- Xử lý nhựa macroporous D101 sau khi sử dụng.
- Đánh giá khả năng hấp phụ và giải hấp phụ ở trạng thái tĩnh sau khi xử lý.
24
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp định tính
Định tính bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng theo chuyên luận Sắn dây trong Dƣợc điển Việt Nam IV [1], cụ thể:
Điều kiện sắc ký lớp mỏng
- Bản mỏng: Silicagel 60F254, hoạt hoá ở 110 oC trong 1 giờ. - Dung môi khai triển: Cloroform-methanol-nƣớc (7:2,5:0,25).
Dung dịch thử:
- Mẫu thử dạng lỏng: Lấy một thể tích mẫu tƣơng đƣơng 1 mg isoflavonoid
toàn phần, cô cách thủy đến cắn. Hoà cắn trong 1 ml ethanol.
- Mẫu thử dạng rắn: Hòa tan hoặc chiết mẫu bằng ethanol 96% để đƣợc dung
dịch có nồng độ isoflavonoid khoảng 1 mg/ml.
Dung dịch đối chiếu:
- Hòa tan puerarin (82,31%) trong methanol để có nồng độ puerarin khoảng 1 mg/ml.
Sau khi khai triển sắc ký, lấy bản mỏng ra, để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng. Quan sát bản mỏng dƣới đèn tử ngoại ở bƣớc sóng 254 nm.
2.3.2. Phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần
Nguyên tắc
Định lƣợng bằng phƣơng pháp quang phổ dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng cực đại tại bƣớc sóng 250nm [19], [21], [42].
a. Xây dựng đường chuẩn
Pha dãy dung dịch chuẩn: Cân chính xác 24,3mg Puerarin 82,31%
(tƣơng đƣơng 20,0mg puerarin) vào bình định mức 100ml, thêm ethanol 96%, hòa tan, thêm tiếp dung môi đến vạch, lắc đều đƣợc dung dịch A. Lấy chính xác 20ml dung dịch A vào bình định mức 100ml, thêm ethanol 96% vừa đủ,
25
lắc đều đƣợc dung dịch B. Lần lƣợt lấy 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 10,0ml dung dịch B vào 5 bình định mức 50ml, thêm lần lƣợt vào các bình định mức 8,0, 6,0, 4,0, 2,0, 0,0ml ethanol 96%, sau đó thêm nƣớc cất đến vừa đủ, lắc đều.
Mẫu trắng: lấy 10,0ml ethanol 96% vào bình định mức 50ml, thêm nƣớc
vừa đủ, lắc đều.
Các mẫu sau khi pha đƣợc lọc qua màng lọc 0,45µm. Đo độ hấp thụ tại bƣớc sóng 250 nm. Đo lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình để xây dựng đƣờng chuẩn.
b. Phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần
Chuẩn bị dung dịch thử
+ Mẫu thử dạng rắn: cân chính xác một lƣợng mẫu thử có chứa khoảng
4,0mg isoflavonoid, hòa tan hoặc chiết bằng ethanol 70%, chuyển vào bình định mức 100ml, thêm tiếp ethanol 70% để đƣợc khoảng 70ml, siêu âm 30 phút. Bổ sung dung môi đến vạch, lắc đều, để lắng qua đêm, gạn lấy phần trong. Lấy chính xác 5,0ml dịch vừa gạn vào bình định mức 50ml, thêm nƣớc cất vừa đủ, lắc đều. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Mẫu thử dạng lỏng: Lấy chính xác một thể tích mẫu thử tƣơng đƣơng
khoảng 4,0mg isoflavonoid vào bình định mức 100ml. Thêm ethanol 70% đến vạch, lắc đều. Lấy chính xác 5,00ml dịch vừa pha vào bình định mức 50ml, thêm nƣớc cất vừa đủ, lắc đều.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn
+ Cân chính xác khoảng 24,3mg puerarin (82,31% ) vào bình định mức 100ml, hòa tan và thêm vừa đủ bằng ethanol 96%, lắc đều (dung dịch C). Lấy chính xác 10ml dung dịch C vào bình định mức 50ml, thêm ethanol 96% đến vừa đủ, lắc đều (dung dịch D). Lấy chính xác 5ml dung dịch D vào bình định mức 50ml, thêm nƣớc cất đến vừa đủ, lắc đều.
