Ứng dụng nhựa macroporous trong làm giàu saponin từ rễ ngưu tất ( achyranthes bidentata blume)

Nghiên cứu quá trình hấp phụ saponin từ dịch chiết lên hạt nhựa macroporous D101 .... Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ saponin từ hạt nhựa macroporous D101 .... Phương pháp nghiên cứu q

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG

MSV: 1201629 ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS TRONG LÀM GIÀU SAPONIN TỪ RỄ

NGƯU TẤT (ACHYRANTHES

BIDENTATA BLUME)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG

MSV: 1201629

ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS TRONG LÀM GIÀU SAPONIN TỪ RỄ

NGƯU TẤT (ACHYRANTHES

BIDENTATA BLUME)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Nguyễn Văn Hân

2 TS Nguyễn Tuấn Hiệp

Nơi thực hiện:

Viện Dược liệu

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN!

Lời đầu tiên em xin tỏ lòng biết ơn chân thành đối với thầy giáo TS Nguyễn Văn Hân, người thầy giàu kinh nghiệm và đầy nhiệt huyết đã tạo điều kiện, giúp đỡ và chỉ bảo em trong quá trình thực hiện khóa luận này

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân

thành tới TS Nguyễn Tuấn Hiệp đã định hướng, giúp đỡ và dạy dỗ em trong suốt thời gian làm nghiên cứu

Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới anh Đỗ Quang Thái cũng như

các anh chị khoa công nghệ chiết xuất- Viện Dược liệu đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo em tận tình và giúp đỡ em hoàn thành khoá luận

Tiếp theo em xin phép gửi lòng biết ơn tới Viện Dược liệu đã tạo điều

kiện thuận lợi và nhiều động lực để em có cơ hội được học hỏi nhiều hơn

Và em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy dỗ và chỉ bảo em tận tình trong suốt

những tháng năm học tập tại trường

Cuối cùng, với lòng biết ơn vô hạn, em xin phép được gửi lời cảm ơn

tới gia đình, người thân, bạn bè đã động viên và hỗ trợ em trong suốt thời

gian qua

Do thời gian có hạn và trình độ bản thân còn hạn chế nên khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót Vì vậy, em rất mong nhận được sự chỉ bảo tận tình của các thầy cô và sự góp ý chân thành của bạn bè

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 04 năm 2017

Sinh viên

Hoàng Thị Huyền Trang

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN! 3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 8

DANH MỤC CÁC BẢNG 9

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ 10

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Achyranthes bidentata Blume 2

1.1.1 Về thực vật 2

1.1.1.1 Vị trí phân loại của Ngưu tất 2

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.1.3 Phân bố, sinh thái 3

1.1.1.4 Bộ phận dùng 4

1.1.2 Thành phần hóa học 4

1.1.2.1 Saponin 4

1.1.2.2 Phytoecdysteroid 6

1.1.2.3 Polysacharid 6

1.1.3 Tác dụng sinh học 7

1.2 Tổng quan về phương pháp tinh chế 8

1.2.1 Phương pháp chiết pha rắn (SPE) 8

1.2.1.1 Khái niệm 8

1.2.1.2 Nguyên tắc và cơ chế của SPE 8

1.2.1.3 Ứng dụng 9

1.2.2 Tổng quan về hạt nhựa macroporous 10

1.2.2.1 Định nghĩa và phân loại 10

1.2.2.2 Đặc điểm hạt nhựa macroporous 11

1.2.2.3 Tổng quan về hạt nhựa macroporous D101 11

1.2.2.3.1 Thông số vật lý 11

1.2.2.3.2 Cơ chế hấp phụ saponin của hạt nhựa D101 12

1.2.2.3.3 Ứng dụng trong tách chiết saponin 12

1.2.2.4.4 Ứng dụng hạt nhựa trong nghiên cứu Ngưu tất 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng, nguyên liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 15

