tươi/mẻ
Trong thực tế, củ Sắn dây chủ yếu đƣợc sử dụng để làm tinh bột Sắn dây. Các hoạt chất hòa tan trong nƣớc bị loại bỏ trong quá trình này. Để tăng tính ứng dụng của đề tài, nội dung này đƣợc tiến hành với dịch nạp sử dụng là
0 10 20 30 40 50 60 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 N ồng đ ộ IF t rong dịc h giải hấp phụ (m g/ m l) Thể tích rửa giải (BV)
48
dịch chiết từ Sắn dây tƣơi với mong muốn thu cả 2 sản phẩm là tinh bột và các isoflavonoid Sắn dây.
a. Giai đoạn chiết xuất
Qua tham khảo tài liệu[3], tiến hành chiết xuất isoflavonoid từ củ Sắn dây tƣơi theo các bƣớc nhƣ sau:
Chuẩn bị nguyên liệu: Sắn dây tƣơi đƣợc xử lý trong vòng 3 ngày, củ đƣợc rửa sạch đất và vỏ đen bên ngoài, cắt bỏ những phần bị hỏng. Sau đó, xay mịn thành bột nhão.
Tiến hành chiết xuất: Bột nhão đƣợc hòa vào nƣớc với tỷ lệ
bột nhão / nƣớc là 1/2 (kl/kl) rồi vắt loại bã bằng túi vải. Bã sắn đƣợc rửa lại một lần với lƣợng nƣớc nhƣ lần một. Gộp dịch chiết lại, để lắng qua đêm, gạn lấy phần dịch trong. Phần dịch gạn đƣợc đun sôi, để lắng qua đêm để kết tủa một số tạp chất. Dịch chiết này tiếp tục đƣợc lọc và xác định thể tích. Nồng độ isoflavonoid trong dịch chiết đƣợc xác định bằng phƣơng pháp quang phổ UV-VIS.
Phần tinh bột lắng xuống đƣợc rửa bằng cách thêm nƣớc, khuấy đều rồi lại để lắng; rửa đến khi trắng (5 lần). Bột lắng mang sấy khô thu đƣợc tinh bột Sắn dây. Kết quả giai đoạn chiết xuất đƣợc thể hiện trong bảng 3.10.
Bảng 3.10: Kết quả chiết xuất isoflavonoid từ Sắn dây tươi (n=3, ̅±SD)
Mẻ 1 2 3 ̅
Khối lƣợng nguyên liệu (kg) 10 10 10
Thể tích dịch chiết (lít) 30 33 32 31,6±2,1 Nồng độ IF trong dịch chiết (mg/ml) 1,61 1,55 1,50 1,55±0,08 Khối lƣợng tinh bột 2,28 2,30 2,52 2,37±0,19
49
Theo kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.8, hình 3.8 và 3.9, khi nồng độ isoflavonoid trong dịch nạp tăng từ 0,5 lên 5,0mg/ml, dung lƣợng hấp phụ của nhựa D101 cũng tăng từ 22,8 lên 25,8mg/g. Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy: Nồng độ isofavonoid trong dịch chiết từ Sắn dây tƣơi khoảng 1,55mg/ml. Nồng độ này gần với điều kiện khảo sát B (hình 3.9). Để đơn giản hóa các thao tác và quá trình hấp phụ tốt nhất, dịch chiết trên sẽ đƣợc sử dụng trực tiếp làm dịch nạp cột cho giai đoạn phân lập.
b. Giai đoạn phân lập
Các thông số đã khảo sát đƣợc sử dụng cho giai đoạn phân lập nhƣ sau: - Giai đoạn hấp phụ: Dịch nạp cột đƣợc cho chảy qua cột với tốc độ 4BV/giờ - Giai đoạn giải hấp phụ: Cột lần lƣợt đƣợc giải hấp phụ bằng 3BV nƣớc và 2BV ethanol 70% với tốc độ 2BV/giờ.
