể tiết ra ACh hoặc kéo dài sự tồn tại của

ACh trong các khe thần kinh sinap bằng cách

sử dụng các chất có khả năng tích trữ và làm

tăng nồng độ ACh Ước tính có khoảng 50-60

thuốc được đưa vào thử nghiệm lâm sàn trong

việc điều trị bệnh Alzheimer và việc sử dụng

chất ức chế enzyme acetylcholinesterase (có

vai trò thủy phân ACh) hứa hẹn đầy tiềm năng

trong việc điều trị bệnh Alzheimer [1]

ACETYLCHOLINESTERASE

Enzyme acetylcholinesterase (AChE) là một enzyme rất quan trong đối với độngvật kể cả loài người AChE có nhiệm vụ chuyển hóa chất dẫn truyền thần kinh (ACh)sau khi ACh đã truyền thông tin Nếu chất dẫn truyền thần kinh không được chuyểnhóa sau khi nó hoàn thành nhiệm vụ thì các cơ có liên quan sẽ không thể nghỉ và điều

đó có thể gây ra các cơn co thắt , tê liệt và một số vấn đề khác

AChE được tìm thấy trong khe synap, ở giữa các tế bào thần kinh thông qua cácluồng thông tin Khi ACh đi qua, AChE sẽ chuyển hóa ACh thành choline và acidacetic

Hình 1 Bệnh Alzheimer

AChE chuyển hóa ACh chỉ trong10−6s, rất nhanh để giữ cho khe synap luôn rõràng để thông tin hỗn hợp không xảy ra [2].

Chất ức chế acetylcholinesterase (AChI) là những hợp chất có khả năng ức chếphản ứng thủy phân acetylcholine, được chia làm hai nhóm là chất ức chế thuậnnghịch và chất ức chế không thuận nghịch (chất ức chế thuận nghịch là chất ức chế tạoliên kết với các enzyme bằng liên kết không nối như liên kết hydrogen, liên kết Vander waals, nối liên kết ion; chất ức chế bất thuận nghịch là chất ức chế tạo liên kết vớienzyme bằng liên kết cộng hóa trị [1]

Hầu như các chất ức chế được tìm được đều chứa nitrogen, có 3 mức độ ức chế [3]:

Ức chế mạnh : phần trăm ức chế enzyme lớn hơn 60 %

Ức chế trung bình: phần trăm ức chế enzyme từ 15 - 50 %

Ức chế yếu: phần trăm ức chế enzyme nhỏ hơn 15 %

Một số hợp chất ức chế enzyme đã được sử dụng trong việc điều trị bệnhAlzheimer:

H2N

5

CH 3

NH O

6

HN

N N

H 3 C O

H3C O

Tacrine (1) là thuốc đầu tiên được cục quản lí dược và thực phẩm cho phép áp

dụng vào việc điều trị bệnh Alzheimer (1993), là một chất ức chế không cạnhtranh thuận nghịch

Donepezil (2) là thuốc thứ hai được cục quản lí dược vả thực phẩm cho phép áp

dụng cho việc điều trị bệnh Alzheimer (1996), là chất ức chế thuận nghịch

Rivastigmine (3) là chất ức chế không cạnh tranh thuộc nhóm carbamates, liên

kết với bề mặt mang nhóm ester của enzyme, là thuốc được cục quản lí dược vàthực phẩm cho phép sử dụng vào năm 2000

Galathamine (4) là một phenanthrene alkaloid, một chất ức chế cạnh tranh

thuận nghịch, được cục quản lí dược và thực phẩm cho phép sử dụng vào năm2001

Huperzine A (5) và huperzine B (6) là hai alkaloid được cô lập từ loài thảo

mộc Huperzia serrate Cả hai hợp chất này đều là chất ức chế thuận nghịch đầy

tiềm năng và có tính chọn lọc cao, được cho phép sử dụng ở Trung Quốc

Physostigmine (7) (eserine) là chất ức chế thuận nghịch có cơ cấu là một amine

bậc 3

Eptastigmine (8) là một dẫn xuất của physostigmine, trong đó nhóm

carbamoylheptyl được thay bằng nhóm carbamoylmethyl tại vị trí thứ 5 củavòng indole [1]

Dae Keun Kim và cộng sự năm 2004 cô lập được 4 hợp chất isoquinoline

alkaloid từ Corydails speciosa có hoạt tính ức chế AChE thu được giá trị IC50 (ức chế

enzyme 50%): corynoxidine (89 µM) (9), protopine (16.1 µM) (10), palmatine (5.8 µM) (11), berberine (3.3 µM) (12)[4]

Ngoài các alkaloid là galanthamine, huperzine A và huperzine B còn có 3alkaloid khác: sanguinine (0.1 ± 0.01 µM) (13), 11-hydroxygalanthamine (1.61 ± 0.21

