Đánh giá hàm lượng một số isoflavonoid trong cây sắn dây củ tròn (pueraria candollei var mirifica (airy shaw suvat) niyomdham) trồng tại bắc giang bằng phương pháp HPTLC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ QUANG THÁI 1101476 ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG MỘT SỐ ISOFLAVONOID TRONG CÂY SẮN DÂY CỦ TRÒN (PUERARIA CANDOLLEI VAR MIRIFICA (AIRY SHAW & SUVAT) NIYOMDHAM) TRỒNG TẠI BẮC GIANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ QUANG THÁI 1101476 ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG MỘT SỐ ISOFLAVONOID TRONG CÂY SẮN DÂY CỦ TRÒN (PUERARIA CANDOLLEI VAR MIRIFICA (AIRY SHAW & SUVAT) NIYOMDHAM) TRỒNG TẠI BẮC GIANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn PGS TS Nguyễn Quố c Huy TS Vũ Xuân Giang Nơi thực hiê ̣n Bô ̣ môn Thực vâ ̣t – Trường Đa ̣i ho ̣c Dươ ̣c Hà Nô ̣i HÀ NỘI – 2016 LỚI CẢM ƠN Trải qua chặng đường dài nghiên cứu với nhiều khó khăn thử thách nỗ lực thân chắn hoàn thành khóa luận không bảo, động viên, giúp đỡ dù hay nhiều, trực tiếp hay gián tiếp thầy cô, anh chị, gia đình, bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Nguyễn Quốc Huy, TS Vũ Xuân Giang người thầy bảo, đưa lời khuyên để có hướng đắn tạo điều kiện tốt cho hoàn thành khóa luận Xin chân thành cảm ơn tới DS Nguyễn Thị Thùy Linh người chị bảo, nhắc nhở, lắng nghe, động viên tôi gặp khó khăn bế tắc Xin gửi lời cảm ơn đến thầy Nghiêm Đức Trọng, DS Phạm Thị Linh Giang, DS Phạm Thị Việt Hồng giúp đỡ, bảo kiến thức bổ ích trình thực khóa luận Xin gửi lời cảm ơn đến Bộ môn Thực vật, đơn vị trường ĐH Dược Hà Nội, bạn (Hương, Kim, Vân, Ly, Dự, Hạnh, ) giúp đỡ, tạo điều kiện để hoàn thành tốt trình thực nghiệm Cuối xin cảm ơn Bố, Mẹ nuôi nấng, động viên, tạo điều kiện cho học tập Cảm ơn thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội với tri thức tâm huyết để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em suốt năm học tập trường Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội ngày 10 tháng năm 2016 Sinh Viên Đỗ Quang Thái MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 LOÀI PUERARIA CANDOLLEI VAR MIRIFICA (AIRY SHAW & SUVAT) NIYOMDHAM 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố .3 1.1.2 Thành phần hàm lượng số phytoestrogen SDCT 1.1.2.1 Thành phần số phytoestrogen SDCT .4 1.1.2.2 Hàm lượng số phytoestrogen yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng isoflavonoid SDCT 1.1.3 Độc tính tác dụng sinh học SDCT .6 1.1.3.1 Độc tính 1.1.3.2 Tác dụng sinh học 1.1.4 Một số tác dụng SDCT theo y học cổ truyền Thái Lan 1.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPTLC) 1.2.1 Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) .9 1.2.