26
Mẫu trắng
+ Lấy chính xác 5ml ethanol 96% pha trong bình định mức 50ml, thêm nƣớc cất đến vừa đủ, lắc đều.
Các mẫu sau khi pha đƣợc lọc qua màng lọc 0.45µm và xác định độ hấp thụ tại bƣớc sóng 250 nm. Đo 3 lần lấy kết quả trung bình.
Nồng độ isoflavonoid trong mẫu thử tính theo puerarin đƣợc tính theo công thức sau:
Trong đó:
AT, AC: Độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn
CT, CC: Nồng độ isoflavonoid của dung dịch thử và dung dịch chuẩn (µg/ml)
2.3.3. Phương pháp định lượng puerarin
Phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) đƣợc sử dụng để định lƣợng puerarin trong nguyên liệu, cao dƣợc liệu và sản phẩm tinh chế. Dựa trên các thí nghiệm khảo sát ban đầu và tham khảo các tài liệu [23], [38], điều kiện sắc ký đƣợc xác định nhƣ sau: Điều kiện sắc ký + Cột sắc ký Altech C18 với kích thƣớc cột 250 x 4,6 mm, kích thƣớc hạt nhồi 5 µm + Pha động: methanol: nƣớc tỉ lệ 25:75 (v/v) + Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút + Thể tích tiêm mẫu: 5 µl + Detector UV tại bƣớc sóng 250 nm.
27
Cân chính xác 121,5mg puerarin có hàm lƣợng 82,31% (tƣơng đƣơng 100,0mg puerarin) và hòa tan trong khoảng 50ml ethanol 96%. Sau đó, chuyển vào bình định mức 100 ml. Thêm ethanol 96% vừa đủ đến vạch đƣợc dung dịch A. Lấy chính xác 5,0 ml dung dịch A, pha loãng 10 lần bằng nƣớc cất đƣợc dung dịch B.
Từ dung dịch A và B pha loãng thành dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 10 µg/ml đến 200 µg/ml theo bảng 2.3
Bảng 2.3: Dãy dung dịch chuẩn
Nồng độ (µg/ml) 10 20 50 100 150 200
Vdd A (ml) 0 0 0 1 1 2
Vdd B (ml) 1 2 5 0 5 0
Vpha động vđ (ml) 10 10 10 10 10 10
Các dung dịch chuẩn này đƣợc lọc qua màng 0,45µm trƣớc khi phân tích sắc ký.
Mẫu thử là nguyên liệu: Cân chính xác 10 g bột nguyên liệu, thêm khoảng 70 ml ethanol 70% trong bình định mức 100 ml, siêu âm 30 phút trong bể siêu âm. Thêm tiếp dung môi đến vừa đủ, lắc đều, để lắng qua đêm ở điều kiện phòng, gạn lấy phần dịch trong. Lấy chính xác 5 ml dịch trong vừa gạn pha loãng với pha động thành 25ml. Lọc dung dịch qua màng 0,45µm trƣớc khi phân tích sắc ký.
Mẫu thử khác (cắn chiết, các sản phẩm phân lập, dịch chiết): Lấy chính xác một lƣợng mẫu tƣơng đƣơng khoảng 100mg puerarin. Hòa tan bằng ethanol 70%. Sau đó, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 96% vừa đủ. Pha loãng dung dịch này 10 lần bằng pha động và lọc qua màng 0,45µm trƣớc khi phân tích sắc ký.
28
Trong đó:
St, Sc : Diện tích pic puerarin của mẫu thử và mẫu chuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ct, Cc: Nồng độ puerarin trong mẫu thử và mẫu chuẩn (µg/ml)
2.3.4. Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ Sắn dây
Nƣớc là một dung môi rẻ tiền, sẵn có, không độc hại, có khả nằng chiết xuất tốt các isoflavonoid từ Sắn dây. Ngoài ra, việc sử dụng dung môi nƣớc thuận lợi cho các quá trình phân lập sau khi chiết. Thí nghiệm sử dụng phƣơng pháp chiết ngâm ở điều kiện thƣờng. Trong quá trình chiết có kết hợp khuấy trộn với tốc độ 180 vòng/phút. Thay đổi lần lƣợt các thông số: Tỷ lệ nguyên liệu:dung môi, thời gian chiết, số lần chiết để lựa chọn điều kiện thích hợp cho quá trình chiết xuất.