2.1.1 Nguyên vật liệu 15

2.1.2 Hoá chất, thiết bị, dụng cụ 16

2.1.2.1 Hoá chất 16

2.1.2.2 Dụng cụ 16

2.1.2.3 Thiết bị 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Nghiên cứu cách xử lý hạt nhựa ban đầu 17

2.2.2 Nghiên cứu quá trình hấp phụ saponin từ dịch chiết lên hạt nhựa macroporous D101 17

2.2.3 Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ saponin từ hạt nhựa macroporous D101 17

2.2.4 Đề xuất và ổn định quy trình trình làm giàu saponin ứng dụng hạt nhựa macroporous D101 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1.Phương pháp định tính, định lượng 17

2.3.1.1 Phương pháp thuỷ phân 17

2.3.1.2 Phương pháp định tính 18

2.3.1.3 Phương pháp định lượng 18

2.3.2 Phương pháp chiết 19

2.3.3 Phương pháp xử lý dịch chiết 19

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu xử lý hạt nhựa ban đầu 19

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu quá trình hấp phụ saponin từ dịch chiết

lên hạt nhựa macroporous D101 21

2.3.5.1 Phương pháp khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột 21

2.3.5.2 Phương pháp xác định dung lượng hấp phụ của hạt nhựa trên điều kiện động 22

2.3.6 Phương pháp nghiên cứu quá trình giải hấp phụ saponin từ hạt nhựa macroporous D101 23

2.3.6.1 Khảo sát dung môi giải hấp phụ 23

2.3.6.2 Khảo sát thể tích rửa giải 24

2.3.7 Đề xuất và ổn định quy trình làm giàu saponin từ rễ Ngưu tất ứng dụng hạt nhựa macroporous D101 24

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Nghiên cứu xử lý hạt nhựa ban đầu 27

3.2 Khảo sát quá trình hấp phụ saponin lên hạt nhựa macroporous D101 ở điều kiện động 28

3.2.1 Khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột 28

3.2.2 Xác định dung lượng hấp phụ của hạt nhựa trên điều kiện động 29

3.3 Khảo sát quá trình giải hấp phụ saponin trên hạt nhựa macroporous D101 30

3.3.1 Lựa chọn dung môi giải hấp phụ saponin 30

3.3.2 Khảo sát thể tích rửa giải 31

3.3.2.1 Quá trình rửa tạp chất 31

3.3.2.2 Quá trình giải hấp phụ bằng ethanol 50%, 70%, 96% 33

3.4 Đề xuất quy trình làm giàu saponin ứng dụng hạt nhựa macroporous D101 35

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 37

4.1 Bàn luận về phương pháp nghiên cứu 37

4.1.1 Phương pháp chiết và xử lý dịch chiết 37

4.1.2 Bàn luận về phương pháp tinh chế saponin trong rễ Ngưu tất 37

4.2 Bàn luận về kết quả 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

PHỤ LỤC 7

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.8

(a) Hình ảnh sắc ký của dịch rửa giải ethanol 50% theo thứ tự

ở BV thứ 6 và 7 từ trái qua phải, (b) Hình ảnh sắc ký của dịch

rửa giải ethanol 70% theo thứ tự ở BV thứ 1, 2 và 3 từ trái

qua phải, (c) Hình ảnh sắc ký của dịch rửa giải ethanol 96%

34

3.10 Hình (a), (b) thứ tự là hình ảnh cao trước và sau tinh chế 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngưu tất là một trong những dược liệu có vai trò quan trọng trong y học cổ truyền Trung Quốc [20], di thực vào nước ta từ năm 1960 Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhóm saponin trong Ngưu tất có nhiều tác dụng sinh học đáng quý như: chống viêm [7] [22], hạ cholesterol máu [4] [7] [25],

hạ huyết áp [2] [7], kháng khuẩn [10], tăng cường miễn dịch, hạ đường huyết [36], đã và đang được ứng dụng rộng rãi tạo ra nhiều sản phẩm đáp ứng nhu cầu trong nước