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) 10 1.2.3 Ứng dụng HPTLC định lượng .10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 12 2.1.1 Nguyên liệu 12 2.1.2 Hóa chất thiết bị .13 2.1.2.1 Hóa chất, chất chuẩn 13 2.1.2.1 Thiết bị 14 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.3.1 Lựa chọn isoflavonoid để định lượng .15 2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng HPTLC: .16 2.3.3 Thẩm định phương pháp 19 2.3.4 Phương pháp công cụ xử lý số liệu 22 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 23 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 23 3.1.1 Xử lý mẫu chuẩn bị dung dịch thử 23 3.1.2 Chuẩn bị mẫu chuẩn 23 3.1.3 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 23 3.1.3.1 Kết khảo sát lựa chọn pha động .23 3.1.3.2 Kết khảo sát lựa chọn bước sóng .24 3.1.3.3 Khảo sát khoảng tuyến tính 25 3.1.3.4 Kết lựa chọn điều kiện sắc ký 26 3.2 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PUERARIN VÀ DAIDZIN TRONG SDCT BẰNG HPTLC 28 3.2.1 Kết thẩm định phương pháp định lượng puerarin SDCT HPTLC 28 3.2.2 Kết thẩm định phương pháp định lượng daidzin SDCT HPTLC 32 3.3 KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ISOFLAVONOID TRONG MỘT SỐ MẪU BẰNG HPTLC 36 CHƯƠNG BÀN LUẬN 37 KÊT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AOAC: Association of Official Analytical Chemists EtOAc: Ethyl acetat EtOH: Ethanol FDA Thailand: Food and Drug Administration Thailand HPLC: High Performance Liquid Chromatigraphy HPTLC: High Performance Thin Layer Chromatigraphy NP/PEG: Natural Products/Polyethylene Glycol MeOH: Methanol P :Pueraria Rf : Retention factor (Hệ số lưu) RSD: Relative Standard Deviation (độ lệch chuẩn tương đối) SD: Standard Deviation SDCT: Sắn dây củ tròn (Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat.) Niyomdham) SST: Số thứ tự TLC: Thin Layer Chromatography USP 38 – NF33: United States Pharmacopoea 38 - National Formulary 33 UV – VIS : Ultraviolet - Visible DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Danh mục mã mẫu nghiên cứu 13 Bảng 2.2 Bảng danh mục loại hóa chất, chất chuẩn sử dụng 14 Bảng 2.3 Danh mục hệ pha động khảo sát 17 Bảng 3.1 Khối lượng bột dược liệu chiết (g) thể tích dịch chiết mẫu sau (ml) 23 Bảng 3.2 Kết khảo sát khoảng tuyến tính puerarin daidzin 25 Bảng 3.3 Thể tích chấm mẫu 27 Bảng 3.4 Kết thẩm định khoảng tuyến tính puerarin 29 Bảng 3.5 Kết thẩm định độ thích hợp hệ thống puerarin 30 Bảng 3.6 Kết thẩm định độ thu hồi puerarin 31 Bảng 3.7 Kết thẩm định khoảng tuyến tính daidzin 33 Bảng 3.8 Kết thẩm định độ thích hợp hệ thống daidzin 34 Bảng 3.9 Kết thẩm định dộ thu hồi daidzin 34 Bảng 3.10 Kết định lượng puerarin daidzin số mẫu 36 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Cấu trúc hóa học β - Estradiol số phytoestrogen Hình 2.1 Cây SDCT Xã Song Mai – Thành phố Bắc Giang – Tỉnh Bắc Giang 12 Hình 2.2 Một số mẫu nghiên cứu 13 Hình 2.3 Hệ thống máy sắc ký HPTLC 15 Hình 3.1 Sắc ký đồ dịch chiết củ SDCT khai triển với hệ EtOAc: MeOH : H2O (8: 1.75: 1) Hình 3.2 23 Ảnh hưởng thời gian hơ NH3 đế Rf puerarin Sắc ký đồ khai triển với hệ EtOAc: MeOH : H2O (8:1.75:1) 24 Hình 3.3 Puerarin trước sau hơ NH3 25 Hình 3.4 Đồ thị mô tả tương quan diện tích peak lượng mẫu chuẩn (ng) puerarin daidzin Hình 3.5 Phổ hấp thụ vị trí vết puerarin mẫu chuẩn, mẫu thử TL3 mẫu trắng bước sóng từ 200 - 400nm Hình 3.6 26 28 Sắc ký đồ (bên trái) Phổ huỳnh quang (bên phải) mẫu chuẩn puerarin, mẫu thử TL3 mẫu trắng bước sóng 366nm 28 Hình 3.7 Đường chuẩn puerarin khoảng (282 - 620ng) 29 Hình 3.8 Phổ hấp vị trí vết daidzin mẫu chuẩn , mẫu thử TL3 mẫu trắng bước sóng từ 200 - 400nm Hình 3.9 32 Sắc ký đồ (trái) ảnh chồng phổ hấp phụ (phải) mẫu chuẩn daidzin puerarin; mẫu thử TL3 mẫu trắng bước sóng 254nm 32 Hình 3.10 Đường chuẩn daidzin khoảng (200.01- 533.36ng) 33 Hình 4.1 Biểu đồ hàm lượng puerarin, daidzin, tổng hàm lượng daidzin puerarin (mg) 100g bột dược liệu khô mẫu 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Mãn kinh trình sinh lý bình thường thể người phụ nữ Phụ nữ tuổi 45- 52 thường buớc vào giai đoạn mãn kinh với xuất số triệu trứng như: bốc hỏa, vã mồ hôi, dễ căng thẳng lo lắng, hay ngủ, khô âm đạo có nguy cao bị loãng xương xơ vữa động mạch Theo nhà khoa học nguyên nhân dẫn đến thời kì mãn kinh phụ nữ giảm tiết hormon giới tính nữ estrogen [2] Vì để làm giảm triệu chứng giai đoạn thường sử dụng liệu pháp thay hormon (Hormone replacement therapy - HRT) sử dụng thuốc có chất hormon để bổ sung lượng estrogen thiếu hụt thể Phương pháp HRT có ưu điểm tác dụng nhanh, hiệu triệu chứng giảm cách đáng kể nhiên việc sử dụng kéo dài làm tăng số nguy như: ung thư vú, đột quỵ, nhồi máu tim [15] Do liệu pháp khác lựa chọn sử dụng estrogen có nguồn gốc thảo dược (Phytoestrogen) có ưu điểm tác dụng phụ điều trị kéo dài đồng thời giảm số triệu chứng phụ nữ thời kỳ mãn kinh [36] Ở Thái Lan, sắn dây củ tròn loài sử dụng y học dân gian có tác dụng trẻ hóa phụ nữ tuổi mãn kinh [22] Các nghiên cứu cho thấy có chứa nhiều loại phytoestrogen có tác dụng hướng estrogen mạnh thuộc nhóm chromen, coumetan, isoflavonoid Đồng thời có số báo cáo thử nghiệm tiền lâm sàng, lâm sàng chứng minh tác dụng cải thiện triệu chứng phụ nữ thời kỳ mãn kinh [23], [26], [31] Một vài năm gần trồng thử Việt Nam kết cho thấy sinh trưởng tốt nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá hàm lượng isoflavonoid Chính thực nghiên cứu “Đánh giá hàm lượng số isoflavonoid sắn dây củ tròn (Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat.) Niyomdham) trồng Bắc Giang phương pháp HPTLC “ với mục tiêu Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng số isoflavonoid củ sắn dây củ tròn phương pháp HPTLC 2 Đánh giá hàm lượng số isoflavonoid củ sắn dây củ tròn trồng Việt Nam so với số mẫu Thái Lan 27 Reich E et al (2007), High-performance thin-layer chromatography for the analysis of medicinal plants, Thieme 28 Spriano B M.SOP for HPTLC, International Association for the Advancement of HPTLC, Switzerland 29 Srivastava M (2010), High-performance thin-layer chromatography (HPTLC), Springer Science & Business Media 30 Sucontphunt A et al (2011), "Protection of HT22 neuronal cells against glutamate toxicity mediated by the antioxidant activity of Pueraria candollei var mirifica extracts", Journal of natural medicines 65 (1), pp 1-8 31 Trisomboon H et al (2004), "Long-term treatment effects of Pueraria mirifica phytoestrogens on parathyroid hormone and calcium levels in aged menopausal cynomolgus monkeys", Journal of Reproduction and Development 50 (6), pp 639-645 32 Virojchaiwong P et al (2011), "Comparison of Pueraria mirifica 25 and 50 mg for menopausal symptoms", Archives of gynecology and obstetrics 284 (2), pp 411-419 33 Yusakul G et al (2011), "Comparative analysis of the chemical constituents of two varieties of Pueraria candollei", Fitoterapia 82 (2), pp 203-207 Tài liệu internet 34 Hệ thống HPTLC định lượng – Camag http://www.camag.com/en/tlc_hptlc/complete_systems/advanced_systems/H PTLC_system_for_quantitative_analyses_few_samples.cfm 35 FDA ThaiLan http://www.fda.moph.go.th/News59/Cosmetic/cosmeticmanual151058.pdf 36 Mãn kinh https://en.wikipedia.org/wiki/Menopause 37 Catalogue of Life http://www.catalogueoflife.org/col/details/species/id/d67f3972013f3f6cbd67 a45085bd8fe3 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC VÀ BẢN MÔ TẢ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT PHỤ LỤC 2: GIẤY CHỨNG NHẬN MÃ SỐ TIÊU BẢN PHỤ LỤC 3: SĂC KÝ ĐỒ MỘT SỐ HỆ KHẢO SÁT PHỤ LỤC 4: SẮC KÝ ĐỒ ĐỊNH LƯỢNG PUERARIN VÀ DAIDZIN TRONG CÁC MẪU NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC 5: PHIẾU KIỂM NGHIỆM CHẤT CHUẨN PUERARIN VÀ DAIDZIN CỦA NHÀ SẢN XUẤT PHỤ LỤC 1: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC BẢN MÔ TẢ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT Đặc điểm thực vật Mẫu SDCT nhập nội trồng thử xã Song Mai – Thành phố Bắc Giang – tỉnh Bắc Giang, trồng từ 1-3 năm hoa vào tháng 1-3; vào tháng 4-6 hàng năm Đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu sau: Cây dây leo thân quấn Thân tròn, màu nâu, non có lớp lông miṇ màu trắ ng phủ bên ngoài, già nhẵn, có khía Rễ phı̀nh thành củ to đến 20 x 30 cm, vỏ màu nâu nha ̣t, phı́a bên màu trắng, mặt cắt ngang củ hình nan hoa xe đạp Lá kép chét, dài đến 60 cm, có lá kèm nhỏ, mảnh, hình giáo, dài khoảng mm Hai lá chét bên mo ̣c đối, hı̀nh trứng ngược, dài 20 cm, mép lá nguyên, lệch gốc, mă ̣t nhẵn, màu xanh đâ ̣m, mă ̣t dưới có lông ngắn màu trắ ng; chét hình thoi, đầu nhọn nguyên; có lá kèm nho ̣n, dài khoảng mm; cuố ng lá có lông miṇ màu trắ ng, dài khoảng 3-4 mm Gân lá hı̀nh lông chim, 