Khảo sát sự ức chế acetylcholinesterase trên sắc kí lớp mỏng

Khảo sát sự ức chế acetylcholinesterase trên sắc kí lớp mỏng

Mục lục Bản từ viết tắt ACh acetylcholine AChE acetylcholinesterase AChI chất ức chế acetylcholinesterase ATC acetylthiocholine ATCI acetylthiocholine iodide BSA bovine serum albumin DTNB 5,5’- dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) HPTLC sắc kí lớp mỏng hiệu cao TLC sắc kí lớp mỏng DTNB 5-thio-2-nitrobenzoate 2 KHẢO SÁT SỰ ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE TRÊN SẮC KÍ LỚP MỎNG TỔNG QUAN 1.1 BỆNH ALZHEIMER Bệnh Alzheimer bệnh thoái hóa thần kinh phổ biến đặc chưng giảm nồng độ chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine (ACh) não Một số điều trị lâm sàn bệnh Alzheimer kích thích thụ thể tiết ACh kéo dài tồn ACh khe thần kinh sinap cách sử dụng chất có khả tích trữ làm tăng nồng độ ACh Ước tính có khoảng 50-60 thuốc đưa vào thử nghiệm lâm sàn việc điều trị bệnh Alzheimer việc sử dụng chất ức chế enzyme acetylcholinesterase (có vai trò thủy phân ACh) hứa hẹn đầy tiềm việc điều trị bệnh Alzheimer [1] Hình Bệnh Alzheimer SƠ LƯỢC VỀ ACETYLCHOLINESTERASE VÀ CHẤT ỨC CHẾ 1.2 ACETYLCHOLINESTERASE 1.2.1 Acetylcholinesterase Enzyme acetylcholinesterase (AChE) enzyme quan động vật kể loài người AChE có nhiệm vụ chuyển hóa chất dẫn truyền thần kinh (ACh) sau ACh truyền thông tin Nếu chất dẫn truyền thần kinh không chuyển hóa sau hoàn thành nhiệm vụ có liên quan nghỉ điều gây co thắt , tê liệt số vấn đề khác AChE tìm thấy khe synap, tế bào thần kinh thông qua luồng thông tin Khi ACh qua, AChE chuyển hóa ACh thành choline acid acetic 3 AChE chuyển hóa ACh trongs, nhanh để giữ cho khe synap rõ ràng để thông tin hỗn hợp không xảy [2] 1.2.2 Chất ức chế acetylcholinesterase Chất ức chế acetylcholinesterase (AChI) hợp chất có khả ức chế phản ứng thủy phân acetylcholine, chia làm hai nhóm chất ức chế thuận nghịch chất ức chế không thuận nghịch (chất ức chế thuận nghịch chất ức chế tạo liên kết với enzyme liên kết không nối liên kết hydrogen, liên kết Van der waals, nối liên kết ion; chất ức chế bất thuận nghịch chất ức chế tạo liên kết với enzyme liên kết cộng hóa trị [1] Hầu chất ức chế tìm chứa nitrogen, có mức độ ức chế [3]: Ức chế mạnh : phần trăm ức chế enzyme lớn 60 % Ức chế trung bình: phần trăm ức chế enzyme từ 15 - 50 % Ức chế yếu: phần trăm ức chế enzyme nhỏ 15 % Một số hợp chất ức chế enzyme sử dụng việc điều trị bệnh Alzheimer: 4 Hình Công thức số hợp chất ức chế [1] Tacrine (1) thuốc cục quản lí dược thực phẩm cho phép áp dụng vào việc điều trị bệnh Alzheimer (1993), chất ức chế không cạnh tranh thuận nghịch Donepezil (2) thuốc thứ hai cục quản lí dược vả thực phẩm cho phép áp dụng cho việc điều trị bệnh Alzheimer (1996), chất ức chế thuận nghịch Rivastigmine (3) chất ức chế không cạnh tranh thuộc nhóm carbamates, liên kết với bề mặt mang nhóm ester enzyme, thuốc cục quản lí dược thực phẩm cho phép sử dụng vào năm 2000 Galathamine (4) phenanthrene alkaloid, chất ức chế cạnh tranh thuận nghịch, cục quản lí dược thực phẩm cho phép sử dụng vào năm 2001 Huperzine A (5) huperzine B (6) hai alkaloid cô lập từ loài thảo mộc Huperzia serrate Cả hai hợp chất chất ức chế thuận nghịch đầy tiềm có tính chọn lọc cao, cho phép sử dụng Trung Quốc 5 Physostigmine (7) (eserine) chất ức