Sử dụng dung môi hữu cơ n-buthanol [44] để tinh chế saponin trong cao Ngưu tất là phương pháp đang được áp dụng nhưng đồng thời đó cũng là vấn đề độc hại đối với sức khoẻ con người và môi trường Hiện nay có rất nhiều công nghệ khác được ứng dụng trong lĩnh vực chiết phân lập và tinh chế sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên Trong đó sử dụng hạt nhựa macroporous đã thu hút nhiều sự quan tâm vì tính chất hấp phụ và các ưu điểm bao gồm: loại bỏ được lượng lớn tạp chất, chi phí vận hành thấp, tiêu thụ dung môi ít hơn và lượng dư hóa chất không mong muốn trong sản phẩm thấp [16]

macroporous trong làm giàu saponin từ rễ Ngưu tất (Achyranthes bidebtata

Blume)” với mục tiêu:

nhựa macroporous D101

được cao có hàm lượng saponin cao

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Achyranthes bidentata Blume

1.1.1 Về thực vật

1.1.1.1 Vị trí phân loại của Ngưu tất

Theo hệ thống phân loại thực vật có hoa của Takhtajan công bố năm 2009

thì Ngưu tất có tên khoa học là Achyranthes bidentata Blume có vị trí phân loại

hoặc nâu tím và cành thường mọc

hướng lên gần như thẳng đứng Lá

mọc đối, hình bầu dục hoặc hình móc,

dài 5- 10 cm, rộng 1- 4 cm, gốc thuôn

hẹp, đầu rất nhọn, hai mặt nhẵn, mép

nguyên đôi khi uốn lượn, gân lá mặt

trên màu nâu tía, gân phụ 5- 7 cặp,

Hình 1.1 Achyranthes bidentata [2]

cuống lá dài 1- 3 cm có lông [3] [4] [6] [20]

hoa thường gập xuống, sát vào cụm hoa lá bắc hình trứng dài 3 mm [20], lá bắc con có gai dài 0,25- 0,3 cm [20] lá đài 5, gần bằng nhau, nhị 5, chỉ nhị dính với nhau và dính với cả nhị lép, nhị lép có răng rất nhỏ, bao phấn hình mặt chim, bầu hình trứng [2] [3] [7]

Quả nang hình bầu dục, có 1 hạt [3] [4] [6]

Mùa hoa quả: tháng 5- 7 [6]

Cây dùng thay thế: ở Việt Nam, các thầy thuốc y học cổ truyền và nhân

dân ở nhiều nơi đã dùng rễ cây Cỏ xước (Achyranthes aspera L.) để thay thế

Ngưu tất với tên gọi là Ngưu tất nam [2]

1.1.1.3 Phân bố, sinh thái

Ngưu tất được di thực từ Trung Quốc vào Việt Nam năm 1960 Ban đầu cây được trồng để thuần hóa ở Sa Pa, sau đó chuyển sang Sìn Hồ (Lai Châu) rồi

về trại thuốc Tam Đảo (Vĩnh Phúc) và Văn Điền (Hà Nội) Cách đây khoảng

30 năm, cây đã được trồng dưới dạng sản xuất dược liệu ở vùng ngoại thành

Hà Nội và các tỉnh thuộc đồng bằng Bắc Bộ [7]

Có thể coi Ngưu tất là một ví dụ điển hình về một cây thuốc có nguồn gốc ôn đới, qua quá trình nghiên cứu di thực đã có thể trồng thành công ở cả vùng đồng bằng có khí hậu nhiệt đới gió mùa Điều đó cho thấy Ngưu tất là cây có biên độ sinh thái tương đối rộng Mặc dù thời vụ trồng chủ yếu vẫn ở thời kì có nhiệt độ thấp trong năm [7]

tự nhiên hạt [7]

1.1.1.4 Bộ phận dùng

Bộ phận dùng là rễ (Radix Achyranthes bidentatae) [3] [4]