4-6 că ̣p gân phụ, nổ i mă ̣t lá chét Cu ̣m mang hoa da ̣ng chùm tụ tán, mo ̣c ở đầu cành nách lá, tru ̣c cu ̣m hoa màu nâu, có lông miṇ màu trắng bao phủ phı́a ngoài, cành cụm dài khoảng 25-30 cm Cuố ng hoa màu nâu, có lông miṇ phủ phı́a ngoài, dài khoảng 1-3 mm Lá bắc cụm hoa 1, mảnh, kích thước 1×4 mm, mặt mang lông dài, mau, mặt nhẵn Mỗi cụm hoa tán mang hoa, có bắc hình khiên Hoa màu xanh tím, dài khoảng 1,5 cm, không đề u, lưỡng tı́nh Hoa có bắc con, hình tam giác tròn, mặt nhẵn, màu trắng, mặt nhiều lông, màu vàng nhạt, điểm màu tím đỉnh lá, kích thước 1×1,5 mm, dễ rụng Đài 5, dài khoảng mm, hàn liề n 80%, giống hı̀nh chuông, màu tím nâu, có lông miṇ bao phủ phı́a ngoài Tràng 5, nhẵn, không đề u, màu xanh tím, hı̀nh cánh bướm; Tiề n khai hoa cờ; Cánh cờ tròn, đỉnh nhọn xẻ thùy ít, phiến dài 1.1 rộng 0.6 cm có vệt màu vàng trắng hình thoi giữa; Cánh bên phiến dài cm, rộng 0.3 cm; Cánh thìa dính 50%, phiến dài 1cm rộng 0.3 cm, ôm lấy nhị nhụy Bô ̣ nhi ̣10, chia thành bó: nhi ̣dı́nh la ̣i thành mô ̣t ố ng không kı́n, bao quanh nhu ̣y, khe hở có nhi ̣ thứ 10 nằ m tự ta ̣o thành bô ̣ nhi ̣ kiể u (9)+1 Bao phấ n đı́nh lưng, ô, hướng ngoài, nứt ̣c Bầu chứa noãn mang nhiều noãn, nhiều ô, đı́nh noañ mép Bầ u nhu ̣y màu xanh, dài hı̀nh cuố ng, có lông màu trắ ng bao phı́a ngoài; vòi nhu ̣y cong, nhẵn, núm nhụy hình đầu Quả dẹt dài 5-10cm , vỏ màu nâu, phần cuống vết tích đài, bắc, cánh cờ Trên bề mặt mép có lông Quả có từ 2-5 hạt, có vách ngăn hạt Hạt dài 3-4mm, hình thận Hình Hình ảnh cây, củ lá, cụm hoa mẫu nghiên cứu (chú thích:1 Cây; 2-Rễ củ; 3-mặt cắt ngang củ; 4-chùm hoa; 5-lá kèm; 6-mặt lá; 7-mặt lá) Hình Phân tích hoa cụm hoa mẫu nghiên cứu (chú thích: 1-Cụm hoa; 2-Cụm hoa nhỏ; 3-Hoa; 4-Lá bắc hoa; 5-Đài hoa; 6-Lá bắc cụm hoa; 7-Tràng nhị nhụy; 8-Bộ nhị nhụy nụ hoa; 9-Bộ nhụy cắt dọc; 10-Quả; 11-bề mặt mép quả; 12-hạt ) Tổng kết tra khóa phân loại chi Pueraria theo Wing Ming Keung (2002) đường dẫn khóa phân loại (in đậm) [1] 1a Cây bụi mọc thẳng thân cứng Hoa từ 2-10 cụm hoa con, cuống cụm hoa ngắn, cụm hoa thường phân nhánh .2 1b Cây dây leo, dạng thảo nhiều mọc hướng lên .3 2a Tràng hoa dài gấp 3-5 lần đài, đài hoa chia thùy ngắn, góc tù, bắc rụng sớm Cây thảo cứng, phân nhánh…………………………………… … 15 P wallichii 2b Tràng hoa dài gấp đôi đài, đài chia thùy, có góc nhọn, phía tù, bắc mềm, trở nên cứng cong lại thành Cây thân gỗ leo…………….…13 P stricta 3a Tràng hoa dài gấp 2-3 lần đài, cuống mảnh dài Hoa 4-7 hoa cụm nhỏ, loại đậu, phẳng mỏng giấy, cụm hoa không chia nhánh, 1-2 cụm hoa mọc nách P peduncularis 3b Cuống hoa ngắn, không mảnh… .4 4a Hoa từ 2-3 cụm, kèm hình khiên, phía đài hàn liền gần hoàn toàn hoàn toàn, đậu dẹt 4b Mỗi cụm hoa nhiều hơn, kèm hình khiên, phía đài không hàn liền, loại đậu hình tròn, có 20 hạt/quả, có vách ngăn hạt 10 P phaseoloides 5a Hoa nhỏ, tràng