chế thuận nghịch có cấu amine bậc Eptastigmine (8) dẫn xuất physostigmine, nhóm carbamoylheptyl thay nhóm carbamoylmethyl vị trí thứ vòng indole [1] Dae Keun Kim cộng năm 2004 cô lập hợp chất isoquinoline alkaloid từ Corydails speciosa có hoạt tính ức chế AChE thu giá trị IC 50 (ức chế enzyme 50%): corynoxidine (89 µM) (9), protopine (16.1 µM) (10), palmatine (5.8 µM) (11), berberine (3.3 µM) (12)[4] Ngoài alkaloid galanthamine, huperzine A huperzine B có alkaloid khác: sanguinine (0.1 0.01 µM) (13), 11-hydroxygalanthamine (1.61 0.21 µM) (14), epinorgalanthamine (9.60 0.65 µM) (15); lycorine: oxoassoanine (47.21 1.13 µM) (16), assoanine (3.87 0.24 µM) (17), pseudolycorine (152.32 32.06 µM) (18) có khả ức chế AChE[5] 6 M Iqbal Choudhary cộng năm 2006 nghiên cứu số hợp chất triterpennoid alkaloid cô lập từ Buxus hyrcana có hoạt tính ức chế AChE: hyrcanone (145.0 11.5) (19), buxabenzacinine (468.0 5.0 µM) (20), Nbdimethylcycloxobuxoviricine (310.0 22.1 µM) (21), hyrcamine (83.0 1.3 µM) (22), buxidine (210.6 8.3 µM) (23), buxandrine (175.4 11.0 µM) (24), buxippine-K (25)[6] 7 1.3 GIỚI THIỆU SẮC KÍ LỚP MỎNG[7] Sắc kí lớp mỏng (TLC) dựa chủ yếu vào tượng hấp thu pha động dung môi hay hỗn hợp dung môi, di chuyển ngang qua pha tĩnh chất hấp thu trơ, thí dụ như: silica gel nhôm oxid Pha tĩnh tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên phẳng kiếng, nhôm tâm plastic Do chất hấp thu tráng thành lớp mỏng nên phương pháp gọi sắc kí lớp mỏng Ưu nhược điểm sắc kí lớp mỏng: Ưu điểm: cần lượng mẫu để phân tích; phân tích đồng thời mẫu chất chuẩn đối chứng điều kiện phân tích, tất hợp chất mẫu phân tích định vị trí sắc kí lớp mỏng, dụng cụ lớn, kích thước mẫu lớn kiểm soát Nhược điểm: chất đem phân tích phải có tính bay hơi, hiệu tách chất định lượng khả tách lượng lớn không cao KHẢO SÁT SỰ ỨC CHẾ ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE TRÊN TLC Để khảo sát ức chế AChE phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC), có nhiều cách để thực hai cách tiêu biểu sử dụng thuốc thử muối fast blue B thuốc thử Ellman (phương pháp Ellman, TLC dùng phương pháp 96 giếng với thuốc thử Ellman) 2.1 THỬ NGHIỆM TRÊN TLC VỚI THUỐC THỬ MUỐI FAST BLUE B[8] 8 2.1.1 Cơ sở lý thuyết Hình Phản ứng acetylcholinesterase với 1-naphthyl acetate nhuộm màu tím thử nghiệm sắc kí lớp mỏng α-naphthyl acetate bị thủy phân với xúc tác enzyme AChE thành sản phẩm α-naphthol Sau đó, sản phẩm tiếp tục phản ứng với thuốc thử muối fast blue B cho hợp chất azo có màu tím Tại vị trí enzyme bị ức chế mỏng quan sát thấy xuất điểm màu trắng tím không xảy phản ứng α-naphthol thuốc thử muối fast blue B sau mỏng chấm mẫu, giải ly, phun enzyme phun thuốc thử 2.1.2 Nguyên liệu Củ họ Amaryllidaceae: Galanthus nivalis (Champagne, Switzerland), Leucojum vernum (Vuillens, Switzerland), Narcissus pseudonarcissus (Oron-la-Ville, Switzerland), củ Ismene festalis, Nerine bowdenii, Crinum powellii Sprekelia formosissima (Charmois Garden Centre, Savigny, Switzerland) phần Chelidonium majus (Papaveraceae, Dixa AG (St Gallen, Switzerland)) 10 g nguyên liệu khô nhuyễn trích phương pháp ngâm dầm với 250 ml EtOH 80% 12 Dịch chiết cô quay áp suất thấp để thu cao 9 EtOH Cao thô EtOH pha thành dung dịch có nồng độ mg/ml để thực sắc kí lớp mỏng 2.1.3 Dụng cụ, hóa chất cách pha hóa chất 