a. Xây dựng đƣờng chuẩn
Tiến hành quét phổ UV-VIS dung dịch puerarin nồng độ 8 µg/ml trong vùng bƣớc sóng 200 đến 400 nm, thu đƣợc phổ hấp thụ nhƣ hình 3.2
33
Hình 0.2. Phổ UV-VIS của dung dịch chất đối chiếu
Hình ảnh phổ cho thấy có 2 cực đại hấp thụ tại bƣớc sóng 250 nm và 307 nm. Tuy nhiên, cực đại ở 250 nhọn hơn và có độ hấp thụ cao hơn. Để phép định lƣợng nhạy và đặc hiệu hơn, 250 nm đƣợc chọn là bƣớc sóng đo quang trong các phép định lƣợng isoflavonoid sau này.
Pha dãy dung dịch puerarin có nồng độ 1,6; 3,2; 4,8; 6,4 và 8,0 µg/ml nhƣ mô tả ở mục 2.3.2. Mỗi nồng độ pha 5 dung dịch, đo độ hấp thụ A của các dung dịch này tại bƣớc sóng 250nm. Giá trị độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn đƣợc ghi trong bảng 3.1 và đƣờng chuẩn đƣợc trình bày ở hình 3.3.
ảng 3.1: Độ hấp thụ của dung dịch puerarin với các nồng độ khác nhau tại bước sóng 250nm (n=5)
C (µg/ml) 1,6 3,2 4,8 6,4 8,0
̅ 0,143 0,33 0,421 0,573 0,735
RSD (%) 0,72 0,85 0,66 0,70 0,91
34
Kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.3 cho thấy: Nồng độ puerarin trong dung dịch và độ hấp thụ có sự tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ trong khoảng nồng độ từ
1,6 đến 8,0 µg/ml với R2
=0,9915 tại bƣớc sóng 250nm. Độ lệch chuẩn tƣơng đối của các phép đo nằm trong giới hạn cho phép (RSD ≤ 1%). Do đó, phƣơng pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS có thể đƣợc sử dụng để định lƣợng isoflavonoid toàn phần tính theo puerarin tại bƣớc sóng 250nm bằng cách so sánh mẫu thử với mẫu chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng nồng độ tuyến tính.
b. Kết quả định lượng
Kết quả xác định hàm lƣợng isoflavonoid trong nguyên liệu đƣợc thể hiện trong bảng 3.2.
ảng 3.2: Kết quả định lượng isoflavonoid trong nguyên liệu(n=3)
Mẫu 1 2 3 ̅ Khối lƣợng mẫu (g) 0,4028 0,4073 0,4005 - Hàm lƣợng (%) 1,054 0,998 1,100 1,050±0,072 y = 0.0892x + 0.0123 R² = 0.9915 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 2 4 6 8 10 A Nồng độ puerarin (µg/ml)
35
Kết quả định lƣợng cho thấy: Hàm lƣợng isoflavonoid tính theo puerarin trong nguyên liệu khoảng 1,05%. Số liệu này phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đó[3] và đƣợc dùng làm căn cứ để tính toán cho các thí nghiệm tiếp theo và đánh giá các kết quả đạt đƣợc.