Phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) đƣợc sử dụng để định lƣợng puerarin trong nguyên liệu, cao dƣợc liệu và sản phẩm tinh chế. Dựa trên các thí nghiệm khảo sát ban đầu và tham khảo các tài liệu [23], [38], điều kiện sắc ký đƣợc xác định nhƣ sau: Điều kiện sắc ký + Cột sắc ký Altech C18 với kích thƣớc cột 250 x 4,6 mm, kích thƣớc hạt nhồi 5 µm + Pha động: methanol: nƣớc tỉ lệ 25:75 (v/v) + Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút + Thể tích tiêm mẫu: 5 µl + Detector UV tại bƣớc sóng 250 nm.
27
Cân chính xác 121,5mg puerarin có hàm lƣợng 82,31% (tƣơng đƣơng 100,0mg puerarin) và hòa tan trong khoảng 50ml ethanol 96%. Sau đó, chuyển vào bình định mức 100 ml. Thêm ethanol 96% vừa đủ đến vạch đƣợc dung dịch A. Lấy chính xác 5,0 ml dung dịch A, pha loãng 10 lần bằng nƣớc cất đƣợc dung dịch B.
Từ dung dịch A và B pha loãng thành dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 10 µg/ml đến 200 µg/ml theo bảng 2.3
Bảng 2.3: Dãy dung dịch chuẩn
Nồng độ (µg/ml) 10 20 50 100 150 200
Vdd A (ml) 0 0 0 1 1 2
Vdd B (ml) 1 2 5 0 5 0
Vpha động vđ (ml) 10 10 10 10 10 10
Các dung dịch chuẩn này đƣợc lọc qua màng 0,45µm trƣớc khi phân tích sắc ký.
Mẫu thử là nguyên liệu: Cân chính xác 10 g bột nguyên liệu, thêm khoảng 70 ml ethanol 70% trong bình định mức 100 ml, siêu âm 30 phút trong bể siêu âm. Thêm tiếp dung môi đến vừa đủ, lắc đều, để lắng qua đêm ở điều kiện phòng, gạn lấy phần dịch trong. Lấy chính xác 5 ml dịch trong vừa gạn pha loãng với pha động thành 25ml. Lọc dung dịch qua màng 0,45µm trƣớc khi phân tích sắc ký.
Mẫu thử khác (cắn chiết, các sản phẩm phân lập, dịch chiết): Lấy chính xác một lƣợng mẫu tƣơng đƣơng khoảng 100mg puerarin. Hòa tan bằng ethanol 70%. Sau đó, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 96% vừa đủ. Pha loãng dung dịch này 10 lần bằng pha động và lọc qua màng 0,45µm trƣớc khi phân tích sắc ký.
28
Trong đó:
St, Sc : Diện tích pic puerarin của mẫu thử và mẫu chuẩn
Ct, Cc: Nồng độ puerarin trong mẫu thử và mẫu chuẩn (µg/ml)