Ứng dụng nhựa macroporous trong phân lập isoflavonoid từ sắn dây

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VŨ VĂN TUẤN ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS TRONG PHÂN LẬP ISOFLAVONOID TỪ SẮN DÂY LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VŨ VĂN TUẤN ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS TRONG PHÂN LẬP ISOFLAVONOID TỪ SẮN DÂY LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUY N NGHÀNH: C NG NGH DƢ C PH M BÀO CHẾ THUỐC M SỐ: 60720402 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Hân HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Để có đƣợc thành công luận văn, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Hân–Bộ môn Công Nghiệp Dƣợc, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội - ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn, bảo tạo điều kiện cho suốt trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn thầy cô, anh chị kỹ thuật viên môn Công Nghiệp Dƣợc môn, phòng ban trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập thực luận văn Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, ngƣời thân bạn bè ủng hộ, động viên, giúp đỡ thời gian qua Hà Nội, tháng 03 năm 2017 Học viên Vũ Văn Tuấn MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .7 DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .2 1.1 Vài nét sắn dây 1.1.1 Tên gọi 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Thành phần hóa học .3 1.1.5 Tác dụng dược lý Sắn dây 1.1.6 Tính vị, công 1.1.7 Công dụng .6 1.1.8 Ứng dụng isoflavonoid Sắn dây 1.2 Isoflavonoid 1.2.1 Công thức hóa học 1.2.2 Tính chất lý hóa 1.2.3 Tác dụng sinh học 1.2.4 Một số nghiên cứu phân lập isoflavonoid từ Sắn dây 1.3 Nhựa hấp phụ macroporous 10 1.3.1 Giới thiệu chung nhựa hấp phụ macroporous .10 1.3.2 Phân loại nhựa macroporous 13 1.3.3 Ứng dụng nhựa macroporous phân lập hoạt chất thiên nhiên 1.4 14 Quá trình hấp phụ .17 1.4.1 Bản chất lực hấp phụ .17 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hấp phụ chất tan 18 CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .21 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất thiết bị 21 2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất 21 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 22 2.2 Nội dung nghiên cứu .23 2.2.1 Xác định hàm lượng isoflavonoid Sắn dây .23 2.2.2 Chiết xuất isoflavonoid từ Sắn dây 23 2.2.3 Khảo sát trình hấp phụ 23 2.2.4 Khảo sát trình giải hấp phụ .23 2.2.5 Phân lập isoflavonoid từ Sắn dây quy mô 10kg nguyên liệu/mẻ 23 2.2.6 Đánh giá khả tái sử dụng nhựa macroporous D101 23 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .24 2.3.1 Phương pháp định tính .24 2.3.2 Phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần 24 2.3.3 Phương pháp định lượng puerarin 26 2.3.4 Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ Sắn dây 28 2.3.5 Phương pháp xử lý nhựa 28 2.3.6 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình hấp phụ .28 2.3.7 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình giải hấp phụ 29 2.3.8 Phương pháp đánh giá khả tái sử dụng 30 2.3.9 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 31 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 32 3.1 Xác định isoflavonoid puerarin nguyên liệu .32 3.1.1 Định tính nguyên liệu .32 3.1.2 Định lượng isoflavonoid toàn phần 32 3.1.3 Định lượng puerarin .35 3.2 Khảo sát trình chiết xuất 36 3.2.1 Ảnh hưởng thời gian đến trình chiết xuất 36 3.2.2 