DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID TANIN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ BỘ MÔN DƯỢC LIỆU- DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN -- BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH DƯỢC LIỆU DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: ThS Đỗ Văn Mãi TIỂU NHÓM – LIÊN THÔNG CĐ-ĐH DƯỢC 13A Nguyễn Lê Nhật Linh Hồ Linh Phương Trần Ngọc Thiên Vy Đỗ Công Hậu Đặng Thị Thùy Dung Dương Thị Ngọc Em Cần Thơ, 2019 THỰC HÀNH DƯỢC LIỆU B8_TN2_LTCĐ-ĐH D13A BÀI DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID A CƠ SỞ LÝ THUYẾT Flavonoid hợp chất có khung C6 –C3 -C6 với C6 vòng thơm (A B) Vị trí 3, 5, 7, 3’, 4’,5’ nhân thơm thường có nhóm -OH Mạch carbon thường tạo dị vòng oxy hay cạnh (C ) Việc định tính flavonoid chủ yếu dựa vào phản ứng nhóm OH - Flavon, flavanon dẫn chất 3-hydroxy: + Phản ứng vòng γ – pyron Dưới tác dụng tác nhân khử (Mg/HCl; Zn/HCl; NaBH4 …) vòng γ-pyron flavon(ol), flavanon(ol) bị khử thành nhân pyrilium (tạo thành dẫn chất, anthocyanidin tương ứng) làm cho dung dịch chuyển thành màu hồng đến đỏ (phản ứng cyanidin, phản ứng Shibata…) Các chalcon môi trường acid trở thành flavanon nên dương tính với phản ứng + Phản ứng OH phenol Các nhóm OH phenol phân tử flavonoid tạo phenolat với chất kiềm làm dung dịch tăng màu môi trường kiềm; tạo phức với ion kim loại đa hoá trị Fe+++, Cr++, Pb++,… cho phức chất có màu và/hoặc kết tủa Các tính chất ứng dụng định tính chung polyphenol Trong mơi trường kiềm nhẹ, flavonoid có vòng thơm mà vị trí ortho hay para (so với nhóm -OH phenol) khơng có nhóm khơng bị cản trở lập thể tạo với thuốc thử diazonium sản phẩm cộng hợp azoic có màu từ đỏ cam đến đỏ + Anthocyanin (AC) Do có nhân pyrilium, anthocyanidin có màu thay đổi tuỳ pH mơi trường Trong mơi trường acid, trung tính kiềm, anthocyanidin cho màu đỏ, tím xanh Khi thực phản ứng cyanidin (Mg + HCl), AC cho màu đỏ (do mơi trường có tính acid; khơng phải AC bị khử hố tiếp tục + Leucoanthocyanidin (LAC) Trong mơi trường acid đun nóng, LAC khơng màu bị oxy hố phần thành dẫn chấc AC tương ứng có màu đỏ cam tới đỏ Khi kiềm hố dung dịch sau đó, dung dịch chuyển thành màu xanh B NỘI DUNG THỰC HÀNH Ngun vật liệu thí nghiệm 1.1 Dụng cụ, hóa chất thuốc thử - Cồn 25%, 96% - Bột Mg kim lọại Dung dịch HCl HCl đậm đặc Dung dịch FeCl3 1% Dung dịch AlCl3 1% MeOH THỰC HÀNH DƯỢC LIỆU - B8_TN2_LTCĐ-ĐH D13A Dung dịch chì acetat trung tính 1% Dung dịch Na2CO3 10% - Dung dịch NaOH 1% Thuốc thử diazonium 1.2 Dược liệu - Hòe (Flos Styphnolobii immaturus japonici) nụ hoa Hòe (Stryphnolonium japonicum (L.) Schott = Sophora japonica L., Fabaceae) - Vỏ bưởi (Pericapium Citri grandi) vỏ Bưởi (Citrus grandis (L.) Osbeck, Rutaceae) - Đậu đen (Semen Vignae urguiculatae) hạt Đậu đen (Vigna unguiculata (L.) Walp, Fabaceae) - Rễ tranh (Rhizhoma Imperatae), thân ngầm Cỏ tranh (Imperata cylindrica (L.) P.Beauv., Poaceae) Mẫu Dược liệu Thành phần định tính H Bột hoa hoè Flavonol B Bột vỏ bưởi Flavanon Đ Hạt Đậu đen Anthocyanidin T Bột rễ tranh Mẫu chứng khơng có flavonoid Chiết xuất Lấy 1g bột dươc liệu cho vào bình nón 100ml (có nhãn riêng biệt) Thêm #5ml cồn 96o (cồn 25o cho Đậu đen) Đun cách thuỷ phút lọc BM chuẩn bị sẵn dịch chiết Dịch chiết Định tính ống nghiệm 3.1 Phản ứng nhóm OH phenol nhân thơm Với dược liệu (hoa hoè, vỏ bưởi, đậu đen, rễ tranh) lấy ống nghiệm cho vào ống 1ml (20 giọt) dịch chiết để làm phản ứng sau: - Phản ứng tăng màu với 2-3 giọt dung dịch NaOH 1% Phản ứng tạo phức với 2-3 giọt dung dịch AlCl3 1% MeOH Phản ứng tạo phức với 2-3 giọt dung dịch FeCl3 1% Phản ứng tạo phức với 2-3 giọt dung dịch chì acetat trung tính Chuẩn bị giá gồm 20 ống nghiệm Ký hiệu : H- Hoa hòe B – Vỏ bưởi Đ – Đậu đen T – Rễ tranh C NaOH AlCl3 FeCl3 Pb2+ 1ml H Dịch chiết H tăng màu môi trường NaOH Xảy phản ứng tạo phức với dung dịch ( AlCl3 1% , FeCl3 %, Chì acetat trung tính) 1ml B Dịch chiết B tăng màu môi trường NaOH Xảy phản ứng tạo phức với dung dịch ( AlCl3 1% , FeCl3 %, Chì acetat trung tính) 1ml T Dịch chiết T không tăng màu môi trường NaOH Không phản ứng với dung dịch ( AlCl3 1% , FeCl3 %, Chì acetat trung tính) 1ml Đ Dịch chiết Đ tăng màu môi trường NaOH Xảy phản ứng tạo phức với dung dịch ( AlCl3 1% , FeCl3 %, Chì acetat trung tính) H B Đ T 2-3 giọt dung dịch NaOH 1% - Dịch chiết H, B, Đ tăng màu môi trường NaOH Dịch chiết T không tăng màu môi trường NaOH - Dịch chiết H, B, Đ phản ứng với AlCl3 1% MeOH Dịch chiết T không phản ứng với AlCl3 1% MeOH - Dịch chiết H, B, Đ phản ứng với FeCl 1% Dịch chiết T không phản ứng với FeCl 1% - Dịch chiết H, B, Đ phản ứng với chì acetat trung tính Dịch chiết T khơng phản ứng với chì acetat trung tính 2-3 giọt dung dịch AlCl3 1% MeOH 2-3 giọt dung dịch FeCl3 1% 2-3 giọt dung dịch chì acetat trung tính - Phản ứng với thuốc thử diazonium Cách tiến hành H B Đ T Cho vào ống nghiệm 01 ml (20 giọt) dịch chiết Kiềm hoá NaOH 10% Thêm 1-2 giọt thuốc thử diazonium lạnh, lắc Mơ tả: - Dịch chiết H, B, Đ có màu từ cam nhạt đến cam nâu Dịch chiết T không thay đổi màu Nhận xét: - Dịch chiết H, B, Đ dương tính với thuốc thử diazonium Dịch chiết T âm tính với thuốc thử diazonium Kết luận: 3.2 Dịch chiết H, B, Đ có chứa nhân thơm polyphenol có tăng màu dung dịch kiềm, phản ứng tạo phức với muối kim loại thuốc thử