hoa dài 7-13 (có thể đến 15) mm, bắc đài mang nhiều lông tơ, lông không dài, mặt bên đài chia thùy nhọn, đài chia thùy hình trứng, chét nguyên, chia thùy lượn sóng, dài 5-9 cm, rộng 3-4 mm 10b var phaseoloides 5b Hoa lớn, tràng dài 15-23 mm ……… 6a Lá bắc đài nhiều lông tơ, đài hoa phiá bên chia thùy góc tù, phía chia thùy nhọn Lá chét nguyên, chia thùy, loại đậu dài 7-11 cm, rộng 4-5 mm .10a var javanica 6b Lá bắc đài mang nhiều lông, phía mặt bên đài chia thùy góc nhọn, phía dài chia thùy nhọn, bắc rộng, mép nguyên đến chia thùy sâu, loại đậu dài 7-12.5 cm, rộng 4-5 mm 10c var subspicata 7a Hoa dài chưa đến (-12) mm, đường hàn mép có mang nhiều lông Lá chét nguyên, hình trứng, kèm lớn, ôm thân, che chồi, sớm rụng để lại vết sẹo mảnh .11 P pulcherrima 7b Hoa dài 10-12 mm, mang lông mép mặt bên Lá chét bên có dạng thùy,có kèm, rụng để lại sẹo hình bầu dục .8 8a Chùm hoa không phân nhánh với 1-2 cành………… 8b Chùm hoa phân nhánh có kèm giống bắc vị trí cuống lá……………………………………………………………………………………13 9a Lá kèm nhỏ chét mọc vị trí khoảng ¼ vị trí cuống chét, chét luôn chia thùy, phía đài chia thùy mảnh P edulis 9b Lá kèm mọc phía cuống chét, chét chia thùy không, phía đài hoa không chia thùy chẻ nhỏ 10 10a Lá chét dài hình elip, không chia thùy, đài chia thùy, hình tù P bella 10b Lá chét hình oval đến hình cầu, chia thùy không, đài chia thùy nhọn……………………………………………………………… P montana: 11 11a Lá chét chia thùy, nguyên, chiều dài chiều rộng thường nhau, hoa lớn, dài 18 mm hơn, đài (15-)17 mm hơn, mang lông dày màu xám, chia thùy 2-4 mm, xếp đè lên nhau, loại đậu 8–13 × 0.9–1.3 cm 8a var chinensis 11b Lá chét nguyên chia thùy 3, hoa nhỏ ……… 12 12a Lá chét nguyên, thường chiều dài chiều rộng, mang lông, hoa dài đến 12 (-15) mm, đài dài 8-11 mm, chia thùy rộng 1-2 mm, mang lông tơ màu nâu gần nhẵn, loại đậu nhỏ, kích thước 4–10 × 0.6–0.9 cm 8c var montana 12b Lá chét chia thùy, nguyên, chiều dài chiều rộng nhau, nhẵn, loại đậu có kích thước 5–13 × 0.7–1.2 cm 8b var lobata 13a Thân leo mang nhiều lông tơ, đài chia thùy dài 14 13b Thân leo mang lông tơ mang lông tơ ngắn, phần chia thùy đài dài gấp đôi phần hàn liền 15 14a Lá chét 5-7 đầu nhọn, hoa cụm hoa nhỏ, phần chia thùy đài dài gấp 3- lần phần hàn liền P calycina 14b Lá chét hình trứng-thoi, hoa cụm nhỏ, phần chia thùy đài dài gấp 4-6 lần phần hàn liền P lacei 15a Cụm hoa chia nhánh ít, giống hình xim, hoa mọc dày, bắc dài 10-15 mm, nhiều lông, 3mm, sớm rụng, dài gần phần hàn liền đài, nở hoa rụng P alopecuroides 15b Cụm hoa phân nhánh nhiều, bắc dài đến 10 mm, lông dài đến mm, sớm rụng, bắc dài khoảng ½ phần hàn liền đài…… 16 16a Hoa rụng nở, cành già không rụng, đài hoa chia thùy hình trứng nhọn, lợp P imbricata 16b Hoa nở rụng lá, đài chia thùy hình tam giác tù .17 17a Cụm hoa mọc nhiều, lông tơ ngắn, mịn 12 P sikkimensis 17b Cụm