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi / nguyên liệu đến trình chiết xuất 38 3.2.3 Ảnh hưởng số lần chiết đến trình chiết xuất .39 3.3 Khảo sát trình hấp phụ isoflavonoid từ dịch chiết lên nhựa macroporous D101 .40 3.4 Khảo sát trình giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa Macroporous D101 43 3.4.1 Lựa chọn dung môi giải hấp phụ isoflavonoid 43 3.4.2 Khảo sát trình giải hấp phụ .44 3.5 Triển khai chiết xuất phân lập isoflavonoid quy mô 10kg Sắn dây tƣơi/mẻ 47 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 56 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT KÍ HIỆU Ý NGHĨA BV Bed volume ( Thể tích khối hạt nhựa cột) DĐVN Dƣợc Điển Việt Nam FDA Food and Drug Administration (Cục quản lý thực phẩm dƣợc phẩm Hoa Kỳ) GOT Glutamic oxaloacetic transaminase HDL High Density Lipoprotein (Lipoprotein có tỉ trọng cao) High Speed Counter Current Chromatography (Sắc ký ngƣợc dòng tốc độ cao) High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) Isoflavonoid Low Density Lipoprotein HSCCC HPLC IF LDL (Lipoprotein có tỉ trọng thấp) SD Độ lệch chuẩn RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối UV-VIS Ultraviolet Visible (Tử ngoại khả kiến) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.2: Danh mục hóa chất sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.3: Dãy dung dịch chuẩn 27 Bảng 3.1: Độ hấp thụ dung dịch puerarin với nồng độ khác bƣớc sóng 250nm (n=5) .33 Bảng 3.2: Kết định lƣợng isoflavonoid nguyên liệu(n=3) 34 Bảng 3.3: Diện tích pic sắc ký dãy dung dịch chuẩn(n=5) .35 Bảng 3.4: Hàm lƣợng puerarin nguyên liệu (n=3) 36 Bảng 3.5: Sự thay đổi nồng độ isoflavonoid dịch chiết hàm lƣợng isoflavonoid cắn chiết theo thời gian (n=5, ±SD) 37 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng tỷ lệ dung môi / nguyên liệu đến trình chiết xuất (n=5, ±SD) 38 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng số lần chiết đến hiệu suất hàm lƣợng isoflavonoid cắn chiết (n=5, ±SD) .39 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng nồng độ isoflavonoid dịch nạp đến dung lƣợng hấp phụ nhựa macroporous D101(n=3, ±SD) 41 Bảng 3.9: Quá trình rửa tạp chất nƣớc .45 Bảng 3.10: Kết chiết xuất isoflavonoid từ Sắn dây tƣơi (n=3, ±SD) 48 Bảng 3.11: Khối lƣợng nhựa cần sử dụng cho quy mô 10 kg Sắn dây/mẻ .50 Bảng 3.12: Kết phân lập isoflavonoid từ Sắn dây tƣơi quy mô 10kg/mẻ (n=3) 51 Bảng 3.13: Quá trình làm giàu isoflavonoid Sắn dây .51 Bảng 3.14: Khả hấp phụ tỷ lệ giải hấp phụ nhựa sử dụng lần đầu nhựa tái sử dụng 54 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Sắn dây .2 Hình 1.2: Cấu trúc hóa học số isoflavonoid Sắn dây Hình 1.3: Công thức cấu tạo isoflavon Hình 1.5 Nhựa hấp phụ macroporous D101 10 Hình 3.1: Sắc ký đồ puerarin (C) dịch chiết Sắn dây (T) 32 Hình 3.3: Đƣờng chuẩn biểu thị mối tƣơng quan độ hấp thụ với nồng độ puerarin 34 Hình 3.4: Đƣờng chuẩn biểu diễn mối tƣơng quan diện tích pic với nồng độ puerarin 35 Hình 3.5: Ảnh hƣởng thời gian đến trình chiết xuất 37 Hình 3.6: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết hàm lƣợng IF cắn chiết vào tỷ lệ dung môi / nguyên liệu 38 Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết lần chiết 40 Hình 3.8: Ảnh hƣởng nồng độ IF dịch nạp cột đến dung lƣợng hấp phụ nhựa Macroporous D101 41 Hình 3.9: Quá trình hấp phụ IF nhựa Macroporous D101 với nồng độ isoflavonoid khác .42 (A-0,5; B-1,0; C-2,5; D-5,0 mg/ml) 42 Hình 3.10: Khả giải hấp phụ ethanol nồng độ khác 44 Hình 3.11: Đƣờng