BÀI 9 : KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID 1. Định tính trên giấy lọc: Trên 1 tờ giấy lọc 15x18 cm dùng bút chì kẻ thành 1 bảng gồm 6 hàng x 5 cột. Mỗi hàng gồm 1 ô ghi chú và 4 ô thử, mỗi cột gồm 1 ô ghi chú và 4 ô thử tương ứng với 4 loại dược liệu. Trong mỗi hàng dùng pipet Pasteur nhỏ gọn vào các ô 1 giọt dịch chiết của các loại dược liệu. Để khô tự nhiên. Lặp lại 3 lần nữa như vậy. Vẽ vòng đánh dấu các vết dịch chiết bằng bút chì 2. Định tính trong ống nghiệm : 2.1. Phản ứng của nhóm OH phenol và nhân thơm: Với mỗi dược liệu, lấy 6 ống nghiệm cho vào mỗi ống 1 ml (20 giọt) dịch chiết để làm các phản ứng sau: a. Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1%. b. Phản ứng tạo phức với dung dịch AlCl3 1% trong MeOH. c. Phản ứng tạo phức với dung dịch FeCl3 1%. d. Phản ứng tạo phức với dung dịch chì acetat trung tính. Cách thực hiện:
BÀI : KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID A – CƠ SỞ LÝ THUYẾT : - Flavonoid hợp chất có khung C6-C3-C6 với C6 vòng thơm (A B) - Vị trí 3,5,7,3',4' 5' nhân thơm thường có nhóm –OH Mạch carbon thường tạo dị vòng oxy hay cạnh (C) Việc định tính flavonoid chủ yếu dựa vào phản ứng nhóm OH - Flavon, flavanon dẫn chất 3-hydroxy: Phản ứng vòng γ-pyron: Dưới tác dụng tác nhân khử (Mg/HCl; Zn/HCl; NaBH4 …) vòng γ-pyron flavon(ol), flavanon(ol) bị khử thành nhân pyrilium ( tạo thành dẫn chất anthocyanidin tương ứng) làm cho dung dịch chuyển thành màu đỏ cam tới đỏ (phản ứng cyanidin, phản ứng Shibata…) Các chalcon môi trường acid trở thành flavanon nên dương tính với phản ứng Phản ứng OH phenol: Các nhóm OH phenol phân tử flavonoid tạo phenolat với chất kiềm làm dung dịch tăng màu môi trường kiềm; tạo phức với ion kim loại đa hóa trị Fe+++, Cr++, Pb++, Zr++,… cho phản ứng có màu và/hoặc kết tủa Các tính chất ứng dụng định tính chung polyphenol Trong mơi trường kiềm nhẹ, flavonoid có vòng thơm mà vị trí ortho hay para (so với nhóm -OH phenol) khơng có nhóm khơng có cản trở lập thể tạo với thuốc thử diazonium sản phẩm cộng hợp azoic có màu từ đỏ cam đến đỏ Anthocyanin (AC) Do có nhân pyrilium, anthocyanidin cho màu thay đổi tùy pH môi trường Trong môi trường acid, trung tính kiềm, anthocyanidin cho màu đỏ, tím xanh Khi thực phản ứng cyanidin (Mg+HCl), AC cho màu đỏ ( môi trường có tính acid, khơng phải AC bị khử hóa tiếp tục) Leucoanthocyanidin (LAC) Trong mơi trường acid đung nóng, LAC khơng màu bị oxy hóa phần thành dẫn chất AC tương ứng có màu đỏ cam tới đỏ Khi kiềm hóa dung dịch sau đó, dung dịch chuyển thành màu xanh B – NỘI DUNG THỰC HÀNH : Chiết mẫu bột dược liệu (H = hoa Hòe, B = vỏ Bưởi, T = rễ Tranh, Đ = hạt Đậu Đen) Mẫu Đ: dùng cồn 25% Các mẫu lại dùng cồn 96% Sau làm phản ứng định tính theo sơ đồ sau: Bột dược liệu (5 g) • Cách thủy phút với 200 ml cồn (96% hay 25%)* • Lọc nóng qua bơng, cho vào bình riêng có nhãn Dịch chiết Định tính / giấy lọc DL/TT C NaOH 1% AlCl3 1% H B T Định tính / ống nghiệm FeCl3 1% • Ph.ứng OH phenol & nhân thơm + dd, NaOH 1% + dd, AlCl3 1% + dd, FeCl3 1% + dd, Chì acetat TT + th’ thử diazonium • Ph.ứng vòng γ-pyron (ph.ứng cyanidin) • Ph.