Khối lƣợng nhựa hấp phụ macroporous D101 cần thiết cho quá trình phân lập, đƣợc tính theo công thức sau:
Trong đó:
+ mD101 : khối lƣợng nhựa hấp phụ macroporous D101 cần dùng (gam) + CIF : Nồng độ isoflavonoid trong dịch nạp cột (mg/ml)
+ V : Thể tích dịch nạp cột (lít)
+ CD101 : Dung lƣợng hấp phụ của nhựa D101 theo mô hình B (24,5mg/g) Kết quả tính toán khối lƣợng nhựa D101 cần dùng đƣợc thể hiện ở bảng 3.12:
50
Bảng 3.11: Khối lượng nhựa cần sử dụng cho quy mô 10 kg Sắn dây/mẻ
Mẻ 1 2 3
Thể tích dịch nạp (lít) 30 33 32 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nồng độ IF trong dịch nạp (mg/ml) 1,61 1,55 1,5
Khối lƣợng IF (gam) 48,3 51,15 48
Khối lƣợng nhựa (gam) 1971 2087 1959
Hình 3.13: Cột nhựa D101 dùng cho giai đoạn khảo sát (A) và dùng cho quy mô 10kg/mẻ (B).
Kết quả bảng 3.11 cho thấy: Khối lƣợng nhựa cần thiết cho quá trình hấp phụ isoflavonoid từ dịch chiết Sắn dây tƣơi khoảng 2,0kg. 2,0kg nhựa hấp phụ macroporous đƣợc xử lý theo phƣơng pháp mô tả ở mục 2.3.5. Sau đó, đƣợc nạp vào một cột có kích thƣớc 9 x 100cm (hình 3.13). Thể tích cột nhựa (BV) là 3,5 lít, tƣơng ứng với chiều cao 55cm. Dịch giải hấp phụ bằng ethanol 70% đƣợc cô đặc và sấy đến thể chất cao khô thu đƣợc isoflavonoid thô. Hàm lƣợng isoflavonoid và puerarin trong isoflavonoid thô đƣợc xác
51
định theo phƣơng pháp mô tả ở mục 2.3.2 và 2.3.3. Kết quả quá trình phân lập đƣợc thể hiện trong bảng 3.12
Bảng 3.12: Kết quả phân lập isoflavonoid từ Sắn dây tươi quy mô 10kg/mẻ (n=3)
Mẻ 1 2 3 ̅
Khối lƣợng IF thô (gam) 90 102 95 95 ± 8 Hàm lƣợng IF thô (%) 42,07 41,35 41,00 41,47 ± 5,7 Hiệu suất tính theo IF (%) 78,39 82,46 81,14 80,66 ± 2,94 Hiệu suất tính theo nguyên liệu (%) 0,9 1,02 0,95 0,96 ± 0,08
Phƣơng pháp phân lập từ Sắn dây tƣơi vừa thu đƣợc tinh bột Sắn dây vừa thu đƣợc sản phẩm có hàm lƣợng isoflavonoid khá cao. Từ 10kg nguyên liệu, sau quá trình chiết xuất và phân lập, thu đƣợc 95,6±8,5g isoflavonoid thô có hàm lƣợng 41,47±5,7%. Hiệu suất đạt 80,66±2,94% tính theo lƣợng isoflavonoid có trong nguyên liệu.
c. Tinh chế
20g isoflavonoid thô đƣợc hòa tan hoàn toàn trong 200ml nƣớc, lọc thu dịch
lọc, để trong tủ lạnh ở 4oC trong 24 giờ, lọc và thu tủa isoflavonoid. Sau hai lần
kết tủa trong nƣớc, isoflavonoid thu đƣợc có hàm lƣợng 84,53% với hiệu suất thu hồi 67,34%. Kết quả quá trình làm giàu isoflavonoid đƣợc tóm tắt trong bảng 3.13, sắc ký đồ HPLC của isoflavonoid thô và isoflavonoid sau tinh chế đƣợc thể hiện trong hình 3.14.