cong giải hấp phụ nƣớc 46 Hình 3.12: Đƣờng cong giải hấp phụ ethanol 70% 47 Hình 3.13: Cột nhựa D101 dùng cho giai đoạn khảo sát (A) dùng cho quy mô 10kg/mẻ (B) 50 Hình 3.14: Sắc ký đồ HPLC isoflavonoid thô (A) isoflavonoid sau tinh chế (B) 52 Hình 3.15: Hình ảnh sản phẩm IF Sắn dây: A-sản phẩm thô (41,47%), B-sản phẩm sau tinh chế lần (68,67%), C-sản phẩm sau tinh chế lần (84,53%) .53 Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn thay đổi khả hấp phụ tỷ lệ giải hấp phụ theo số lần sử dụng 54 ĐẶT VẤN ĐỀ Sắn dây thuộc họ Đậu (Fabaceae) Thành phần rễ củ Sắn dây chất thuộc nhóm isoflavonoid nhƣ: Puerarin, daidzin, daidzein, Nhiều nghiên cứu tác dụng sinh học chúng nhƣ: Làm tăng tuần hoàn máu não, chống oxy hóa [12], [22], [30], chống trầm cảm [28], giải rƣợu[43], tác dụng kiểu phytoestrogen [11], [29] Hiện nay, số tác giả đề xuất phƣơng pháp phân lập nhóm hoạt chất từ Sắn dây nhƣ: Phƣơng pháp phân lập Xueli Cao cộng sự[39] sử dụng sắc ký phân bố ngƣợc dòng với hệ dung môi ethyl acetat/nbutanol/nƣớc (2:1:3); Hua-Neng Xu Chao-Hong He sử dụng hệ dung môi n-butanol/nƣớc (1:1)[37] Nhìn chung, phƣơng pháp có hạn chế sử dụng dung môi độc hại, giá thành cao khó thực quy mô lớn Nhựa macroporous loại vật liệu mới, đƣợc ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt phân lập hoạt chất từ thiên nhiên Vì nhựa macroporous hạn chế đƣợc nhƣợc điểm phƣơng pháp phân lập truyền thống có nhiều ƣu điểm nhƣ: Làm tăng đáng kể nồng độ thành phần hoạt chất, không sử dụng dung môi hữu độc hại, khả lặp lại ổn định tốt, chi phí thấp tái sử dụng nhiều lần, phù hợp cho sản xuất công nghiệp [9], [18] Nhằm tìm phƣơng pháp mới, hiệu để phân lập isoflavonoid từ Sắn dây, đề tài: “Ứng dụng nhựa macroporous phân lập isoflavonoid từ Sắn dây” đƣợc thực với hai mục tiêu: Khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến trình chiết xuất, phân lập isoflavonoid củ Sắn dây nhựa macroporous 2 Điều chế isoflavonoid Sắn dây hàm lƣợng 40% nhựa macroporous phẩm tinh chế có màu sắc sáng sản phẩm chƣa tinh chế Hình ảnh isoflavonoid phân lập từ Sắn dây đƣợc trình bày hình 3.15 A B C Hình 3.15: Hình ảnh sản phẩm IF Sắn dây: A-sản phẩm thô (41,47%), Bsản phẩm sau tinh chế lần (68,67%), C-sản phẩm sau tinh chế lần (84,53%) 3.6 Đánh giá khả tái sử dụng nhựa macroporous D101 Sau lần sử dụng, nhựa D101 đƣợc xử lý nhƣ mô tả mục 2.3.5 Đánh giá khả hấp phụ tỷ lệ giải hấp phụ nhƣ sau: Cân xác 1g nhựa cho vào bình nón 100ml, thêm vào bình nón 30ml dịch chiết Sắn dây có nồng độ isoflavonoid xác khoảng 3mg/ml (C1), khuấy từ với tốc độ 120 53 vòng/phút nhiệt độ phòng Nồng độ isoflavonoid dịch sau hấp phụ đƣợc xác định phƣơng pháp quang phổ UV-VIS đƣợc mô tả mục 2.3.2 Sau hấp phụ, nhựa đƣợc tách riêng cách lọc hút Sau chuyển vào bình định mức khác có sẵn 30ml ethanol 70% Lắc để trình giải hấp phụ đạt cân Nồng độ isoflavonoid dịch giải hấp phụ đƣợc xác định (CGHP) Tỷ lệ isoflavonoid Sắn dây giải hấp phụ từ nhựa đƣợc xác định theo công thức mô tả mục 2.3.7 khả hấp phụ nhựa đƣợc xác định theo công thức mục 2.3.8 Kết đƣợc thể bảng 3.14 hình 3.16 Bảng 3.14: Khả hấp phụ tỷ lệ giải hấp phụ nhựa sử dụng lần đầu nhựa tái sử dụng Số lần sử dụng Khả hấp phụ (mg/g) 16,44 16,35 16,30 16,37 16,17 Tỷ lệ giải hấp phụ (%) 98,36 100,93 99,69 98,77 101,04 Khả giải hấp phụ (mg/g) Tỷ lệ giải hấp phụ (%) 20.00 104.00 19.00 18.00 102.00 17.00 100.00 16.00 98.00 15.00 14.00 96.00 13.00 94.00 12.00 92.00 11.00 10.00 90.00 Số lần sử