diazonium =>có chứa flavonoid Dịch chiết T không chứa nhân thơm polyphenol => không chứa flavonoid Phản ứng vòng (Phản ứng Cyanidin) Cho 1ml dịch chiết mẫu H, B, T, Đ vào ống nghiệm riêng biệt có sẵn bột Mg kim loại Thêm từ từ theo thành ống nghiệm 0.5 – 1ml dung dịch HCl đậm đặc Mô tả: Ban đầu đưa Mg dịch chiết chưa có tượng xảy Khi cho HCl đặc vào dung dịch ta thấy xuất sủi bọt, tỏa nhiệt, có chuyển màu : - Dịch chiết H, B cho màu đỏ huyết đỏ hồng - Dịch chiết Đ có màu cam - Dịch chiết T khơng chuyển màu Nhận xét: - Dịch chiết H, B, Đ dương tính với phản ứng Cyanidin γ-pyron bị khử thành nhân pyrilium tác dụng tác nhân khử Mg/Cl - Dịch chiết T âm tính với phản ứng Cyanidin *Kết luận: - Dịch chiết H, B, Đ chứa flavanoid - Dịch chiết T không chứa Flavanoid 3.3 Phản ứng nhóm anthocyanidin Với dược liệu, lấy ống nghiệm cho vào ống 1ml dịch chiết Ống thêm giọt ống thêm giọt NaOH 1%, ống để nguyên HCl 1% 1ml Hòe NaOH 1% Để nguyên Mô tả: - Ống H1 không thây đổi màu Ống H2 có màu vàng đậm Nhận xét: Dịch chiết chuyển màu môi trường kiềm 1ml Đen Mô tả: - Ống Đ1 có màu đỏ Ống Đ2 có màu xanh rêu Nhận xét: dịch chiết chuyển màu đỏ môi trường acid, xanh môi trường kiềm 1ml Tranh Mô tả: - Không tượng 1ml Bưởi Mô tả: - Ống B1 khơng màu Ống B2 có màu vàng đậm Nhận xét: dịch chiết có chuyển màu môi trường kiềm  Kết luận ( Đậu đen) : Sự thay đổi màu phụ thuộc vào pH môi trường, tăng số lượng OH vòng benzene màu xanh đậm Mức độ metyl hóa nhóm OH vòng benzene cao màu đỏ Do mơi trường acid HCl % dịch chiết có màu đỏ Còn mơi trường NaOH 1% dịch chiết có màu xanh C CÂU HỎI THẢO LUẬN Phản ứng xem đặc trưng Flavonoid, Anthocyanin Anthocyanidin phản ứng cyanidin Các phản ứng với ion kim loại đa hoá trị (Fe, Al, Pb…), phản ứng với thuốc thử diazonium, tăng màu môi trường kiềm phản ứng đặc trưng flavonoid phản ứng nhầm định tính thành phần flavonoid xảy với chất có thành phần - Phản ứng với ion kim loại đa hoá trị flavonoid có vòng γ-pyron - Phản ứng tăng màu môi trường kiềm thuốc thử diazonium flavonoid có OH phenol BÀI 10: DƯỢC LIỆU CHỨA TANNIN A CƠ SỞ LÝ THUYẾT Tannin (tanin, taninoid) hợp chất polyphenol phức tạp có nguồn gốc thực vật, có vị chát có tính thuộc da Dựa vào cấu trúc hoá học người ta xếp tannin vào nhóm chính: - Tannin thuỷ phân (tannin pyrogallic) Tannin không thuỷ phân (tannin ngưng tụ, tannin pyrocatechic) Tannin dễ tan kiềm loãng, hỗn hợp cồn nước Tannin tan cồn, glycerin, propylen glycol, acetone ethyl acetate Tannin không tan dung môi phân cực Tannin tạo tủa với dung dịch nước protein, tính chất quan trọng để định tính tannin Để phân biệt loại tannin pyrogallic pyrocatechic dựa vào phản ứng phản