2.3.5. Phương pháp xử lý nhựa
Nhựa macroporous D101 đƣợc ngâm ethanol 96% trong 24 giờ. Sau đó, ngâm trong HCl 5% rồi đến NaOH 5% trong 4 giờ, để loại bỏ tạp chất. Tiếp theo, nhựa đƣợc rửa sạch đến pH trung tính bằng nƣớc cất rồi ngâm trong nƣớc cất[13].
2.3.6. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ
Hai yếu tố chính ảnh hƣởng đến khả năng hấp phụ của isoflavonoid sắn dây lên nhựa D101 là nồng độ và thể tích dịch nạp.
100g nhựa hấp phụ macroporous D101 đƣợc nạp vào cột thủy tinh (3x60cm), có thể tích cột nhựa (BV) là 200ml tƣơng ứng với chiều cao cột nhựa 28cm. Dịch chiết Sắn dây có nồng độ isoflavonoid 0,5(A); 1,0(B); 2,5(C); 5,0(D) mg/ml đƣợc cho chảy qua cột với tốc độ không đổi (4BV/giờ). Xác định nồng độ isoflavonoid trong dịch sau cột sau mỗi thể tích nhất định (1000ml đối với dịch A, 500ml đối với dịch B, 200ml đối với dịch C, 100ml đối với dịch D) bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS[13], [19].
29
- Tỷ lệ phần trăm isoflavonoid không đƣợc hấp phụ (%khp) và khối lƣợng isoflavonoid đƣợc hấp phụ (mhp) đƣợc xác định bằng công thức sau:
Trong đó:
+ mr , mo lần lƣợt là khối lƣợng isoflavonoid không đƣợc hấp phụ và khối lƣợng isoflavonoid trong dịch nạp ban đầu (mg).
+ mr , mo đƣợc xác định:
Trong đó:
+ Cr ,Co là nồng độ isoflavonoid trong dịch sau cột và dịch ban đầu (mg/ml). + Vr ,V0 là thể tích dịch sau cột và dịch ban đầu (ml).
- Dung lƣợng hấp phụ isoflavonoid của nhựa macroporous D101 là C(mg/g) đƣợc xác định theo công thức:
Trong đó: + C : Dung lƣợng hấp phụ (mg/g)
+ mhp : khối lƣợng isoflavonoid đƣợc hấp phụ (mg). + mn : khối lƣợng nhựa macroporous D101 (g).
2.3.7. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình giải hấp phụ
- Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến khả năng giải hấp phụ
Qua tham khảo tài liệu[13], [19], thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau: Cân 10g nhựa macroporous D101 cho vào cốc có mỏ 500ml. Sau đó, thêm vào 300ml dịch chiết có nồng độ isoflavonoid khoảng 3mg/ml (C1), khuấy từ 120vòng/phút trong 3giờ ở nhiệt độ phòng. Xác định nồng độ isoflavonoid
30
trong dung dịch bão hòa (C2) bằng phƣơng pháp quang phổ UV-VIS. Nhựa macroporous D101 đƣợc lọc, chia vào 10 bình nón giống nhau, mỗi bình 1gam nhựa. Thêm vào mỗi bình nón 30ml dung dịch ethanol trong nƣớc có nồng độ 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 96% đậy nắp và lắc đều trong 1giờ. Xác định nồng độ isoflavonoid trong dung dịch giải hấp phụ (CGHP) bằng phƣơng pháp quang phổ UV-VIS.
Tỷ lệ giải hấp phụ isoflavonoid (D) của các dung môi đƣợc tính theo công thức:
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong đó:
+ CGHP là nồng độ isoflavonoid trong dung dịch giải hấp phụ (mg/ml).
+ C1, C2 là nồng độ isoflavonoid trong dung dịch ban đầu và trong dung dịch bão hòa (mg/ml).