µM) (14), epinorgalanthamine (9.60 ±0.65 µM) (15); 3 lycorine: oxoassoanine (47.21

±1.13 µM) (16), assoanine (3.87 ± 0.24 µM) (17), pseudolycorine (152.32 ± 32.06

µM) (18) cũng có khả năng ức chế AChE[5]

MeO

MeO

OMe OMe O

N

MeO

MeO

OMe OMe

N

OMe OMe

O O

N

O O

O O

CH3O

R4O R5 Sanguinine 13 R1=OH, R2=H, R3=Me, R4=H, R5=H

11-hydrogalathamine 14 R1=OH, R2=H, R3=Me, R4=Me, R5=OH

Epinorgalathamine 15 R1=H, R2=OH, R3=H, R4=Me, R5=H

N

H

R1

H H

H

H Me NMe2

M Iqbal Choudhary và cộng sự năm 2006 đã nghiên cứu một số hợp chất

triterpennoid alkaloid cô lập từ cây Buxus hyrcana có hoạt tính ức chế AChE:

N b -dimethylcyclobuxoviricine 21 R1= C=O, R 2 =Me, R 3 = OH

Hyrcamine 22 R1 = NH-tigloyl, R 2 = CH 2 OH, R 3 = AcO

Buxidine 23 R1= NH-benzoyl, R2= CH2OH, R3= OH

Buxandrine 24 R1= NH-benzoyl, R 2 = CH 2 OH, R 3 = AcO

CH2

Me C H H

N

OH Me H

H Me Me

Me O

25

Sắc kí lớp mỏng (TLC) dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động làmột dung môi hay hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua pha tĩnh là một chấthấp thu trơ, thí dụ như: silica gel hoặc nhôm oxid Pha tĩnh này được tráng thành mộtlớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tâm plastic Dochất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc kílớp mỏng

Ưu và nhược điểm của sắc kí lớp mỏng:

Ưu điểm: chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích; có thể phân tích đồng

thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích, tất cả các hợp

chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trí trên sắc kí lớp mỏng, dụng cụ lớn,kích thước mẫu lớn có thể kiểm soát được.

Nhược điểm: chất đem đi phân tích phải có tính kém bay hơi, hiệu quả tách

chất định lượng và khả năng tách lượng lớn không cao

TRÊN TLC

Để khảo sát sự ức chế AChE bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC), có rấtnhiều cách để thực hiện trong đó hai cách tiêu biểu nhất là sử dụng thuốc thử muối fastblue B và thuốc thử Ellman (phương pháp Ellman, ngoài TLC có thể dùng phươngpháp 96 giếng với thuốc thử Ellman)

B [8]

CH3COOH Naphthyl

+

H3CO N

OCH3

N

H3CO N

OCH3

N

OH OH

Fast Blue Salt B

Azo dye (tím) Acetylcholinesterase

Hình 3 Phản ứng của acetylcholinesterase với 1-naphthyl acetate và nhuộm màu tím trên thử nghiệm

sắc kí lớp mỏng.

α-naphthyl acetate bị thủy phân với xúc tác enzyme AChE thành sản phẩm là α-naphthol Sau đó,

sản phẩm này tiếp tục phản ứng với thuốc thử muối fast blue B cho hợp chất azo có màu tím.

Tại những vị trí enzyme bị ức chế thì trên bản mỏng sẽ quan sát thấy xuất hiện các điểm màu trắng trên nền tím do không xảy ra phản ứng giữa α-naphthol và thuốc thử muối fast blue B sau khi bản mỏng được chấm mẫu, giải ly, phun enzyme và phun thuốc thử.

Củ của họ Amaryllidaceae: Galanthus nivalis (Champagne, Switzerland), Leucojum vernum (Vuillens, Switzerland), Narcissus pseudonarcissus (Oron-la-Ville, Switzerland), củ của Ismene festalis, Nerine bowdenii, Crinum powellii và Sprekelia formosissima (Charmois Garden Centre, Savigny, Switzerland) và phần ngọn của Chelidonium majus (Papaveraceae, Dixa AG (St Gallen, Switzerland)).