Rễ thu hái khi phần trên mặt đất tàn lụi vào tháng 1- 2 ở vùng núi hoặc tháng 3- 4 ở đồng bằng Loại bỏ rễ con, rửa sạch rồi phơi hay sấy khô Rễ to, dài, dẻo là loại tốt Có thể dùng ở dạng sống (thường dùng cách này), hoặc tẩm rượu hoặc muối tùy theo trường hợp rồi phơi hay sấy khô [4]

1.1.2 Thành phần hóa học

Các nghiên cứu chỉ ra rằng saponin, phytoecdysteroid và polysacharid

là 3 nhóm thành phần hóa học chính được phân lập từ rễ Ngưu tất [20]

1.1.2.1 Saponin

Saponin là một nhóm các glycosid có phần genin có cấu trúc triperten hay steroid 27 carbon Với saponin triterpenoid cấu trúc phần genin có 30 carbon cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen nối với nhau theo quy tắc đầu đuôi [4]

Saponin là thành phần quan trọng trong rễ Ngưu tất, có khoảng 38 saponin đã được phân lập và saponin triterpenoid là hoạt chất chính Trong

đó, saponin toàn phần tính theo hàm axit oleanolic là 0,78%-1,42% [17] (hình 1.2) Hiện nay các nhà khoa học đã phân lập và xác định cấu trúc một số saponin được trình bày chi tiết ở bảng dưới

Hình 1.2 Axit oleanolic

Bảng 1.1 Trình bày một số saponin oleanolic phân lập từ rễ Ngưu tất [20]

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của β-ecdysterone (I), inokosterone (II),

rubrosterone (III) lần lượt từ trái sang phải

1.1.2.3 Polysacharid

Nhóm Polysaccharid chế từ rễ Ngưu tất được công nhận trên nhiều nghiên cứu là có hoạt tính tăng cường miễn dịch [18] [19] [36] Trong một nghiên cứu, polysacharid trong rễ Ngưu tất được phân tích cấu tạo bao gồm fructose và glucose với tỷ lệ mol là 8:1 [9] Một số tác giả tìm ra được một polysacharid tan trong nước bao gồm 6 glucose và 3 mannose [20] Hàm lượng polysacharid là 5,68 mg/ 1 gam dược liệu [20]

1.1.3 Tác dụng sinh học

trong nghiên cứu và có nhiều ứng dụng trong chữa bệnh:

- Tác dụng chống viêm [7] [22]: trong mô hình viêm cấp, dịch chiết

ethanol Ngưu tất ức chế phù khoảng 63.52% và 79.73% sau 3 giờ với liều 375

và 500 mg/kg đối với nhóm thử (p< 0.001) so với đối chứng [30]

- Tác dụng hạ cholesterol máu [4] [25]: năm 2014 Sang Deog Oh

cùng với cộng sự đã nghiên cứu được ảnh hưởng của dịch chiết nước Ngưu tất ức chế tế bào mỡ 3T3-L1 làm giảm trọng lượng cơ thể và triglycerid đáng

kể so với nhóm chứng [25]

- Tác dụng hạ huyết áp [2] [7] [41]: saponin trong Ngưu tất không chỉ

ngăn cản co mà còn có tác dụng giãn trực tiếp cơ trơn mạch máu dẫn đến hạ huyết áp [41]

- Tác dụng kháng khuẩn: các loại dịch chiết đều nhạy cảm với

Proteus, Escherichia coli, Bacillus subtilin, Samonella typhy; nhạy cảm trung

bình và kém với Staphylococcus aureus và Pseudomonas [10]

- Tác dụng trên xương [13] [39]: nghiên cứu về tác động của dịch

chiết Ngưu tất trên bệnh loãng xương sau mãn kinh cho thấy sau 16 tuần điều trị ngăn ngừa mất khối lượng xương do thay đổi tỷ lệ tái tạo xương [39]