dụng Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn thay đổi khả hấp phụ tỷ lệ giải hấp phụ theo số lần sử dụng 54 Kết khảo sát cho thấy: Khả hấp phụ trạng thái tĩnh nhựa D101 giảm nhẹ sau lần sử dụng (từ 16,44 xuống 16,17 mg/g), nhiên thay đổi không rõ ràng Bên cạnh đó, tỷ lệ giải hấp phụ từ nhựa D101 biến đổi nhiều, điều cho thấy khả tái sử dụng tốt nhựa D101 55 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN Nguyên liệu Nguyên liệu sử dụng để nghiên cứu đƣợc thu hái địa điểm, đƣợc xử lý, nghiền làm đồng để đảm bảo tính xác thí nghiệm Tuy nhiên, luận văn chƣa có điều kiện để làm rõ tên loài Sắn dây Trong Dƣợc điển Việt Nam IV[1], Sắn dây loài Pueraria thomsonii Benth Theo Ngô Văn Thu[4] có loài P thomsonii P.lobata đƣợc dùng không phân biệt Việt Nam Dƣợc điển Trung Quốc lại phân biệt rõ ràng loài dựa theo hàm lƣợng puerarin P thomsonii có hàm lƣợng puerarin 0,3% P lobata có hàm lƣợng puerarin 2,4%[34] Nguyên liệu đƣợc sử dụng nghiên cứu có hàm lƣợng isoflavonoid toàn phần 1,05% hàm lƣợng puerarin 0,56% kết phù hợp với kết Phạm Thị Phƣơng Dung nhóm nghiên cứu thực năm 2014[3] Dựa hàm lƣợng puerarin, sơ dự đoán loài Sắn dây đƣợc sử dụng loài P thomsonii Benth Phƣơng pháp định lƣợng chất chuẩn Phƣơng pháp định lƣợng sử dụng nghiên cứu đƣợc tham khảo điều kiện định lƣợng theo Dƣợc điển Trung Quốc số tài liệu khác[19], [21] Tuy nhiên, luận văn chƣa có điều kiện thẩm định lại phƣơng pháp mà khảo sát đƣợc khoảng nồng độ tuyến tính Các chất chuẩn có sẵn sở chuẩn thứ cấp, có mức độ tinh khiết thấp (puerarin 82,31%) Điều gây sai số định định lƣợng, đặc biệt mẫu có hàm lƣợng cao (sản phẩm sau tinh chế) Tuy nhiên, việc sử dụng chất đối chiếu có hàm lƣợng thấp hạn chế đƣợc sai số gây tạp chất có mặt mẫu, mẫu thử mẫu chuẩn có lƣợng tạp chất tƣơng đƣơng triệt tiêu ảnh hƣởng tạp chất 56 Phƣơng pháp chiết Luận văn sử dụng phƣơng pháp chiết ngâm điều kiện thƣờng, dung môi nƣớc Phƣơng pháp có ƣu điểm đơn giản, dễ nâng quy mô, chi phí trang thiết bị thấp, ổn định quy mô nghiên cứu nên dễ ứng dụng quy mô lớn Lựa chọn nƣớc làm dung môi chiết xuất có ƣu điểm dung môi rẻ tiền, sẵn có, không độc hại, có khả chiết xuất tốt isoflavonoid từ Sắn dây, thu đƣợc tinh bột Ngoài ra, Nƣớc dung môi thích hợp cho trình hấp phụ isoflavonoid qua cột nhựa macroporous D101 Do đó, dịch chiết nƣớc đƣợc sử dụng trực tiếp để tiến hành trình hấp phụ Theo nghiên cứu Hai-Dong Guo[13], dung môi ethanol/nƣớc cho hiệu suất chiết xuất isoflavonoid tốt nhất, nhiên nồng độ ethanol dịch chiết tăng, khả hấp phụ isoflavonoid nhựa macroporous giảm xuống, nồng độ ethanol 50% khả hấp phụ isoflavonoid nhựa macroporous trở Do đó, sau chiết ethanol, dịch chiết đƣợc cô đặc loại ethanol sau hòa tan nƣớc tiến hành hấp phụ lên nhựa macroporous Quá trình cô đặc tốn lƣợng để cô loại dung môi, khó áp dụng quy mô công nghiệp Phƣơng pháp phân lập isoflavonoid nhựa macroporous D101 Có nhiều phƣơng pháp phân lập isoflavonoid từ Sắn dây nhƣ: phƣơng pháp thay đổi dung môi, phƣơng pháp sắc ký phân bố ngƣợc dòng tốc độ cao Nhƣng phƣơng pháp có số nhƣợc điểm nhƣ: Cần lƣợng lớn dung môi hữu cơ, quy mô nhỏ, tính kinh tế không cao Hƣớng sử dụng nhựa macroporous D101 phân lập isoflavonoid từ Sắn dây có nhiều ƣu điểm nhƣ: Thực đơn giản, chi phí thấp, nhựa tái sử dụng nhiều lần Thực tế, nhựa macroporous có nhiều loại khác Tuy nhiên, điều kiện sở có nhựa D101 nên nghiên cứu tiến hành loại nhựa 57 Phƣơng pháp phân lập nhựa macroporous coi phƣơng pháp sắc ký hấp phụ, pha tĩnh đƣợc