2.2.3.1 Dụng cụ hóa chất Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck) Al2O3 60 F254 trung tính loại E (Merck) Enzyme AChE (Sigma), galanthamine (Sigma), tris-HCl, bovine serum albumin (BSA) α-naphthyl acetate (Merck), muối fast blue B, physostigmine (eserine), chlorogenic acid, quinine, caffeine (Fluka), số dung môi thông dung ethanol, acetone, isopropanol 2.2.3.2 Cách pha dung dịch Dung dịch enzyme AChE: hòa tan dung dịch AChE 1000 U vào 150 ml dung dịch đệm tris-HCl 0.05 M (pH 7.8) Sau thêm 150 mg BSA vào dung dịch để ổn định enzyme AChE tiến hành thí nghiệm (được giữ ) Dung dịch α-naphthyl acetate: hòa tan 250 mg α-naphthyl acetate 100 ml ethanol Dung dịch muối fast blue B: hòa tan 400 mg muối fast blue B 160 ml nước cất Dung dich thuốc thử: trộn 10 ml α-naphthyl acetate vào 40 ml muối fast blue B Không pha trước hai dung dịch muối fast blue B α-naphthyl acetate chưa sử dụng để tránh tương thủy phân 2.1.4 Quy trình thực 10 10 Hình Bản mỏng sau ủ với enzym phun hỗn hợp dung dịch thuốc thử thực hai chất đối chứng: (a) galanthamine (0.0001-1 μg) (b) physostigmine (0.00001-0.1 μg) Dung môi giải ly: CHCl3-MeOH-H2O (65:35:5) 2.2 THỬ NGHIỆM TLC VỚI THUỐC THỬ ELLMAN 2.2.1 Khảo sát ức chế cho kết dương tính thật[9] 2.2.3.3 Cơ sở lý thuyết 13 13 Hình Sơ đồ xác định hoạt tính enzyme phương pháp Ellman Acetylthiocholine (ATC) bị thủy phân với xúc tác enzyme AChE thành sản phẩm thiocholine Sau đó, sản phẩm tiếp tục phản ứng với thuốc thử 5,5’-dithiobis-(2nitrobenzoic acid) (DTNB) cho sản phẩm 5-thio-2-nitrobenzoate có màu vàng Tại vị trí enzyme bị ức chế mỏng quan sát thấy xuất điểm màu trắng vàng không xảy phản ứng thiocholine thuốc thử Ellman sau mỏng chấm mẫu, giải ly, phun enzyme phun thuốc thử 2.2.3.4 Nguyên liệu 1, Hymanocallis × festails ‘Zwanenburg’; 2, Chlidanthus fragrans Herb; 3, Narcissus ‘Avalanche’ (Tazetta); 4, Nerine bowdenii; 5, Narcissus ‘Grand Soleil d’Or’(Tazetta); 6, Zephyranthes candida (Lindl) Herb; 7, Crinum × powellii Baker; 8, Polianthes tuberosaL; 9, Amaryllis belladonna L; 10, Eucharis amazonica Linden exPlanch; 11, × Hippeastrelia; 12, Habranthus robustus Herb Ex Sweet; 13, Rhodophiala bifida (Herb) Traub; 14, Hymencallis ‘Sulphur’ Queen’; 15, Sprekelia formosissima (L.) Herb 2.2.3.5 Hóa chất, dụng cụ cách pha hóa chất 2.2.3.5.1 Hóa chất dụng cụ Bản silica gel 60 F254 (Merck) 14 14 Enzyme AChE, tris-HCl, DTNB (Sigma), ATCI (Sigma), BSA, galanthamine hydrobromide, physostigmine (eserine), carbachol (Sigma); pancracine, lycorine, tazettine (Dr Serap Whitmer) 2.2.3.5.2 Cách pha dung dịch Dung dịch đệm A: tris-HCl 50 mM pH Dung dịch đệm B: đệm A chứa 0.1 % BSA Dung dịch enzyme: từ mẫu enzyme AChE đông cô chân không, pha loãng với đệm A để thu dung dịch enzyme gốc có nồng độ 1000 U/ml Tiếp tục pha loãng dung dịch enzyme với đệm B để thu dung dịch enzyme AChE có nồng độ U/ml dùng cho sắc kí lớp mỏng Dung dịch chất nền: đệm A chứa mM acetylthiocholine iodide (ATCI) Thuốc thử Ellman: đệm A chứa mM DTNB mM ATCI 2.2.3.6 Phương pháp 2.2.3.6.1 Mẫu chiết Phơi khô nghiền nhuyễn nguyên liệu 15 loại Amaryllidaceae thành dạng bột Bột loại (1 g) trích phương pháp ngâm dầm với 10 ml methanol toluene riêng biệt nhiệt độ phòng 24 cho lần trích trình lặp lại tuần Các dịch chiết cô quay áp suất thấp thu cao methanol cao toluene 15 15 