Nguyên tắc
Định lƣợng bằng phƣơng pháp quang phổ dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng cực đại tại bƣớc sóng 250nm [19], [21], [42].
a. Xây dựng đường chuẩn
Pha dãy dung dịch chuẩn: Cân chính xác 24,3mg Puerarin 82,31%
(tƣơng đƣơng 20,0mg puerarin) vào bình định mức 100ml, thêm ethanol 96%, hòa tan, thêm tiếp dung môi đến vạch, lắc đều đƣợc dung dịch A. Lấy chính xác 20ml dung dịch A vào bình định mức 100ml, thêm ethanol 96% vừa đủ,
25
lắc đều đƣợc dung dịch B. Lần lƣợt lấy 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 10,0ml dung dịch B vào 5 bình định mức 50ml, thêm lần lƣợt vào các bình định mức 8,0, 6,0, 4,0, 2,0, 0,0ml ethanol 96%, sau đó thêm nƣớc cất đến vừa đủ, lắc đều.
Mẫu trắng: lấy 10,0ml ethanol 96% vào bình định mức 50ml, thêm nƣớc
vừa đủ, lắc đều.
Các mẫu sau khi pha đƣợc lọc qua màng lọc 0,45µm. Đo độ hấp thụ tại bƣớc sóng 250 nm. Đo lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình để xây dựng đƣờng chuẩn.
b. Phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần
Chuẩn bị dung dịch thử
+ Mẫu thử dạng rắn: cân chính xác một lƣợng mẫu thử có chứa khoảng
4,0mg isoflavonoid, hòa tan hoặc chiết bằng ethanol 70%, chuyển vào bình định mức 100ml, thêm tiếp ethanol 70% để đƣợc khoảng 70ml, siêu âm 30 phút. Bổ sung dung môi đến vạch, lắc đều, để lắng qua đêm, gạn lấy phần trong. Lấy chính xác 5,0ml dịch vừa gạn vào bình định mức 50ml, thêm nƣớc cất vừa đủ, lắc đều.
+ Mẫu thử dạng lỏng: Lấy chính xác một thể tích mẫu thử tƣơng đƣơng
khoảng 4,0mg isoflavonoid vào bình định mức 100ml. Thêm ethanol 70% đến vạch, lắc đều. Lấy chính xác 5,00ml dịch vừa pha vào bình định mức 50ml, thêm nƣớc cất vừa đủ, lắc đều.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn
+ Cân chính xác khoảng 24,3mg puerarin (82,31% ) vào bình định mức 100ml, hòa tan và thêm vừa đủ bằng ethanol 96%, lắc đều (dung dịch C). Lấy chính xác 10ml dung dịch C vào bình định mức 50ml, thêm ethanol 96% đến vừa đủ, lắc đều (dung dịch D). Lấy chính xác 5ml dung dịch D vào bình định mức 50ml, thêm nƣớc cất đến vừa đủ, lắc đều.
26
Mẫu trắng
+ Lấy chính xác 5ml ethanol 96% pha trong bình định mức 50ml, thêm nƣớc cất đến vừa đủ, lắc đều.
Các mẫu sau khi pha đƣợc lọc qua màng lọc 0.45µm và xác định độ hấp thụ tại bƣớc sóng 250 nm. Đo 3 lần lấy kết quả trung bình.
Nồng độ isoflavonoid trong mẫu thử tính theo puerarin đƣợc tính theo công thức sau:
Trong đó:
AT, AC: Độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn
CT, CC: Nồng độ isoflavonoid của dung dịch thử và dung dịch chuẩn (µg/ml)