sử dụng là nhựa macroporous D101, pha động nƣớc ethanol Để đơn giản, luận văn sử dụng cột tự nhồi, phù hợp với điều kiện sở Cách đƣa pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ trọng lực Tốc độ chảy đƣợc điều chỉnh bằng khóa Vì lý này, hiệu lực tách cột chƣa đƣợc lý tƣởng Hiệu phân lập cải thiện cách sử dụng cột chuyên dụng, hạt đƣợc nhồi dƣới áp suất cao, kiểm soát tốc độ chảy pha động bơm Quá trình phân lập chia làm giai đoạn giai đoạn hấp phụ giai đoạn giải hấp phụ - Giai đoạn hấp phụ Quá trình hấp phụ đạt trạng thái cân nồng độ isoflavonoid dịch sau cột nồng độ isoflavonoid dịch nạp cột Vì vậy, chọn điểm dừng cho giai đoạn giải hấp phụ nồng độ isoflavonoid dịch nạp cột nồng độ isoflavonoid dịch sau cột Tuy nhiên, để trình hấp phụ đạt đƣợc trạng thái cân bằng, lƣợng isoflavonoid không đƣợc hấp phụ lớn Luận văn chọn điểm dừng cho trình hấp phụ tỷ lệ isoflavonoid không đƣợc hấp phụ đạt 10%, mục đích để hạn chế tối đa lƣợng isoflavonoid không đƣợc hấp phụ, đảm bảo hiệu suất cho giai đoạn Điểm dừng hấp phụ đƣợc lựa chọn tùy thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: Chất lƣợng nhựa, đối tƣợng cần phân lập, Hai-Dong Guo chọn điểm dừng hấp phụ tỷ lệ isoflavonoid không đƣợc hấp phụ đạt 5%[13] Tại đó, bắt đầu có “rò rỉ” isoflavonoid từ cột Khuôn khổ luận với nghiên cứu đƣợc ảnh hƣởng yếu tốt đến trình hấp phụ nồng độ thể tích dịch nạp cột Ngoài ra, nhiều yếu tố khác ảnh hƣởng đến trình hấp phụ isoflavonoid nhựa macroporous D101 nhƣ: Nhiệt độ, pH dịch nạp cột, kích thƣớc cột nhựa, tốc độ nạp dịch, Tỷ lệ chiều cao/đƣờng kính cột lớn quãng đƣờng di chuyển chất tan dài Do đó, thời 58 gian tiếp xúc chất tan nhựa tăng lên, dung lƣợng hấp phụ tăng lên Theo Hai-Dong Guo[13], chiều dài cột gấp 2-3 lần chiều dài vùng chuyển khối cho kết hấp phụ tốt Tốc độ nạp dịch nhỏ, thời gian tiếp xúc chất tan nhựa tăng làm tăng hiệu giai đoạn hấp phụ Tuy nhiên, điều có nhƣợc điểm kéo dài thời gian trình hấp phụ Theo khuyến cáo từ nhà sản xuất nhựa, tốc độ hấp phụ nên từ đến 4BV/giờ Luận văn chọn tốc độ hấp phụ 4BV/giờ dịch chiết có nồng độ isoflavonoid loãng (0,5mg/ml) để rút ngắn thời gian cần thiết trình hấp phụ - Giai đoạn giải hấp phụ Nghiên cứu sử dụng dung môi giải hấp phụ nƣớc ethanol 70% Trong đó, nƣớc dùng để loại số tạp chất thân nƣớc (các số muối vô muối acid hữu cơ, carbohydrat, nhựa, ) Việc sử dụng nƣớc để rửa tạp làm cho sản phẩm sau trình giải hấp phụ ethanol có hàm lƣợng cao Tuy nhiên, isoflavonoid bị thất thoát phần bị giải hấp phụ Do đó, cần cân hiệu suất hiệu trình rửa tạp nƣớc 3BV nƣớc đƣợc lựa chọn thể tích nƣớc dùng cho trình rửa tạp Số liệu phù hợp với nghiên cứu Pengyue Li cộng [19] Trong nồng độ ethanol khảo sát, ethanol 70% dung môi giải hấp phụ hiệu nhất, tỷ lệ giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa macroporous D101 đạt 97,52% Kết lựa chọn ethanol 70% làm dung môi giải hấp phụ phù hợp với công bố trƣớc đây[8], [13], [19] Khi sử dụng ethanol nồng độ tăng từ 0% đến 70%, tỷ lệ giải hấp phụ isoflavonoid tăng từ 18,54% lên 97,52% Nguyên nhân dẫn đến tƣợng nồng độ ethanol tăng làm tăng độ tan isoflavonoid Do ảnh hƣởng đến trình chuyển dịch cân nồng độ chất tan bên hạt nhựa bên dung môi Tuy nhiên, tiếp tục tăng nồng độ ethanol, tỷ lệ giải hấp phụ isoflavonoid lại có xu 59 hƣớng giảm Có hai giả thuyết đƣợc đƣa để giải thích tƣợng nhƣ sau: Nồng độ ethanol có ảnh hƣởng định khả trƣơng nở nhựa, đặc biệt lỗ xốp Khi nồng độ ethanol tăng cao làm lỗ xốp bị co lại