Quy trình thực 2.2.3.6.2 Mẫu Mẫu với với nồng nồng độ độ 10 10 mg/ml mg/ml - Sắc kí mỏng, giải ly hệ CHCl3-MeOH (8:2) Mẫu Mẫu đã giải giải ly ly trên bản mỏng mỏng - Phun thuốc thử Ellman Sấy Sấy khô khô bản mỏng mỏng 3-5 3-5 phút phút - Phun dung dịch enzyme AChE Quan Quan sát sát các vết vết trên bản mỏng mỏng Pha mẫu cao methanol toluene methanol để mẫu có nồng độ 10 mg/ml 2.5 μl loại dung dịch mẫu nói dung dịch đối chứng galanthalmine dùng để chấm lên mỏng giải ly mỏng hệ dung môi CHCl 3MeOH (8:2) Phun dung dịch thuốc thử Ellman lên mỏng sấy khô mỏng bão hòa dung dich thuốc thử Sấy khô mỏng 3-5 phút phun dung dịch enzyme AChE Hình Sơ đồ quy trình thực thử nghiệm ức chế U/ml lên mỏng AChE với thuốc thử Ellman sắc kí lớp mỏng Sau khoảng phút mỏng chuyển sang màu vàng có điểm trắng thể khả ức chế enzyme AChE Ghi nhận kết 15 phút từ mỏng chuyển màu sau 20-30 phút kết biến Tương tự bước trên, chấm 1.5 μl galanthamine, physostigmine, pancracine, lycorine, tazettine, carbachol với nồng độ khác (5 mM – µM) 16 16 lên mỏng để xác định nồng độ tối thiểu để quan sát ức chế enzyme AChE điểm trắng màu vàng Kết 2.2.3.7 Sử dụng lượng dung dịch phun phải phù hợp Nếu phun nhiều điểm trắng vàng bị lan rộng kéo dài ta khó quan sát kết Và mỏng làm khô sau phun chất phun dung dịch enzyme AChE In Kyung Rhee cộng (2001) thử nghiệm cao methanol toluene 15 loại thuộc họ Amaryllidaceae số chất đối chứng dương thu kết sau: Hình Kết ức chế AChE TLC 15 cao methanol nguyên liệu thuộc họ Amaryllidaceae (1, Hymanocallis × festails ‘Zwanenburg’; 2, Chlidanthus fragrans Herb; 3, Narcissus ‘Avalanche’ (Tazetta); 4, Nerine bowdenii; 5, Narcissus ‘Grand Soleil d’Or’(Tazetta); 6, Zephyranthes candida (Lindl) Herb; 7, Crinum × powellii Baker; 8, Polianthes tuberosaL; 9, Amaryllis belladonna L; 10, Eucharis amazonica Linden exPlanch; 11, × Hippeastrelia; 12, Habranthus robustus Herb Ex Sweet; 13, Rhodophiala bifida (Herb) Traub; 14, Hymencallis ‘Sulphur’ Queen’; 15, Sprekelia formosissima (L.) Herb) chất đối chứng galanthamine 17 17 Hình : Kết ức chế AChE TLC 15 cao toluene nguyên liệu thuộc họ Amaryllidaceae (1, Hymanocallis × festails ‘Zwanenburg’; 2, Chlidanthus fragrans Herb; 3, Narcissus ‘Avalanche’ (Tazetta); 4, Nerine bowdenii; 5, Narcissus ‘Grand Soleil d’Or’(Tazetta); 6, Zephyranthes candida (Lindl) Herb; 7, Crinum × powellii Baker; 8, Polianthes tuberosaL; 9, Amaryllis belladonna L; 10, Eucharis amazonica Linden exPlanch; 11, × Hippeastrelia; 12, Habranthus robustus Herb Ex Sweet; 13, Rhodophiala bifida (Herb) Traub; 14, Hymencallis ‘Sulphur’ Queen’; 15, Sprekelia formosissima (L.) Herb) chất đối chứng galanthamine Bảng Nồng độ tối thiểu quan sát khả ức chế enzyme số chất đối chứng phương pháp Ellman Akaloid Giới hạn phát (μg) Galanthamine 0.01 Physostigmine 0.01 Pancracine 0.1 Carbachol 0.1 Lycorine 0.2 Tazettine >0.5 Khi sử dụng nhiều loại mỏng khác nhau: silica gel, nhôm oxid, pha đảo, tinh bột, polyamide rút kết quả[8]: i Bản mỏng nhôm oxid cho vàng rõ điểm trắng lại kéo dài so với silica gel 18 18 ii Bản silica gel cần lượng enzyme nhiều để quan sát ức chế iii Sau giải ly với hệ dung môi phù hợp nhôm oxid quan sát thấy tượng kéo dài đuôi Bề dày silica gel ảnh hưởng đến kết Thí dụ với bề dày mm nhận vàng rõ lại cần lượng enzyme mẫu lớn Khảo sát ức chế cho kết