- Khảo sát ảnh hưởng của thể tích dung môi đến quá trình giải hấp phụ
Sau khi lựa chọn đƣợc dung môi giải hấp phụ phù hợp, dung môi này đƣợc cho chảy qua cột nhựa đã đƣợc hấp phụ isoflavonoid từ dịch chiết Sắn dây theo điều kiện khảo sát trƣớc đó với tốc độ chảy là 2BV/giờ. Theo dõi nồng độ isoflavonoid trong dịch giải hấp phụ sau mỗi 0,5BV bằng phƣơng pháp quang phổ UV-VIS[19].
2.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng tái sử dụng
Nhựa sau xử lý theo phƣơng pháp đã trình bày ở mục 2.3.5 đƣợc lọc hút chân không để loại bỏ nƣớc. Khả năng tái sử dụng của nhựa đƣợc đánh giá thông qua khả năng hấp phụ và tỷ lệ giải hấp phụ ở trạng thái tĩnh.
Khả năng hấp phụ ở trạng thái tĩnh của nhựa D101 là Qe (mg/g) đƣợc tính theo công thức:
31 Trong đó:
+ C0 và Ce lần lƣợt là nồng độ isoflavonoid trong dịch chiết ban đầu và khi quá trình hấp phụ đạt cân bằng (mg/ml).
+ V là thể tích dịch chiết dùng trong thí nghiệm (ml). + W là khối lƣợng nhựa hấp phụ D101 (g)
2.3.9. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Các số liệu đƣợc lấy giá trị trung bình, số liệu thống kê nhƣ độ lệch chuẩn tƣơng đối, hệ số tƣơng quan, … và các tính toán khác đƣợc thực hiện trên Microsoft Excel.
32
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Xác định isoflavonoid và puerarin trong nguyên liệu
3.1.1. Định tính nguyên liệu
Định tính nguyên liệu bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (DĐVN IV) đƣợc mô tả ở mục 2.3.1 với chất đối chiếu là puerarin (82,31%). Kết quả sắc ký đồ quan sát dƣới đèn tử ngoại 254nm đƣợc thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1: Sắc ký đồ của puerarin (C) và dịch chiết Sắn dây (T)
Trên sắc ký đồ, quan sát thấy mẫu thử cho 4 vết rõ ràng, có Rf lần lƣợt là 0,36; 0,45; 0,57 và 0,97. Trong đó vết đậm nhất có Rf = 0,36 tƣơng tự với Rf của vết puerarin của mẫu đối chiếu (0,36).
3.1.2. Định lượng isoflavonoid toàn phần
a. Xây dựng đƣờng chuẩn
Tiến hành quét phổ UV-VIS dung dịch puerarin nồng độ 8 µg/ml trong vùng bƣớc sóng 200 đến 400 nm, thu đƣợc phổ hấp thụ nhƣ hình 3.2
33
Hình 0.2. Phổ UV-VIS của dung dịch chất đối chiếu
Hình ảnh phổ cho thấy có 2 cực đại hấp thụ tại bƣớc sóng 250 nm và 307 nm. Tuy nhiên, cực đại ở 250 nhọn hơn và có độ hấp thụ cao hơn. Để phép định lƣợng nhạy và đặc hiệu hơn, 250 nm đƣợc chọn là bƣớc sóng đo quang trong các phép định lƣợng isoflavonoid sau này.
Pha dãy dung dịch puerarin có nồng độ 1,6; 3,2; 4,8; 6,4 và 8,0 µg/ml nhƣ mô tả ở mục 2.3.2. Mỗi nồng độ pha 5 dung dịch, đo độ hấp thụ A của các dung dịch này tại bƣớc sóng 250nm. Giá trị độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn đƣợc ghi trong bảng 3.1 và đƣờng chuẩn đƣợc trình bày ở hình 3.3.