Bảng 3.13: Quá trình làm giàu isoflavonoid Sắn dây
Nguyên liệu Cắn chiết Isoflavonoid thô Isoflavonoid sau tinh chế Hàm lƣợng isoflavonoid (%) 1,05 4,5 41,47 84,53 Hàm lƣợng puerarin (%) 0,56 2,44 21,08 74,86
52
Hình 3.14: Sắc ký đồ HPLC của isoflavonoid thô (A) và isoflavonoid sau tinh chế (B)
Kết quả trên cho thấy: Sản phẩm đƣợc phân lập bằng nhựa macroporous D101 có hàm lƣợng isoflavonoid cao hơn 9 lần so với hàm lƣợng isoflavonoid trong cắn chiết (41,47% so với 4,5%). Sau tinh chế bằng phƣơng pháp kết tủa, hàm lƣợng đạt 84,53%. Quá trình phân lập với nhựa macroporous D101 không chọn lọc với các isoflavonoid khác nhau (tỷ lệ puerarin so với isoflavonoid toàn phần giữ nguyên-khoảng 50%). Quá trình tinh chế tiếp theo bằng phƣơng pháp kết tủa trong nƣớc đã loại đi phần lớn các isoflavonoid khác làm cho tỷ lệ puerarin trong isoflavonoid toàn phần tăng lên (khoảng 88% so với isoflavonoid toàn phần). Đồng thời các sản
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 mAU 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 bar 250nm,4nm (1.00) 2. 01 1/ 72 07 60 6. 70 6/ 94 98 64 10 .9 20 /2 37 79 9 11 .7 38 /9 33 86 54 13 .5 21 /2 20 13 6 15 .6 11 /2 62 64 5 18 .8 44 /3 98 03 3 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 mAU 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 bar 250nm4nm (1.00) 6. 76 8/ 17 71 81 11 .8 48 /7 57 95 12 18 .9 64 /1 18 54 8 A B
53
phẩm tinh chế cũng có màu sắc sáng hơn sản phẩm chƣa tinh chế. Hình ảnh các isoflavonoid phân lập từ Sắn dây đƣợc trình bày ở hình 3.15.
Hình 3.15: Hình ảnh sản phẩm IF Sắn dây: A-sản phẩm thô (41,47%), B- sản phẩm sau tinh chế lần 1 (68,67%), C-sản phẩm sau tinh chế lần 2
(84,53%).
3.6. Đánh giá khả năng tái sử dụng của nhựa macroporous D101
Sau mỗi lần sử dụng, nhựa D101 đƣợc xử lý nhƣ mô tả ở mục 2.3.5. Đánh giá khả năng hấp phụ và tỷ lệ giải hấp phụ nhƣ sau: Cân chính xác 1g nhựa cho vào bình nón 100ml, thêm vào bình nón 30ml dịch chiết Sắn dây có nồng độ isoflavonoid chính xác khoảng 3mg/ml (C1), khuấy từ với tốc độ 120
A B
54 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
vòng/phút trong 3 giờ ở nhiệt độ phòng. Nồng độ isoflavonoid trong dịch sau hấp phụ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp quang phổ UV-VIS đƣợc mô tả ở mục 2.3.2. Sau khi hấp phụ, nhựa đƣợc tách riêng bằng cách lọc hút. Sau đó chuyển vào bình định mức khác có sẵn 30ml ethanol 70%. Lắc đều trong 1 giờ để quá trình giải hấp phụ đạt cân bằng. Nồng độ isoflavonoid trong dịch giải hấp phụ đƣợc xác định (CGHP). Tỷ lệ isoflavonoid Sắn dây giải hấp phụ từ nhựa đƣợc xác định theo công thức mô tả ở mục 2.3.7 và khả năng hấp phụ của nhựa đƣợc xác định theo công thức ở mục 2.3.8. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.14 và hình 3.16
Bảng 3.14: Khả năng hấp phụ và tỷ lệ giải hấp phụ của nhựa sử dụng lần đầu và nhựa tái sử dụng
Số lần đã sử dụng 0 1 2 3 4
Khả năng hấp phụ (mg/g) 16,44 16,35 16,30 16,37 16,17 Tỷ lệ giải hấp phụ (%) 98,36 100,93 99,69 98,77 101,04
Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi khả năng hấp phụ và tỷ lệ giải hấp phụ theo số lần sử dụng 90.00 92.00 94.00 96.00 98.00 100.00 102.00 104.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 1 2 3 4 5 Số lần đã sử dụng
55
Kết quả khảo sát cho thấy: Khả năng hấp phụ ở trạng thái tĩnh của nhựa D101 giảm nhẹ sau 4 lần sử dụng (từ 16,44 xuống 16,17 mg/g), tuy nhiên sự thay đổi này là không rõ ràng. Bên cạnh đó, tỷ lệ giải hấp phụ từ nhựa D101 cũng không có sự biến đổi nhiều, điều này cho thấy khả năng tái sử dụng rất tốt của nhựa D101.