mức, cản trở trình giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa Khi hấp phụ isoflavonoid từ dịch nạp lên nhựa, isoflavonoid có tạp chất khác bị hấp phụ Nồng độ ethanol tăng làm tăng trình giải hấp phụ isoflavonoid nhƣng lại hạn chế giải hấp phụ số tạp định Các tạp bị hấp phụ nhựa cản trở việc giải hấp phụ isoflavonoid Khuôn khổ luận văn chƣa có điều kiện nghiên cứu xác định chế rõ ràng Thực tế diễn theo giả thuyết theo hai Kết khảo sát cho thấy: Ethanol 70% có khả giải hấp phụ isoflavonoid tốt Điều nồng độ này, độ phân cực dung môi gần so với mức độ phân cực isoflavonoid Sắn dây Về kết chiết xuất phân lập isoflavonoid quy mô 10kg củ Sắn dây tƣơi/mẻ Phƣơng pháp chiết xuất phân lập isoflavonoid từ Sắn dây tƣơi nhựa macroporous cho hiệu kinh tế cao Nguyên liệu đƣợc tận dụng tối đa để vừa điều chế đƣợc tinh bột vừa điều chế đƣợc isoflavonoid Kết nghiên cứu cho thấy, việc phân lập isoflavonoid nhựa macroporous D101 khả quan, sản phẩm thu đƣợc có hàm lƣợng isoflavonoid 41,47% cao lần so với hàm lƣợng cắn chiết (4,5%), hiệu suất toàn trình tính theo isoflavonoid 80,34% Kết cao nhiều so với kết nghiên cứu Phạm Thị Phƣơng Dung thực năm 2014 (hàm lƣợng isoflavonoid cao tinh chế 10,41%)[3] Tuy nhiên, kết thấp 60 kết công bố Pengyue Li (75%)[19] Hai-Dong Guo(69,25%)[13] Có hai nguyên nhân dẫn đến khác biệt này: Một nguyên liệu Sắn dây đƣợc dùng luận có hàm lƣợng isoflavonoid thấp nhiều nghiên cứu so sánh Trong luận văn sử dụng Sắn dây có hàm lƣợng isoflavonoid 1,05% Trong nghiên cứu Pengyue Li cộng sự, hàm lƣợng isoflavonoid nguyên liệu 9,62% Hai nhựa macroporous sử dụng nghiên cứu đƣợc mặc định D101 điều kiện sở hạn chế, điều kiện chuẩn bị nhiều loại nhựa Tuy nhiên, kết nghiên cứu cho thấy: Hàm lƣợng isoflavonoid sản phẩm đạt 40%, không so với sản phẩm bán thị trƣờng đƣợc sử dụng sản xuất Mặt khác, loại nhựa mà Hai-Dong Guo Pengyue Li sử dụng nghiên cứu H103 HPD200A có giá thành cao gấp 4-5 lần giá nhựa D101 Vì vậy, áp dụng vào sản xuất, tính kinh tế phƣơng pháp cần đƣợc xem xét lại 61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Đã đánh giá đƣợc ảnh hƣởng số yếu tố đến trình phân lập isoflavonoid từ Sắn dây lựa chọn đƣợc điều kiện phân lập thích hợp nhƣ sau: nồng độ isoflavonoid dịch nạp 0,5mg/ml, thể tích mẫu nạp 30 BV, tốc độ nạp mẫu BV/giờ Giải hấp phụ lần lƣợt với BV nƣớc BV ethanol 70%, tốc độ giải hấp phụ BV/giờ Triển khai chiết xuất phân lập đƣợc isoflavonoid từ củ Sắn dây tƣơi quy mô 10kg/mẻ Kết thu đƣợc 95,6 gam isoflavonoid Sắn dây có hàm lƣợng 41,47% Hiệu suất toàn trình tính theo isoflavonoid đạt 80,66% Ngoài ra, luận văn tiến hành tinh chế isoflavonoid từ sản phẩm thô Isoflavonoid sau tinh chế có hàm lƣợng 84,53%, hiệu suất thu hồi đạt 67,34% ĐỀ XUẤT Nghiên cứu phân lập isoflavonoid từ Sắn dây sử dụng số nhựa macroporous khác (H103, AB-8, S-8, …) Nghiên cứu nâng cấp sản xuất isoflavonoid Sắn dây quy mô 100kg/mẻ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, tr 880-881, PL9 Phạm Ngọc Bùng (2014), Hóa lý dược, Nhà xuất y học, tr 250270 Phạm Thị Phƣơng Dung (2014), Xây dựng phương pháp điều chế cao khô phân lập puerarin từ Sắn dây, luận văn thạc sĩ, Đại học dƣợc Hà Nội, Hà Nội Ngô Văn Thu (2004), Bài giảng Dược liệu, Nhà xuất y học, tr 38, 259, 273-281 Viện Dƣợc liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc, tập 2, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, tr 680-686 TIẾNG ANH Bi P.Y et al (2010), "Application of aqueous two-phase flotation