dương tính giả[10] 2.2.2 Ngoài chất cho khả ức chế thực bên cạnh có chất cho kết dương tính thực tế hoạt tính ức chế AChE Dựa vào phương pháp Ellman phát chất cho kết dương tính giả thử nghiệm với số aldehyde (heptanal, decanal, cinnamaldehyde, 4- dimethylaminobenzaldehyde, 3-metoxy-4-hyroxybenzaldehyde) số amine (diethylamine, triethylamine, ethanolamine, triethanolamine, hexylamine, trypamine hydrochloride tyramine hydrocloride) Thực song song hai quy trình: Quy trình Mẫu với nồng độ 10 mg/ml - Sắc kí mỏng, giải ly hệ CHCl3-MeOH (8:2) Mẫu giải ly mỏng - Phun thuốc thử Ellman Sấy khô mỏng 3-5 phút - Phun dung dịch enzyme AChE Quy trình Mẫu với nồng độ 10 mg/ml - Sắc kí mỏng, giải ly hệ CHCl3-MeOH (8:2) Mẫu giải ly mỏng - Phun dd thiocholine • Enzyme gốc U/ml ATCI mM Sấy khô •mỏng 3-5 phút - Phun dung dịch DTNB mM - Sấy khô mỏng • Quan sát vết Quan sát vết mỏng mỏng Quy trình 1: giống quy trình khảo sát chất ức chế dương tính thật Chấm mẫu aldehyde amine pha methanol với nồng độ khác 19 19 trên hai loại mỏng silica gel nhôm oxid Sau phun hỗn hợp thuốc thử DTNB-ATCI (1mM DTNB 1mM ATCI pha đệm 50 mM tris-HCl (pH = )) mỏng bão hòa, để khô khoảng 3-5 phút phun dung dịch enzyme AChE U/ml Sau phút, mỏng xuất vệt màu trắng • màu vàng Quy trình 2: giống quy trình thứ tự phun thuốc thử khác Sau mỏng chứa mẫu giải, phun dung dịch trộn dung dịch enzyme AChE U/mL ATCI mM ( dung dịch thiocholine) ủ mỏng 15 phút cuối phun dung dịch DTNB mM lên mỏng thu diểm trắng vàng bàn mỏng Nếu chất ức chế thật (như galanthamine physostigmine) phun thuốc thử DTNB lên bảng mỏng theo quy trình không quan sát thấy điểm trắng vàng chất ức chế giả cho thấy điểm trắng vàng Kết TLC theo quy trình cho thấy có ức chế AChE ức chế phản ứng ATC với DTNB Kết TLC theo quy trình cho thấy có ức chế phản ứng ATC với DTNB So sánh kết TLC theo hai quy trình phân biệt nhóm hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme AChE hay ức chế phản ứng ATC với DTNB In K Rhee cộng (2001) đánh giá ức chế dương tính giả TLC với số aldehyde, amine, dịch chiết từ cao ethanol cua Nerrine bowdenii Dịch Cao toluene N hexane : bowdenii nước methanol hexane 50 % Dịch Dịch hexane methanol 50 % Dịch nước chlorofo Dịch Dịch rm chlorofor nước m Hình Các phân đoạn chiết cao toluene N bowdenii 20 20 Bảng Kết xác định dương tính giả thừ nghiệm ức chế enzyme AChE Bản silica gel Nồng độ Bản nhôm oxid [mM (%)] Ức chế phản ứng hóa học Ức chế enzyme Ức chế phản ứng hóa học Ức chế enzyme Heptanal 720 (10%) + + + + Decanal 530 (10%) + + + + Cinanamaldehyde 790 (10%) + + + + Anisaldehyde 820 (10%) + + + + Benzaldehyde 100 + + - - 4-dimethylaminobenzaldehyde 100 - + - + 3-etoxy-4-hydroxybenzaldehyde 100 - + - + Diethylamine 960 (10%) - + - + Triethylamine 717 (10%) - + - + Ethanolamine 1670 (10%) - - - - Triethanolamine 750 (10%) - + - + Hexylamine 756 (10%) + + + + Tryptamine 50 + + + + Tyramine 50 - + - + Galanthamine - + - + Physostigmine - + - + Hợp chất Áp dụng phương pháp xác định hợp chất cao thô thực có hoạt tính ức chế AChE Một thí dụ trích lỏng-lỏng cao toluene Nerine bowdenii với dung môi hexane, chloroform, methanol 50% (methanol pha nước) thu dịch tương ứng (hình 9) Các dịch chiết hexane, chloroform, methanol 50% tiến hành theo hai quy trình để đánh giá hoạt tính ức chế AChE 21 21 A B C Hình 10 