ứng ngưng tụ nhân thơm tannin pyrocatechic tạo màu sắc khác loại tannin với thuốc thử FeCl , thuốc thử Stiasny, nước brom… Có nhiều phương pháp định lượng tannin, phương pháp chuẩn độ thể tích, phương pháp đo màu…DĐVN IV (2002, trang PL – 141) quy định dùng phương pháp bột da để định lượng tannin dược liệu B THỰC HÀNH Nguyên vật liệu thí nghiệm 1.1 Dụng cụ, hoá chất thuốc thử Dung dịch gelatin muối 1% Thuốc thử Stiasny Dung dịch FeCl3 1% 1.2 Dược liệu - Đinh lăng (lá) - Măng cục ( vỏ quả) - Ổi (lá) Định tính tannin 2.1 Chiết hợp chất tannin từ dược liệu - Lấy 1g bột dược liệu cho vào bình nón 50ml Thêm 30ml nước sôi lắc đậy nắp tiếp tục đun bếp cách thuỷ sôi 10 phút - - Lọc nóng lấy dịch lọc 2.2 Phản ứng với dung dịch protein Lấy ống nghiệm ống lần lược 1ml (20 giọt) dịch chiết đinh lăng, măng cục, ổi Sau cho vào ống ống giọt thuốc thử gelatin muối 1% lắc nhẹ Mô tả: - Dịch chiết măng cục ổi cho tủa với thuốc thử gelatin - Dịch chiết đinh lăng không cho tủa với thuốc thử gelatin Nhận xét: - Dịch chiết măng cục ổi dương tính với thuốc thử gelatin - Dịch chiết đinh lăng âm tính với thuốc thử gelatin Kết luận: - Dịch chiết măng cục ổi có chứa tannin - Dịch chiết đinh lăng khơng chứa tannin 2.3 Định tính phân biệt loại tannin Lấy ống nghiệm ống lần lược 2ml (40 giọt) dịch chiết măng cục, ổi Thêm thuốc thử  Cho vào ống nghiệm giọt FeCl3 1% Mô tả: + Dịch chiết Ổi cho tuả xanh đen với FeCl3 + Dịch chiết Măng cục cho tuả xanh rêu với FeCl3 Nhận xét: + Dịch chiết Ổi dương tính với FeCl3 + Dịch chiết Măng cục dương tính với FeCl3  Cho vào ống nghiệm 1ml TT Stiasny (Formol + HClđđ, 2:1 ~ 14 giọt Formol giọt HClđđ) Mô tả: + Dịch chiết Ổi cho tủa đỏ gạch với thuốc thử Stiasny + Dịch chiết Măng cục cho tủa đỏ gạch với thuốc thử Stiasny Nhận xét: + Dịch chiết Ổi dương tính với FeCl3 + Dịch chiết Măng cục dương tính với FeCl3  Kết luận: Dịch chiết Ổi Dịch chiết Măng cục FeCl3 1%  Xanh đen  Xanh rêu Stiasny + đun cách thủy 10 phút  Tủa vón, đỏ gạch  Tủa vón, đỏ gạch + Dịch chiết Ổi chứa loại tannin pyrogallic tannin pyrocatechic + Dịch chiết Măng cục chứa loại tannin pyrocatechic CÂU HỎI THẢO LUẬN Phản ứng quan trong định tính để kết luận dược liệu có tanin hay không phản ứng tạo tủa với dung dịch protein nhầm xác định xem dược liệu chứa tannin hay không  ...THỰC HÀNH DƯỢC LIỆU B8_TN2_LTCĐ-ĐH D13A BÀI DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID A CƠ SỞ LÝ THUYẾT Flavonoid hợp chất có khung C6 –C3 -C6... Dung dịch HCl HCl đậm đặc Dung dịch FeCl3 1% Dung dịch AlCl3 1% MeOH THỰC HÀNH DƯỢC LIỆU - B8_TN2_LTCĐ-ĐH D13A Dung dịch chì acetat trung tính 1% Dung dịch Na2CO3 10% - Dung dịch NaOH 1% Thuốc thử