ảng 3.1: Độ hấp thụ của dung dịch puerarin với các nồng độ khác nhau tại bước sóng 250nm (n=5)
C (µg/ml) 1,6 3,2 4,8 6,4 8,0
̅ 0,143 0,33 0,421 0,573 0,735 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
RSD (%) 0,72 0,85 0,66 0,70 0,91
34
Kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.3 cho thấy: Nồng độ puerarin trong dung dịch và độ hấp thụ có sự tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ trong khoảng nồng độ từ
1,6 đến 8,0 µg/ml với R2
=0,9915 tại bƣớc sóng 250nm. Độ lệch chuẩn tƣơng đối của các phép đo nằm trong giới hạn cho phép (RSD ≤ 1%). Do đó, phƣơng pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS có thể đƣợc sử dụng để định lƣợng isoflavonoid toàn phần tính theo puerarin tại bƣớc sóng 250nm bằng cách so sánh mẫu thử với mẫu chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng nồng độ tuyến tính.
b. Kết quả định lượng
Kết quả xác định hàm lƣợng isoflavonoid trong nguyên liệu đƣợc thể hiện trong bảng 3.2.
ảng 3.2: Kết quả định lượng isoflavonoid trong nguyên liệu(n=3)
Mẫu 1 2 3 ̅ Khối lƣợng mẫu (g) 0,4028 0,4073 0,4005 - Hàm lƣợng (%) 1,054 0,998 1,100 1,050±0,072 y = 0.0892x + 0.0123 R² = 0.9915 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 2 4 6 8 10 A Nồng độ puerarin (µg/ml)
35
Kết quả định lƣợng cho thấy: Hàm lƣợng isoflavonoid tính theo puerarin trong nguyên liệu khoảng 1,05%. Số liệu này phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đó[3] và đƣợc dùng làm căn cứ để tính toán cho các thí nghiệm tiếp theo và đánh giá các kết quả đạt đƣợc.
3.1.3. Định lượng puerarin
Pha dãy dung dịch puerarin có nồng độ 10; 20; 100; 150 và 200 µg/ml nhƣ mục 2.3.3. Mỗi nồng độ pha 5 dung dịch. Tiến hành phân tích HPLC với detectorr UV tại bƣớc sóng 250nm. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.3 và hình 3.4.
ảng 3.3: Diện tích pic sắc ký của dãy dung dịch chuẩn(n=5)
Nồng độ (µg/ml) 10 20 50 100 150 200 ̅̅̅̅̅ 149871 277899 760122 1461818 2087930 2944197 RSD (%) 0,90 0,87 0,75 0,80 0,75 0,71
Hình 3.4: Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ puerarin
Kết quả ở bảng 3.3 và hình 3.4 cho thấy: Diện tích pic với nồng độ puerarin có mối quan hệ tuyến tính chặt chẽ trong khoảng 10 đến 200 µg/ml
y = 14458x + 3159.5 R² = 0.9982 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 0 50 100 150 200 250 Di ệ n tí ch p ic (m .A U .s) Nồng độ puerarin (µg/ml)
36
với R2=0,9982. Độ lệch chuẩn tƣơng đối của các phép đo nằm trong giới hạn cho phép (RSD ≤ 1%). Do đó, phƣơng pháp HPLC có thể đƣợc sử dụng để xác định hàm lƣợng puerarin trong các mẫu phân tích sau này.
Hàm lƣợng puerarin trong nguyên liệu đƣợc xác định bằng việc so sánh mẫu thử và mẫu chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng nồng độ tuyến tính nêu trên. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.4.
ảng 3.4: Hàm lượng puerarin trong nguyên liệu (n=3)
Mẫu 1 2 3 ̅
Hàm lƣợng
puerarin (%) 0,530 0,581 0,568 0,560±0,037
Kết quả bảng 3.4 cho thấy: Hàm lƣợng puerarin trong nguyên liệu đạt 0,560 ± 0,037%, bằng khoảng 50% so với hàm lƣợng isoflavonoid toàn phần (1,05%) và là thành phần có tỷ lệ cao nhất. Do đó, có thể lựa chọn hàm lƣợng puerarin nhƣ một tiêu chuẩn để đánh giá chất lƣợng Sắn dây cũng nhƣ các chế phẩm từ Sắn dây.
3.2. Khảo sát quá trình chiết xuất
Giai đoạn chiết xuất sử dụng phƣơng pháp ngâm ở điều kiện thƣờng, với dung môi nƣớc, là loại dung môi phổ biến, an toàn, kinh tế và thuận lợi cho các giai đoạn tiếp theo. Nội dung này đƣợc tiến hành nhằm lựa chọn các thông số: thời gian chiết xuất, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, số lần chiết thích