Thử nghiệm xác định khả ức chế AChE tượng dương tính giả dịch chiết từ Nerine bowdenii Bản mỏng chấm mẫu dịch chiết toluene (1), hexane (2), chloroform (3), methanol 50% giải ly hệ dung môi CHCl3 - methanol (10:1) • Hình A: vệt màu trắng vàng thể ức chế phun DTNB mM/ ATCI mM tris- • hydrochloride 50 mM phun units/mL AChE Hình B: vệt màu trắng vàng thể ức chế giả phun units/mL AChE/ ATCI mM • (thiocholine) phun DTNB mM Hình C : hình với thuốc thử anisaldehyde Từ kết thu (hình 10) cho thấy dịch chiết có chứa nhiều hợp chất ức chế, nhiên có số hợp chất có hoạt tính ức chế Trong dịch chiết có dịch chiết chloroform có chứa nhiều hợp chất ức chế Từ sử dung cao chiết chloroform để cô lập hợp chất ức chế có Nerine bowdenii 2.2.3 Khảo sát ức chế enzyme sắc kí mỏng hiệu cao[11,12,13] Ngoài kỹ thuật TLC, kỹ thuật sắc kí lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) áp dụng để khảo sát ức chế AChE Kỹ thuật HPTLC dùng để định tính, thử tinh khiết , bán định lượng định lượng Về nguyên tắc HPTLC không khác nhiều so với TLC Điểm khác chủ yếu trình chấm sắc ký điều khiển thực máy, chất hấp thu pha tĩnh có kích thước nhỏ hơn, số vết, lượng dịch chiết chấm mỏng xác lập máy vi tính Quá trình chấm dịch chiết thực với hỗ trợ máy nén khí bình khí nén Sau triển khai, sắc ký đồ chụp ảnh qua buồng chụp (reprostar 3) kết đánh giá phần mềm Videoscan 22 22 HPTLC cho phép chấm nhanh nhiều lần dung dịch pha loãng chất cần phân tích Bản mỏng tráng sẵn chất hấp thu có chất phát quang thích hợp Khi làm sắc ký lớp mỏng bán định lượng, độ xác kết phân tích phụ thuộc nhiều vào độ xác lượng chất thử đưa lên mỏng, tức thể tích dung dịch chấm lên mỏng Do đó, với trường hợp phân tích bán định lượng phải dùng mao quản định mức xác Khi không cần định lượng dùng micropipet ống mảo quản thường Theo nghiên cứu Christel Weins cộng năm 1996 sử dụng kỹ thuật HPTLC đánh giá ức chế AChE thu kết bảng Bảng Giới hạn xác định hợp chất ức chế cholinesterase HPTLC Cơ chất Parathion-ethyl sau oxi hóa Paraoxon-ethyl Paraoxon-methyl Mevinphos Dichlorvos Carbaryl Aldicarb Butoxycarboxim Butocarboxim Oxamyl Giới hạn xác định (ng) 0.045 0.013 0.400 0.200 0.200 0.200 0.400 0.100 0.800 0.800 23 23 Pentachlorophenol 20.000 Mẩu chất chuẩn Sắc kí lớp mỏng chọn lọc Rửa mỏng Linomat Chuẩn bị mỏng applicator Áp dụng mẫu chất chuẩn Buồng giải li Phát triển mỏng Xác định vết, quét, phổ đồ Máy quét Xuất liệu hình ảnh kỹ thuật số Hình 10 Sơ đồ kỹ thuật HPTLC 24 24 TỔNG KẾT Các hợp chất cho hoạt tính ức chế enzyme AChE thường có chứa nitrogen Mặc dù TLC phương pháp định tính với độ nhạy không cao phương pháp giúp nhận biết hoạt tính ức chế enzyme vào giai đoạn đầu nghiên cứu Từ chọn cao thô có chứa nhiều hợp chất cho hoạt tính ức chế dể cô lập Bên cạnh phát hợp chất cho hoạt tính ức chế thật phát hợp chất có hoạt tính ức chế giả phương pháp Ellman Với thuốc thử muối fast blue B xác định hợp chất cho hoạt tính ức chế AChE kết luận hợp chất không cho kết dương tính giả chưa tìm thấy tài liệu vấn đề Đây hướng nghiên cứu việc khảo sát ức chế AChE Kĩ thuật HPTLC đánh giá ức chế enzym AChE, nhanh kĩ thuật TLC thông thường tiết kiệm thời gian hơn, dùng để bán định lượng định lượng 25 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Šarka Štěpánková*,aand Karel Komersb, (2008) Cholinesterase and cholinesterase