56
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 1. Nguyên liệu
Nguyên liệu sử dụng để nghiên cứu đƣợc thu hái ở cùng một địa điểm, đƣợc xử lý, nghiền và làm đồng nhất để đảm bảo tính chính xác giữa các thí nghiệm. Tuy nhiên, luận văn chƣa có điều kiện để làm rõ tên loài Sắn dây. Trong Dƣợc điển Việt Nam IV[1], Sắn dây là loài Pueraria thomsonii Benth. Theo Ngô Văn Thu[4] thì có 2 loài chính là P. thomsonii và P.lobata đƣợc dùng không phân biệt ở Việt Nam. Dƣợc điển Trung Quốc lại phân biệt rõ ràng 2 loài này dựa theo hàm lƣợng puerarin. P. thomsonii có hàm lƣợng puerarin trên 0,3% còn P. lobata có hàm lƣợng puerarin trên 2,4%[34]. Nguyên liệu đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này có hàm lƣợng isoflavonoid toàn phần là 1,05% và hàm lƣợng puerarin là 0,56% kết quả này phù hợp với kết quả của Phạm Thị Phƣơng Dung và nhóm nghiên cứu đã thực hiện năm 2014[3]. Dựa trên hàm lƣợng puerarin, có thể sơ bộ dự đoán loài Sắn dây đƣợc sử dụng là loài P. thomsonii Benth.
2. Phƣơng pháp định lƣợng và chất chuẩn
Phƣơng pháp định lƣợng sử dụng trong nghiên cứu đƣợc tham khảo điều kiện định lƣợng theo Dƣợc điển Trung Quốc và một số tài liệu khác[19], [21]. Tuy nhiên, luận văn chƣa có điều kiện thẩm định lại phƣơng pháp mà mới chỉ khảo sát đƣợc khoảng nồng độ tuyến tính. Các chất chuẩn có sẵn tại cơ sở là chuẩn thứ cấp, có mức độ tinh khiết còn thấp (puerarin 82,31%). Điều này cũng gây ra sai số nhất định trong định lƣợng, đặc biệt là các mẫu có hàm lƣợng cao (sản phẩm sau tinh chế). Tuy nhiên, việc sử dụng chất đối chiếu có hàm lƣợng thấp cũng hạn chế đƣợc sai số gây ra bởi các tạp chất có mặt trong mẫu, do mẫu thử và mẫu chuẩn đều có một lƣợng tạp chất tƣơng đƣơng sẽ triệt tiêu ảnh hƣởng của tạp chất.
57
3. Phƣơng pháp chiết
Luận văn sử dụng phƣơng pháp chiết ngâm ở điều kiện thƣờng, dung môi là nƣớc. Phƣơng pháp có ƣu điểm đơn giản, dễ nâng quy mô, chi phí trang thiết bị thấp, ổn định ở các quy mô nghiên cứu nên dễ ứng dụng trên quy mô lớn. Lựa chọn nƣớc làm dung môi chiết xuất có ƣu điểm là một dung môi rẻ tiền, sẵn có, không độc hại, có khả năng chiết xuất tốt các isoflavonoid từ Sắn dây, có thể thu đƣợc tinh bột. Ngoài ra, Nƣớc cũng là dung môi thích hợp nhất cho quá trình hấp phụ isoflavonoid qua cột nhựa macroporous D101. Do đó, dịch chiết nƣớc có thể đƣợc sử dụng trực tiếp để tiến hành quá trình hấp phụ. Theo nghiên cứu của Hai-Dong Guo[13], dung môi ethanol/nƣớc cho hiệu suất chiết xuất isoflavonoid tốt nhất, tuy nhiên khi nồng độ ethanol trong dịch chiết tăng, khả năng hấp phụ isoflavonoid của nhựa macroporous giảm xuống, khi nồng độ ethanol 50% thì khả năng hấp phụ isoflavonoid của nhựa macroporous trở về 0. Do đó, sau khi chiết bằng ethanol, dịch chiết đƣợc cô đặc loại ethanol sau đó hòa tan bằng nƣớc rồi mới tiến hành hấp phụ lên nhựa macroporous. Quá trình cô đặc tốn năng lƣợng để cô loại dung môi, khó áp dụng ở quy mô công nghiệp.