10 g nguyên liệu khô và nhuyễn được trích bằng phương pháp ngâm dầm với 250

ml EtOH 80% trong 12 giờ Dịch chiết được cô quay ở áp suất thấp để thu được caoEtOH Cao thô EtOH được pha thành dung dịch có nồng độ 1 mg/ml để thực hiện sắc

2.2.3.2 Cách pha các dung dịch

Dung dịch enzyme AChE: hòa tan dung dịch AChE 1000 U vào 150 ml dung

dịch đệm tris-HCl 0.05 M (pH 7.8) Sau đó thêm 150 mg BSA vào dung dịch trên để

ổn định enzyme AChE cho đến khi tiến hành thí nghiệm (được giữ ở 4 ℃)

Dung dịch α-naphthyl acetatenaphthyl acetate: hòa tan 250 mg α-naphthyl acetate trong 100 ml

ethanol

-naphthyl acetate Phun enzyme AChE

-naphthyl acetate Sắc kí bản mỏng, giải ly trong

hệ CHCl 3 -naphthyl acetateMeOH-naphthyl acetateH 2 O (65:35:5)

Quan sát các vết trên bản mỏng

-naphthyl acetate Phun dung dich thuốc thử muối fast blue B

Dung dịch muối fast blue B: hòa tan 400 mg muối fast blue B trong 160 ml nước

cất

Dung dich thuốc thử: trộn 10 ml α-naphthyl acetate vào 40 ml muối fast blue B.

Không pha trước hai dung dịch muối fast blue B và α-naphthyl acetate khi chưa sửdụng để tránh hiện tương thủy phân

Rửa sạch bản mỏng với acetone và sấy

khô bản mỏng

Chấm 15 µl chất chứng dương

galanthamine và mẫu cần khảo sát lên bản

mỏng sau đó giải ly bản mỏng trong hệ dung

môi CHCl3-MeOH-H2O (65:35:5)

Phun dung dịch enzyme AChE lên bản

mỏng chứa mẫu đã giải ly và sấy khô lại Sau

đó, tiến hành ủ bản mỏng ở 37 ℃ trong 20

phút

Phun dung dịch thuốc thử lên bản mỏng

sau khi đã tiến hành ủ enzyme và đợi trong 1-2

phút để phản mỏng enzyme rồi quan

sát bản mỏng

A Marson và cộng sự (2001) dùng TLC khảo sát sự ức chế AChE với 2 chất đối

chứng dương và thu được kết quả sau

Đối với physostigmine, nồng độ tối thiểu để có thể quan sát được sự ức chế AChE(giới hạn phát hiện) là 0.001 µg, còn galanthamine thì ở mức 0.01 µg (hình 4)

Hình 4 Sơ đồ quy trình thực hiện thử nghiệm ức chế

AChE với thuốc thử muối fast blue B bằng sắc kí lớp mỏng

Một số alkaloid khác như boldine, caffeine và quinine ức chế AChE ở nồng độ tốithiểu lần lượt là 0.1 µg, 1 µg và 10 µg Một flavonoid là kaempferol cũng cho hoạt ứcchế ở 10 µg Tất cả các hợp chất này đều cho hoạt tính kém.

Tất cả các dịch chiết từ cao EtOH của các cây khảo sát đều thể hiện hoạt tính ức

chế AChE ngoại trừ cao của Sprekelia formosissima.

Hình 6 Bản mỏng sau khi ủ với enzyme và phun hỗn hợp dung dịch thuốc thử được thực hiện trên: 1

galathamine , và một số cao EtOH 80% (15 μg) như g) như 2 Galanthus nivalis, 3 Leucojum vernum, 4 Narcissus

pseudonarcissus, 5 Chelidonium majus, 6 Ismene festalis, 7 Nerine bowdenii, 8 Crinum powellii, 9 Sprekelia

CHH3

Boldine

N

N N N

H3C CH3

CH3

O O

Caffeine

N N O

Quinine

Hình 5 Bản mỏng sau khi ủ với enzym và phun hỗn hợp dung dịch thuốc thử được thực hiện trên

hai chất đối chứng: (a) galanthamine (0.0001-1 μg) như g) và (b) physostigmine (0.00001-0.1 μg) như g).

Dung môi giải ly: CHCl 3 -MeOH-H 2 O (65:35:5).

2.2.3.3 Cơ sở lý thuyết

S S

OH O N O

O O

N O O HO

N O O HO

O

N O O

HO +

Acetylthiocholine (ATC) bị thủy phân với xúc tác enzyme AChE thành sản phẩm làthiocholine Sau đó, sản phẩm này tiếp tục phản ứng với thuốc thử 5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) cho sản phẩm 5-thio-2-nitrobenzoate có màu vàng.

Tại những vị trí enzyme bị ức chế thì trên bản mỏng sẽ quan sát thấy xuất hiệncác điểm màu trắng trên nền vàng do không xảy ra phản ứng giữa thiocholine vàthuốc thử Ellman sau khi bản mỏng được chấm mẫu, giải ly, phun enzyme và phunthuốc thử

2.2.3.4 Nguyên liệu

1, Hymanocallis × festails ‘Zwanenburg’; 2, Chlidanthus fragrans Herb; 3, Narcissus ‘Avalanche’ (Tazetta); 4, Nerine bowdenii; 5, Narcissus ‘Grand Soleil d’Or’(Tazetta); 6, Zephyranthes candida (Lindl) Herb; 7, Crinum × powellii Baker; 8, Polianthes tuberosaL; 9, Amaryllis belladonna L; 10, Eucharis amazonica Linden exPlanch; 11, × Hippeastrelia; 12, Habranthus robustus Herb Ex Sweet; 13, Rhodophiala bifida (Herb) Traub; 14, Hymencallis ‘Sulphur’ Queen’; 15, Sprekelia formosissima (L.) Herb.