- Tác dụng nuôi dưỡng thần kinh [11] [42]: tác dụng của dịch chiết

nước Ngưu tất về phục hồi dây thần kinh bị nghiền nát ở thỏ cho thấy dịch chiết đẩy nhanh sự tái tạo dây thần kinh ngoại vi phụ thuộc liều [11]

- Tác dụng điều hòa miễn dịch [8] [18] [38]: nghiên cứu năm 2009

[8] tiến hành tìm hiểu ảnh hưởng polysaccharide Ngưu tất tới hoạt động của các tế bào miễn dịch Kết quả cho thấy các tế bào lympho hoạt động mạnh hơn ở lợn con bổ sung polysacharide, cũng như nồng độ huyết thanh IgG,

- Tác dụng hạ đường huyết: nghiên cứu năm 2009 cho thấy, AbpS có

tác dụng chống oxy hóa và giảm đường huyết của chuột bị tiểu đường rõ ràng hơn Abp, có thể là do tác dụng chống oxy hóa của nó [36]

1.2 Tổng quan về phương pháp tinh chế

1.2.1 Phương pháp chiết pha rắn (SPE)

1.2.1.1 Khái niệm

đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nước hoặc dung môi hữu cơ), chất để hấp phụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và xốp) gọi là pha rắn [5]

1.2.1.2 Nguyên tắc và cơ chế của SPE

Pha rắn là hạt nhỏ và xốp được nhồi vào cột sắc ký Khi đổ pha lỏng lên pha rắn trong cột sắc ký, pha tĩnh (pha rắn) sẽ tương tác với các chất và giữ lại một số nhóm chất trên cột, còn các nhóm khác sẽ đi ra khỏi cột Sau

đó dùng dung môi thích hợp để rửa giải và thu sản phẩm [5]

Pha rắn: thường là các hạt silica gel xốp trung tính, hạt oxit nhôm, silica gel trung tính đã được ankyl hóa nhóm –OH bằng các gốc hydrocarbon

loại nhựa hoặc than hoạt tính… Pha lỏng là pha chứa hợp chất nghiên cứu [5]

- Pha đảo bao gồm pha động phân cực hoặc phân cực trung bình và pha tĩnh không phân cực Lực giữ các hợp chất hữu cơ từ pha lỏng phân cực (ví

dụ như nước) lên pha tĩnh chủ yếu là do lực liên kết giữa cacbon- hydro của hợp chất đó và các nhóm chức năng của pha tĩnh Lực liên kết giữa 2 chất không phân cực này thường được gọi là lực Van der Waals hoặc lực phân tán

Dung môi phân cực trung bình không phân cực có thể phá vỡ liên kết giữa pha tĩnh và chất hoặc nhóm chất được hấp phụ lên Pha tĩnh thường sử dụng

là silica liên kết với alkyl hoặc aryl

- Pha thường gồm pha động phân cực, hoặc phân cực trung bình đến không phân cực (ví dụ aceton, hexan) và một pha tĩnh phân cực Lực giữ một chất là

do lực tương tác giữa các nhóm chất phân cực trên chất đó và nhóm chức trên pha tĩnh: gồm liên kết hydro, tương tác л- л Dung môi phá vỡ lực này thường là một dung môi có độ phân cực cao Pha tĩnh thường là silica đính các chuỗi alkyl ngắn với các nhóm chức phân cực được liên kết trên bề mặt

- SPE trao đổi ion sử dụng cho các hợp chất anion có thể được phân lập trên bề mặt silica gắn nhóm amin bậc bốn Các hợp chất cation được phân lập bằng cách sử dụng silica gắn các nhóm axit sulfonic Cơ chế chính giữ hợp chất lên bề mặt chủ yếu dựa vào sự thu hút tĩnh điện của hai nhóm chức tích