4. Phƣơng pháp phân lập isoflavonoid bằng nhựa macroporous D101
Có nhiều phƣơng pháp phân lập isoflavonoid từ Sắn dây nhƣ: phƣơng pháp thay đổi dung môi, phƣơng pháp sắc ký phân bố ngƣợc dòng tốc độ cao... Nhƣng các phƣơng pháp có một số nhƣợc điểm nhƣ: Cần lƣợng lớn dung môi hữu cơ, quy mô nhỏ, tính kinh tế không cao...Hƣớng đi mới sử dụng nhựa macroporous D101 phân lập isoflavonoid từ Sắn dây có nhiều ƣu điểm nhƣ: Thực hiện đơn giản, chi phí thấp, nhựa có thể tái sử dụng nhiều lần. Thực tế, nhựa macroporous có nhiều loại khác nhau. Tuy nhiên, do điều kiện cơ sở chỉ có nhựa D101 nên nghiên cứu mới chỉ tiến hành trên loại nhựa này.
58
Phƣơng pháp phân lập bằng nhựa macroporous cũng có thể coi là phƣơng pháp sắc ký hấp phụ, pha tĩnh đƣợc sử dụng là là nhựa macroporous D101, pha động là nƣớc và ethanol. Để đơn giản, luận văn sử dụng cột tự nhồi, phù hợp với điều kiện của cơ sở. Cách đƣa pha động di chuyển qua pha tĩnh là nhờ trọng lực. Tốc độ chảy đƣợc điều chỉnh bằng bằng khóa. Vì những lý do này, hiệu lực tách của cột chƣa đƣợc lý tƣởng. Hiệu quả phân lập có thể cải thiện bằng cách sử dụng cột chuyên dụng, hạt đƣợc nhồi dƣới áp suất cao, kiểm soát tốc độ chảy của pha động bằng bơm. Quá trình phân lập có thể chia ra làm 2 giai đoạn chính là giai đoạn hấp phụ và giai đoạn giải hấp phụ.
- Giai đoạn hấp phụ
Quá trình hấp phụ đạt trạng thái cân bằng khi nồng độ isoflavonoid trong dịch sau cột bằng nồng độ isoflavonoid trong dịch nạp cột. Vì vậy, có thể chọn điểm dừng cho giai đoạn giải hấp phụ khi nồng độ isoflavonoid trong dịch nạp cột bằng nồng độ isoflavonoid trong dịch sau cột. Tuy nhiên, để quá trình hấp phụ đạt đƣợc trạng thái cân bằng, lƣợng isoflavonoid không đƣợc hấp phụ quá lớn. Luận văn chọn điểm dừng cho quá trình hấp phụ là khi tỷ lệ isoflavonoid không đƣợc hấp phụ đạt 10%, mục đích để hạn chế tối đa lƣợng isoflavonoid không đƣợc hấp phụ, đảm bảo hiệu suất cho giai đoạn này. Điểm dừng hấp phụ đƣợc lựa chọn tùy thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: Chất lƣợng nhựa, đối tƣợng cần phân lập, ... Hai-Dong Guo chọn điểm dừng hấp phụ khi tỷ lệ isoflavonoid không đƣợc hấp phụ đạt 5%[13]. Tại đó, bắt đầu có sự “rò rỉ” các isoflavonoid từ cột. Khuôn khổ luận với mới chỉ nghiên cứu đƣợc ảnh hƣởng của các yếu tốt chính đến quá trình hấp phụ là nồng độ và thể tích dịch nạp cột. Ngoài ra, còn nhiều yếu tố khác ảnh hƣởng đến quá trình hấp phụ isoflavonoid của nhựa macroporous D101 nhƣ: Nhiệt độ, pH của dịch nạp cột, kích thƣớc cột nhựa, tốc độ nạp dịch, .... Tỷ lệ chiều cao/đƣờng kính cột càng lớn thì quãng đƣờng di chuyển của chất tan càng dài. Do đó, thời
59
gian tiếp xúc giữa chất tan và nhựa tăng lên, dung lƣợng hấp phụ tăng lên. Theo Hai-Dong Guo[13], chiều dài cột gấp 2-3 lần chiều dài vùng chuyển khối cho kết quả hấp phụ tốt nhất. Tốc độ nạp dịch nhỏ, thời gian tiếp xúc giữa chất tan và nhựa càng tăng làm tăng hiệu quả giai đoạn hấp phụ. Tuy nhiên, điều này có nhƣợc điểm là kéo dài thời gian của quá trình hấp phụ. Theo khuyến cáo từ nhà sản xuất nhựa, tốc độ hấp phụ nên từ 2 đến 4BV/giờ.