ứng nhóm AC Đ Định tính giấy lọc: Trên tờ giấy lọc 15x18 cm dùng bút chì kẻ thành bảng gồm hàng x cột Mỗi hàng gồm ô ghi ô thử, cột gồm ô ghi ô thử tương ứng với loại dược liệu Trong hàng dùng pipet Pasteur nhỏ gọn vào ô giọt dịch chiết loại dược liệu Để khô tự nhiên Lặp lại lần Vẽ vòng đánh dấu vết dịch chiết bút chì Để định tính, cột số dùng để ghi tên mẫu, cột số dùng để làm mẫu chứng (chỉ có dịch chiết, khơng có thuốc thử) Nhỏ riêng biệt lên cột lại loại thuốc thử dd NaOH 1%, dd AlCl3 1% MeOH dd FeCl3 1% Chú ý nhỏ dung dịch thuốc thử thành vòng bé, nằm gọn vết dịch chiết Để khô tự nhiên Ánh sáng thường Đèn UV 365 nm * Nhận xét : Kết sau định tính nhìn ánh sáng thường ánh sáng UV 365 nm ta thấy dược liệu hoa Hòe, vỏ Bưởi, Đậu Đen có tăng màu, riêng dược liệu rễ Tranh khơng có tăng màu 2 Định tính ống nghiệm : 2.1 Phản ứng nhóm OH phenol nhân thơm: Với dược liệu, lấy ống nghiệm cho vào ống ml (20 giọt) dịch chiết để làm phản ứng sau: a Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1% b Phản ứng tạo phức với dung dịch AlCl3 1% MeOH c Phản ứng tạo phức với dung dịch FeCl3 1% d Phản ứng tạo phức với dung dịch chì acetat trung tính Cách thực hiện: ml dịch chiết + giọt thuốc thử, lắc đều, quan sát màu, tủa so sánh với mẫu chứng (riêng mẫu B, phản ứng với NaOH 1%: quan sát màu ống nghiệm trước sau nhúng vào nồi cách thủy 2-3 phút) * Theo cột : Mẫu chứng hoa Hòe, vỏ Bưởi, rễ Tranh, Đậu Đen Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1% Phản ứng tạo phức với dung dịch AlCl3 1% MeOH Phản ứng tạo phức với dung dịch FeCl3 1% Phản ứng tạo phức với dung dịch chì acetat trung tính * Theo hàng : Dịch chiết hoa Hòe với thuốc thử NaOH, AlCl3, FeCl3, Pb(CH3COO)2 Dịch chiết vỏ Bưởi với thuốc thử NaOH, AlCl3, FeCl3, Pb(CH3COO)2 Dịch chiết rễ Tranh với thuốc thử NaOH, AlCl3, FeCl3, Pb(CH3COO)2 Dịch chiết Đậu Đen với thuốc thử NaOH, AlCl3, FeCl3, Pb(CH3COO)2 Mẫu B, phản ứng với NaOH 1%, trước sau đun e Phản ứng với thuốc thử diazonium : Cho vào ống nghiệm ml dịch chiết, kiềm hóa giọt dd NaOH 10%, thêm giọt thuốc thử diazonium lạnh Lắc quan sát màu dung dịch Ghi chú: thay NaOH 10% NaCO3 10% * Nhận xét : Kết thí nghiệm a,b,c,d,e cho thấy ống nghiệm chứa dịch chiết H(hoa Hòe), B(vỏ Bưởi), Đ(Đậu Đen) có tượng tăng màu, riêng ống nghiệm chứa dịch chiết T(rễ Tranh) khơng có tượng tăng màu 2.2 Phản ứng vòng γ-pyron (Phản ứng Cyanidin): Cho ml dịch chiết mẫu H, B T vào ống nghiệm lớn riêng biệt có sẵn bột Mg kim loại Thêm từ từ theo thành ống nghiệm 0,5 – ml HCl đậm đặc (làm giá ống nghiệm đặt tủ hút) Quan sát chuyển màu dung dịch Ghi chú: thao tác với acid đặc Chú ý tránh acid trào khỏi ống nghiệm Ống H : màu hồng nhạt; Ống B : màu hồng đậm → có vòng γ-pyron Ống T : khơng tăng màu → khơng có vòng γ-pyron 2.3 Phản ứng nhóm anthocyanidin: Cho vào ống nghiệm riêng biệt ống 1ml dịch chiết Đậu Đen (Đ) Ống thứ thêm giọt HCl 1%, ống thứ thêm giọt NaOH 1%, ống thứ để nguyên Quan sát màu ống nghiệm Cho màu đỏ môi trường acid màu xanh môi trường kiềm C – KẾT LUẬN : dược liệu hoa Hòe, vỏ Bưởi, Đậu Đen có chứa Flavanoid Dược liệu rễ Tranh khơng có chứa Flavonoid ... trường acid màu xanh môi trường kiềm C – KẾT LUẬN : dược liệu hoa Hòe, vỏ Bưởi, Đậu Đen có chứa Flavanoid Dược liệu rễ Tranh khơng có chứa Flavonoid ... 365 nm ta thấy dược liệu hoa Hòe, vỏ Bưởi, Đậu Đen có tăng màu, riêng dược liệu rễ Tranh khơng có tăng màu 2 Định tính ống nghiệm : 2.1 Phản ứng nhóm OH phenol nhân thơm: Với dược liệu, lấy ống... gồm ô ghi ô thử, cột gồm ô ghi ô thử tương ứng với loại dược liệu Trong hàng dùng pipet Pasteur nhỏ gọn vào ô giọt dịch chiết loại dược liệu Để khô tự nhiên Lặp lại lần Vẽ vòng đánh dấu vết dịch