Inhibitors Current Enzymee Inhibition 4, 160-171 [3] E A Adewusi1, N Moodley2 and V.Steekamp1*, (2010) Medicinal plants with cholinesterase inhibitory activity: A Review African Journal of Biotechnology 9(49),8257-8276 [4] Dae Keun Kim, Ki Taek Lee, Nam-In Baek , Sung-Hoon Kim2 , Hee Wook Park, Jong Pil Lim, Tae Yong Shin, Dong Ok Eom, Jae Heon Yang, and Jae Soon Eun, (2004) Acetylcholinesterase inhibitors from the aerial parts of Corydalis speciosa Archibes of Pharmacal Research 27(11), 1127-1131 [5] Susana Lo1pez, Jaume Bastida, Francesc Viladomat, Carles Codina*, (2002) Acetylcholinesterase inhibitory activity of some Amaryllidaceae alkaloids and Narcissus extracts Life Sciences 71, 2521-2529 [6] M Iqbal Choudharya)b)*, Salma Shahnaza), ShehnazParveena), Asaad Khalida), M Ahmed Mesaikb) , S Abdul Majeed Ayatollahic) ,and Atta-ur-Rahmana)b), (2006) New cholinesterase-inhibiting triterpenoid alkaloids from Buxus hyrcana Chemistry and Biodiversity 3, 1039-1051 [7] Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương Pháp Cô Lập Hợp Chất Hữu Cơ Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh, (2007) [8] A Marston, J Kissling and K Hostettmann, (2002) A Rapid TLC Bioautographic Method for the detection of Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase inhibitors in plants Phytochem Anal 13,51-54 [9] In Kyung Rhee*, Michiel van de Meent, Kornkanok Ingkanianan, Robert Verpoorte, (2001) Screening for acetylcholinesterase inhibitors from Amaryllidaceae using silica gel thin-layer chromatography in combination with bioactivity staining Journal of Chromatography A 915, 217-223 [10] In K Rhee, Richard M van Rijin and Robert Verpoorte, (2003) Qualitative determination of false-possive effects in the Acetylcholinesterase assay using thin layer chromatography Phytochem Anal 14, 127-131 26 26 [11] Christel Weins*, Hellmut Jork1, (1996) Toxicological evaluation of harmful substances by in situ enzymeatic and biological detection in high-performance thinlayer chromatography Journal of Chromatography A 750, 403-407 [12] ManMohan Srivastava, (2011) High-Performance Thin-Layer Chromatography (HPTLC) Springer-Verlag Berlin Heidelberg PHẦN TÀI LIỆU TRÊN INTERNET [2] http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=54(28/04/1012) [3] http://www.elmhurst.edu/~chm/vchembook/573inhibit.html (19/05/2012) [13] http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Tools/Phuongphap/HPTLC.htm (23/06/2012 27 27 [...]... có chứa nhiều hợp chất ức chế, tuy nhiên chỉ có một số hợp chất có hoạt tính ức chế Trong 4 dịch chiết chỉ có dịch chiết chloroform có chứa nhiều hợp chất ức chế nhất Từ đó có thể sử dung cao chiết chloroform để cô lập các hợp chất ức chế có trong Nerine bowdenii 2.2.3 Khảo sát sự ức chế enzyme bằng sắc kí bản mỏng hiệu năng cao[11,12,13] Ngoài kỹ thuật TLC, kỹ thuật sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)... Marson và cộng sự (2001) dùng TLC AChE với thuốc thử muối fast blue B bằng sắc kí lớp mỏng khảo sát sự ức chế AChE với 2 chất đối chứng dương và thu được kết quả sau Đối với physostigmine, nồng độ tối thiểu để có thể quan sát được sự ức chế AChE (giới hạn phát hiện) là 0.001 µg, còn galanthamine thì ở mức 0.01 µg (hình 4) 11 11 Một số alkaloid khác như boldine, caffeine và quinine ức chế AChE ở