2.2.3.5 Hóa chất, dụng cụ và cách pha hóa chất

2.2.3.5.1 Hóa chất và dụng cụ

Bản silica gel 60 F254 (Merck)

Enzyme AChE, tris-HCl, DTNB (Sigma), ATCI (Sigma), BSA, galanthaminehydrobromide, physostigmine (eserine), carbachol (Sigma); pancracine, lycorine,tazettine (Dr Serap Whitmer)

2.2.3.5.2 Cách pha các dung dịch

Dung dịch đệm A: tris-HCl 50 mM pH 8.

Dung dịch đệm B: đệm A chứa 0.1 % BSA.

Dung dịch enzyme: từ mẫu enzyme AChE đã được đông cô chân không, pha

loãng với đệm A để thu được dung dịch enzyme gốc có nồng độ 1000 U/ml Tiếp tụcpha loãng dung dịch enzyme với đệm B để thu được dung dịch enzyme AChE có nồng

độ 3 U/ml dùng cho sắc kí lớp mỏng

Hình 5 Sơ đồ quy trình thực hiện thử nghiệm ức chế

AChE với thuốc thử Ellman bằng sắc kí lớp mỏng

Dung dịch chất nền: đệm A chứa 1 mM acetylthiocholine iodide (ATCI)

Thuốc thử Ellman: đệm A chứa 1 mM DTNB và 1 mM ATCI.

2.2.3.6.2 Quy trình thực hiện

Pha mẫu cao methanol và toluene

trong methanol để được mẫu có nồng độ

10 mg/ml

2.5 μg) như l của từng loại dung dịch mẫu nói

trên và dung dịch đối chứng galanthalmine

được dùng để chấm lên bản mỏng rồi giải

ly bản mỏng trong hệ dung môi

CHCl3-MeOH (8:2)

Phun dung dịch thuốc thử Ellman lên

bản mỏng đã sấy khô cho đến khi bản

mỏng bão hòa dung dich thuốc thử

Sấy khô bản mỏng trong 3-5

phút rồi phun dung dịch enzyme

AChE 3 U/ml lên bản mỏng

Sau khoảng 5 phút thì bản mỏng

sẽ chuyển sang màu vàng và có

những điểm trắng thể hiện khả năng ức chế enzyme AChE Ghi nhận kết quả trong 15phút từ khi bản mỏng chuyển màu vì sau 20-30 phút thì kết quả sẽ biến mất

-naphthyl acetate Phun thuốc thử Ellman

-naphthyl acetate Sắc kí bản mỏng, giải ly trong

hệ CHCl 3 -naphthyl acetateMeOH (8:2)

Sấy khô bản mỏng 3-naphthyl acetate5 phút

Sấy khô bản mỏng 3-naphthyl acetate5 phút

Mẫu đã giải ly trên bản mỏng

Mẫu đã giải ly trên bản mỏng

Quan sát các vết trên bản mỏng

-naphthyl acetate Phun dung dịch enzyme AChE

Tương tự như các bước trên, chấm 1.5 μg) như l galanthamine, physostigmine,pancracine, lycorine, tazettine, carbachol với các nồng độ khác nhau (5 mM – 5 µM)lên bản mỏng để xác định nồng độ tối thiểu để có thể quan sát được sự ức chế enzymeAChE là những điểm trắng trên nền màu vàng.

In Kyung Rhee và cộng sự (2001) thử nghiệm trên cao methanol và toluene của 15

loại cây thuộc họ Amaryllidaceae và một số chất đối chứng dương thu được các kết

quả sau:

Hình 7 Kết quả ức chế AChE trên TLC của 15 cao methanol nguyên liệu thuộc họ

Amaryllidaceae (1, Hymanocallis × festails ‘Zwanenburg’; 2, Chlidanthus fragrans Herb; 3, Narcissus ‘Avalanche’ (Tazetta); 4, Nerine bowdenii; 5, Narcissus ‘Grand Soleil

d’Or’(Tazetta); 6, Zephyranthes candida (Lindl) Herb; 7, Crinum × powellii Baker; 8,

Polianthes tuberosaL; 9, Amaryllis belladonna L; 10, Eucharis amazonica Linden exPlanch;

11, × Hippeastrelia; 12, Habranthus robustus Herb Ex Sweet; 13, Rhodophiala bifida

(Herb) Traub; 14, Hymencallis ‘Sulphur’ Queen’; 15, Sprekelia formosissima (L.) Herb) và

chất đối chứng galanthamine.