hoa dài thưa, mang lông vàng nâu nhẵn……… 18 18a Nhị rời, đài mang lông tơ màu vàng nâu xám, loại đậu mang nhiều lông 14 P tuberosa 18b Chỉ nhị hàn liền thành ống, đài mang lông ngắn, dày màu xám nâu, loại đậu gần nhẵn P candollei: 19 19a Cụm hoa thường dài 30 cm, đài xanh tím, mang lông tơ, hoa dài 12-15 mm 4a var candollei 19b Cụm hoa dài đến 30 cm, đài hoa mang lông tơ ngắn dày, hoa dài 810 mm ………… 4b var mirifica So sánh mẫu nghiên cứu với hình ảnh từ phòng tiêu khác Phòng tiêu Queen Sirikit-Thái Lan (Mã số tiêu bản: QBG No: 17533) Mẫu nghiên cứu Kết luận Dựa đặc điểm hình thái mô tả loài nghiên cứu tham khảo tài liệu phân loại thực vật so sánh đối chiếu mẫu nghiên cứu với mẫu tiêu giới loài Xác định loài thu hái Bắc Giang có tên khoa học Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat) Niyomdham, thuộc họ Đậu (Fabaceae) Tài liệu tham khảo Wing Ming Keung (2002), Pueraria: The genus Pueraria, Taylor & Francis, London PHỤ LỤC 2: GIẤY CHỨNG NHẬN MÃ SỐ TIÊU BẢN PHỤ LỤC 3: SẮC KÝ ĐỒ MỘT SỐ HỆ KHẢO SÁT EtOAc:MeOH:H2O (8:1:1) CHCl3:EtOAc:MeOH:H2O (16.2:52:18.8:3) CH2Cl2:EtOH:A.Acetic (6:2:0.15) CH2Cl2:EtOAc:MeOH:H2O EtOAc:A.Formic:A.Acetic:H2O (20:40:22:10) (100:11:11:26) EtOAc:MeOH:H2O (8:2:1) PHỤ LỤC 4: SẮC KÝ ĐỒ ĐỊNH LƯỢNG PUERARIN VÀ DAIDZIN TRONG CÁC MẪU NGHIÊN CỨU Sắc ký đồ: Định lượng Puerarin Sắc ký đồ: Định lượng Daidzin PHỤ LỤC 5: PHIẾU KIỂM NGHIỆM CHẤT CHUẨN PUERARIN VÀ DAIDZIN CỦA NHÀ SẢN XUẤT [...]... năng cao HPTLC – Camag (Thụy Sĩ) 15 Hình 2.3 Hệ thống máy sắc ký HPTLC 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng một số isoflavonoid trong SDCT bằng phương pháp HPTLC - Thẩm định quy trình định lượng - Áp dụng quy trình định lượng đã xây dựng để đánh giá hàm lượng một số isoflavonoid ở cây trồng tại Việt Nam và so sánh với một số mẫu có nguồn gốc Thái Lan 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN...3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 LOÀI PUERARIA CANDOLLEI VAR MIRIFICA (AIRY SHAW & SUVAT) NIYOMDHAM 1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố Theo phân loại của Catalogue of Life [37] thì sắn dây củ tròn có: Tên khoa học: Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat.) Niyomdham Tên đồng nghĩa: Pueraria mirifica Airy Shaw & Suvat Tên Việt Nam hay dùng: Sắn dây củ tròn, Sâm tố nữ Hệ thống phân loại Giới Thực... dựng phương pháp định lượng 2 chất: puerarin và daidzin bằng HPTLC 16 2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPTLC: Xử lý mẫu thử - Xử lý mẫu và chọn phương pháp chiết là công đoạn đóng vai trò tương đối quan trọng trong quá trình định lượng bằng phương pháp HPTLC Mục đích của giai đoạn này là nhằm chiết nhiều nhất lượng chất cần phân tích, loại bớt tạp, và làm giàu mẫu - Đối với mẫu củ do trong. .. Trong đó miroestrol và kwakhurin là hai phytoestrogen chỉ được tìm thấy ở