nồng... bản mỏng với acetone và sấy Mẫu Mẫu với với nồng nồng độ độ 1 1 mg/ml mg/ml - Sắc kí bản mỏng, giải ly trong hệ CHCl3-MeOH-H2O (65:35:5) Mẫu Mẫu đã đã giải giải ly ly trên trên bản bản mỏng mỏng - Phun enzyme AChE 0 0 Ủ Ủ bản bản mỏng mỏng trong trong 20 20 phút phút ở ở 37 37 C C - Phun dung dich thuốc thử muối fast blue B Quan Quan sát sát các các vết vết trên trên bản bản mỏng mỏng khô bản mỏng. .. của bàn mỏng Nếu là chất ức chế thật (như galanthamine và physostigmine) thì khi phun thuốc thử DTNB lên bảng mỏng theo quy trình 2 sẽ không quan sát thấy điểm trắng trên nền vàng còn chất ức chế giả sẽ cho thấy điểm trắng trên nền vàng Kết quả TLC theo quy trình 1 cho thấy có sự ức chế AChE và ức chế phản ứng giữa ATC với DTNB Kết quả TLC theo quy trình 2 chỉ cho thấy có sự ức chế phản ứng giữa ATC với... mg/ml - Sắc kí bản mỏng, giải ly trong hệ CHCl3-MeOH (8:2) Mẫu Mẫu đã đã giải giải ly ly trên trên bản bản mỏng mỏng - Phun thuốc thử Ellman Sấy Sấy khô khô bản bản mỏng mỏng 3-5 3-5 phút phút - Phun dung dịch enzyme AChE Quan Quan sát sát các các vết vết trên trên bản bản mỏng mỏng Pha mẫu cao methanol và toluene trong methanol để được mẫu có nồng độ 10 mg/ml 2.5 μl của từng loại dung dịch mẫu nói trên. .. có thể quan sát được sự ức chế iii Sau khi giải ly với hệ dung môi phù hợp thì trên bản nhôm oxid sẽ quan sát thấy hiện tượng kéo dài đuôi Bề dày của bản silica gel cũng ảnh hưởng đến kết quả Thí dụ như với bề dày 1 mm thì nhận được nền vàng rõ hơn nhưng lại cần một lượng enzyme và mẫu lớn Khảo sát sự ức chế cho kết quả dương tính giả[10] 2.2.2 Ngoài những chất cho khả năng ức chế thực sự thì bên cạnh... Quan sát các vết Quan sát các vết trên bản mỏng trên bản mỏng Quy trình 1: giống như quy trình khi khảo sát chất ức chế dương tính thật Chấm các mẫu aldehyde và amine đã được pha trong methanol với các nồng độ khác nhau 19 19 trên trên hai loại bản mỏng silica gel và nhôm oxid Sau đó phun hỗn hợp thuốc thử DTNB-ATCI (1mM DTNB và 1mM ATCI pha trong đệm 50 mM tris-HCl (pH = 8 )) cho đến khi bản mỏng. .. - Sắc kí bản mỏng, giải ly trong hệ CHCl3-MeOH (8:2) Mẫu đã giải ly trên bản mỏng - Phun thuốc thử Ellman Sấy khô bản mỏng 3-5 phút - Phun dung dịch enzyme AChE Quy trình 2 Mẫu với nồng độ 10 mg/ml - Sắc kí bản mỏng, giải ly trong hệ CHCl3-MeOH (8:2) Mẫu đã giải ly trên bản mỏng - Phun dd thiocholine • Enzyme gốc 3 U/ml ATCI 1 mM Sấy khô bản mỏng 3-5 phút - Phun dung dịch DTNB 1 mM - Sấy khô bản mỏng. .. để chấm lên bản mỏng rồi giải ly bản mỏng trong hệ dung môi CHCl 3MeOH (8:2) Phun dung dịch thuốc thử Ellman lên bản mỏng đã sấy khô cho đến khi bản mỏng bão hòa dung dich thuốc thử Sấy khô bản mỏng trong 3-5 phút rồi phun dung dịch enzyme AChE 3 Hình 5 Sơ đồ quy trình thực hiện thử nghiệm ức chế U/ml lên bản mỏng AChE với thuốc thử Ellman bằng sắc kí lớp mỏng Sau khoảng 5 phút thì bản mỏng sẽ chuyển... mẫu cần khảo sát lên bản mỏng sau đó giải ly bản mỏng trong hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (65:35:5) Phun dung dịch enzyme AChE lên bản mỏng chứa mẫu đã giải ly và sấy khô lại Sau đó, tiến hành ủ bản mỏng ở 37 trong 20 phút Phun dung dịch thuốc thử lên bản mỏng sau khi đã tiến hành ủ enzyme và đợi trong 12 phút để phản mỏng enzyme rồi quan sát bản mỏng Hình 4 Sơ đồ quy trình thực hiện thử nghiệm ức chế 2.1.5