in the separation and concentration of puerarin from Puerariae extract", Separation and purification technology, 75, pp.402-406 Chen S et al (2007), "Seasonal Variations in the isoflavonoids of radix Puerariae", Phytochemical analysis, 18, pp.245-250 Cui Y.H et al (2013), "Adsorption and isolation of macroporous resin for three isoflavonoids from Puerariae lobatae radix", Journal of chinese medicinal materials, 36, pp.650-653 Ding Zhou Hui (2000), "Macroporous resin in the application of traditional chinese medicines in the research", Medical theory and practice, 13(12), p.730 10.Fan L.L et al (1992), “The protective effect of puerarin against myocardial reperfusion injury study on cardiac function”, Chinese medical joural, 105(1), pp.11-7 11 Glazier M.G et al (2001), "A review of the evidence for the use of phytoestrogens as a replacement for traditional estrogen replacement therapy.", Archives of internal medicine, 161, pp.1161-1172 12 Guerra M.C et al (2000), "Comparison between Chinese medical herb Pueraria lobata crude extract and its main isoflavone puerarin Antioxidant properties and effects on rat liver CYP-catalysed drug metabolism", Life sciences, 67, pp.2997-3006 13 Guo H.D et al (2015), "Large scale purification of puerarin from Puerariae Lobatae Radixthrough resins adsorption and acid hydrolysis", Journal of chromatography B, 980, pp.8-15 14 He X et al (2004), "Separation and purification of puerarin using cyclodextrin-coupled agarose gel media", J Chromatogr A, 1022, pp.77-82 15 He X.L et al (2004), "Purification of the isoflavonoid puerarin by adsorption chromatography on cross linked 12% agarose", Journal of chromatography A, 1057, pp 95-100 16 Hong Z et al (2001), "macroporous resin in the pharmaceutical field applications", Chinese journal of pharmaceutical industry, 32(1), p.40 17 Jun M et al (2003), “Comparison of Antioxidant Activities of Isoflavones from Kudzu Root (Pueraria lobata Ohwi)”, Food science, 68(6), pp.2117-2122 18 Li J., Howard A.C (2010), "Development of adsorptive (non-ionic) macroporous resins and their uses in the purification of pharmacologically-active natural products from plant sources", Natural product reports, 27, pp.1493–1510 19 Li P et al (2013), "Extraction and Purification of Flavonoids from Radix Puerariae", Tropical journal of pharmaceutical research, 12(6), pp.919-927 20 Li Y., Tan T (2008), "Enhancement of the isolation selectivity of isoflavonoid puerarin using oligo-cyclodextrin coupled polystyrenebased media", Biochemical engineering journal, 40, pp.189-198 21 Li J.J et al (1998), "A study on the extractive technology of effective composition Pueraria flavonoid from Pueraria lobata (Willd.) Ohwi", Joural of Northwest University, 28 (2) pp.131–138 22 Lidiya B et al (2010), "Invivo antioxidative activity of a quantified Pueraria lobata root extract", Journal of ethnopharmacology, 127, pp 112-117 23 Lin C.C et al (2005), “Determination of Seven Pueraria Constituents by High Performance Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis”, Journal of food and drug analysis, 13 (4), 324-330 24 Lin Y.J et al (2009), “Puerariae radix isoflavones and their metabolites inhibit growth and induce apoptosis in breast cancer cells”, Biochemical and biophysical research communications, pp.683-688 25.Lishuang L V et al (2008), “Selection and optimisation of macroporous resin for separation of stilbene glycoside from Polygonum multiflorum Thunb”, Journal