SDCT [22] 5 1.1.2.2 Hàm lượng một số phytoestrogen và các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng isoflavonoid trong SDCT Isoflavonoid là nhóm có hàm lượng lớn nhất so với các nhóm phytoestrogen khác trong SDCT Yusakul và cộng sự (2011) tiến hành định lượng hàm lượng miroestrol, deoxymiroestrol bằng phương pháp HPLC và isoflavonoid bằng. .. học của cây được xác định là Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat.) Niyomdham (mã số tiêu bản là HNIP/18159/16) (Phụ lục 2) Hình 2.1 Cây SDCT tại Xã Song Mai – Thành phố Bắc Giang – Tỉnh Bắc Giang Mẫu củ trồng tại Việt Nam: thu hái củ từ 3 cây có năm tuổi khác nhau: 9 tháng, 1 tuổi, 2 tuổi (mỗi cây củ thu hái khoảng 3 củ con) Mẫu Thái Lan gồm 3 mẫu: Củ từ Thái Lan; Sản phẩm từ Thái Lan;... gen, tuổi cây, yếu tố môi trường đến sự tích lũy hàm lượng isofavonoid trong cây Ngay cả những mẫu thu hái tại cùng một tỉnh nhưng khác huyện cũng cho kết quả khá khác nhau [8] Cũng thời điểm này, Wichai Cherdshewasart (2007) công bố nghiên cứu đánh giá hàm lượng isoflavonoid của 4 mẫu SDCT thu hái tại 4 địa phương khác nhau và cùng trồng trong một điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu từ hạt Thu củ 1 năm tuổi... liên quan giữa tổng isoflavonoid với hàm lượng miroestrol và deoxymiroestrol [33] hai phytoestrogen có hoạt tính hướng estrogen mạnh nhất trong cây Vì vậy có thể sử dụng puerarin và daidzin để đánh giá hàm lượng isoflavonoid, miroestrol và deoxymiroestrol trong cây nhằm mục đích so sánh ảnh hưởng của điều kiện trồng, giống đến hàm lượng chất có hoạt tính sinh học trong cây Do đó trong nghiên cứu này... Thái Lan; Bột dược liệu từ Thái Lan 13 TL2 VN3 VN2 Hình 2.2 Một số mẫu nghiên cứu Bảng 2.1 Danh mục mã các mẫu nghiên cứu Mẫu Việt Nam Thái Lan Mã Nguồn gốc Mô tả Củ cây 9 tháng VN 1 Bắc giang – 16/1/2016 Củ tươi Củ cây 1 tuổi VN 2 Bắc giang – 16/1/2016 Củ tươi Củ cây 2 tuổi VN 3 Bắc giang – 13/3/2016 Củ tưởi Củ từ Thái Lan TL1 Thái Lan Củ tươi Sản phẩm từ Thái Lan TL2 Siam Natural - Thái Lan Lát... isoflavonoid bằng phương pháp sử dụng kháng thể của daidzin (anti-daidzin) và puerarin (anti-puerarin) ở vỏ củ, củ, lõi củ (bỏ vỏ) Kết quả cho thấy hàm lượng isoflavonoid ở củ SDCT là 391±46 mg/100g bột dược liệu và tổng hàm lượng miroestrol và deoxymiroestrol là 12.134 ± 0.646mg/100 bột dược liệu Đồng thời hàm lượng isoflavonoid, miroestrol, deoxymiroestrol ở vỏ củ cao hơn phần lõi củ, củ [33] Wichai... đông của Thái Lan và tiến hành định lượng năm isoflavonoid: puerarin, daidzin, genistin, genistein, daidzein bằng HPLC Kết quả cho thấy hàm lượng hàm lượng isoflavnoid thu hái vào mùa hè ở cả 4 mẫu đều cao hơn nhiều so với vào mùa mưa, mùa đông Đồng thời các mẫu ở các địa phương khác nhau thu hái trong cùng một mùa cũng có sự khác nhau về hàm lượng Nghiên cứu cho thấy hàm lượng isoflavonoid ở củ cây