of chemical technology and biotechnology, 83, pp.1422–1427 26 Marin F.R et al (2006), "Isoflavones as functional food components", Studies in natural products chemistry, 32, pp.1177-1207 27 Mattiasson B et al (2010), “Macroporous polymers: production propertise and biotechnological/biomedical applications”, CRC Press, UK, pp.211-267 28 Ming K.W., Vallee B.L (1998), "Kudzu root: an ancient chinese source of mordern antidisotropic agents", Phytochemistry, 47, pp.199506 29 Paul C et al (2003), "Phytoestrogens: recent developments.", Planta medica, 69, pp.589-599 30 Sewell R.A (2009), "Response of Cluster Headache to Kudzu", Headache: The journal of head and face pain, 49(1), pp.98-105 31.Silva E M et al (2007), “Optimisation of the adsorption of polyphenols from Inga edulis leaves on macroporous resins using an experimental design methodology”, Separation and purification technology, 53 (3), pp.274–280 32.Sun R et al (2009), “Preparative separation and enrichment of four taxoids from Taxus chinensis needles extracts by macroporous resin column chromatography”, Journal of separation science, 32 (9), pp 1284-1293 33 Teresa C et al (2004), "Dietary phytoestrogens and health", Phytochemistry, 65, pp 995-1016 34 The State Pharmacopoeia commission (2010), Pharmacopoeia of the people’s republic of china, vol I, pp.469-503 35.Wan J B et al (2008), “Quantification and separation of protopanaxatriol and protopanaxadiol type saponins from Panax notoginseng with macroporous resins”, Separation and purification technology, 60 (2), pp.198–205 36 Wang L.Z et al (2009), "Investigation of supercritical fluid extraction of puerarin from Pueraria lobata", Journal of food process engineering, 32, pp.682-691 37 Xu H.N., He C.H (2007), "Extraction of isoflavones from stem of Pueraria lobata (Willd.) Ohwi using n-butanol/water two-phase solvent system and separation of daidzein", Separation and purification technology, 56, pp.85-89 38 Xu H.N., He C.H (2007), "Separation and purification of puerarin with solvent extraction", Separation and purification technology, 56, pp.397–400 39 Xueli C et al (1999), "Separation and purification of isoflavones from Pueraria lobata by high-speed counter-current chromatography", Journal of chromatography A, 855, pp 709–713 40 Yang L et al (2007), "Coupling oligo-cyclodextrin on polyacrylate beads media for separation of puerarin", Process biochem, 42(7), pp.1075-1083 41 Yue H.W., Hu X.Q (1997), “The Medical Value of Radix Puerariae and Puerarin in Treating Diseases of the Cardiovascular System”, Chinese journal of integrative medicine, 3(3), pp.234-238 42 Zhang Z.T et al (1991), “Studies on isoflavonoid constituents of roots of Qinmountain Taibai Pueraria lobata”, Chinese pharmaceutical journal, 34 (5), pp.301-302 43 Zhou Y.X et al (2013), "Puerarin: A review of Pharmacological Effects", Phytotherapy research, pp.1-15 ... sử dụng nhiều lần, phù hợp cho sản xuất công nghiệp [9], [18] Nhằm tìm phƣơng pháp mới, hiệu để phân lập isoflavonoid từ Sắn dây, đề tài: Ứng dụng nhựa macroporous phân lập isoflavonoid từ Sắn. .. cứu phân lập isoflavonoid từ Sắn dây 1.3 Nhựa hấp phụ macroporous 10 1.3.1 Giới thiệu chung nhựa hấp phụ macroporous .10 1.3.2 Phân loại nhựa macroporous 13 1.3.3 Ứng dụng. .. Kết chiết xuất isoflavonoid từ Sắn dây tƣơi (n=3, ±SD) 48 Bảng 3.11: Khối lƣợng nhựa cần sử dụng cho quy mô 10 kg Sắn dây/ mẻ .50 Bảng 3.12: Kết phân lập isoflavonoid từ Sắn dây tƣơi quy mô