1.2.1.3 Ứng dụng

hữu cơ: tách và làm giàu dư lượng thuốc trừ sâu, các chất hoạt động bề mặt, các hydrocacbon thơm mạch vòng khó phân hủy… trong các mẫu nước [5]

rộng rãi để làm giàu và tách các ion kim loại trong môi trường bằng phương pháp trao đổi ion, chiết các hợp phức kim loại với thuốc thử hữu cơ, ứng dụng các loại nhựa vòng càng [5]

phân tích mẫu trong các lĩnh vực y học, khoa học và công nghệ thực phẩm… Đây là kỹ thuật đang có tiềm năng rất lớn trong việc phân tích và phân lập các sản phẩm tự nhiên [33]

1.2.2 Tổng quan về hạt nhựa macroporous

1.2.2.1 Định nghĩa và phân loại

Hạt macroporous là hạt polymer hình cầu, màu trắng, cấu trúc xốp với

các lỗ xốp tương đối rộng (đường kính lỗ xốp >50 Å) [16] có thể cho phân tử

lớn đi qua, hấp phụ nhờ lực liên kết tĩnh điện, liên kết hydro hoặc tạo phức

Bảng 1.2: Đặc tính vật lý một số loại hạt nhựa macroporous [33]

Diện tích bề mặt (m 2 /g)

Độ ẩm (%)

đến 1 μm Tuy nhiên gần đây, do nhận được nhiều sự chú ý nên các vật liệu

có kích thước lỗ xốp từ 1 μm dến 100 μm và lớn hơn nữa cũng đã được sản

xuất Có thể gọi đó là các polyme supermacroporous [23]

1.2.2.2 Đặc điểm hạt nhựa macroporous

nhựa là: tổng diện tích bề mặt (trong và ngoài), đường kính lỗ xốp và độ phân

kính lỗ xốp khoảng từ 100 đến 300 Å, độ phân cực thì rải đều từ không phân cực, phân cực yếu, trung bình và mạnh tùy theo monomer sử dụng trong hoặc

xử lý sau quá trình polymer hóa [15] [16] [27]

của hạt nhựa, cấu trúc được kiểm soát dựa vào thành phần các chất hóa học sử dụng trong hỗn hợp đem đi polymer hóa (ngoài các monomer thì để tạo ra các

lỗ xốp còn thêm các chất gọi là porogen trộn lẫn với hỗn hợp monomer, không hòa tan được polymer, có khả năng bay hơi ở nhiệt độ nhất định sau khi kết thúc polymer hóa để lại những lỗ hổng trong cấu trúc polymer) [16]

1.2.2.3 Tổng quan về hạt nhựa macroporous D101

Trọng lượng riêng bão hòa 1,00- 1,07 g/ml

Trọng lượng biểu kiến bão hòa 0,67- 0,73 g/ml

1.2.2.3.2 Cơ chế hấp phụ saponin của hạt nhựa D101

Hạt nhựa D101 bản chất là polymer styren divinylbenzen không phân cực, tạo liên kết Van der Waals với saponin có phần sapogenin không phân cực trong dịch chiết của Ngưu tất đã qua xử lý nên có khả năng hấp phụ saponin [16]

Hơn nữa, các lỗ xốp trong hạt nhựa làm tăng diện tích tiếp xúc dẫn đến tăng hiệu quả hấp phụ của hạt nhựa, tỷ lệ giữa đường kính lỗ xốp của hạt nhựa macroporous với đường kính phân tử hấp phụ là trong khoảng 2 đến 6 Nếu đường kính quá nhỏ thì chất hấp phụ đi vào trong lỗ xốp rất khó, còn quá lớn thì chất hấp phụ dễ dàng đi qua lỗ và làm giảm diện tích bề mặt hấp phụ Đường kính của glycosid ước tính ít nhất là 1 nm, tùy thuộc vào loại và nhiều nhóm chức được gắn vào khung của chúng Trong thực tế các phân tử thường lớn hơn đáng kể, đối với glycosid một số nhóm đường thường được gắn vào phân tử, đường kính phân tử có thể được ước tính khoảng 2,0 nm [16] D101 đường kính lỗ xốp trung bình 9-10 nm, gấp khoảng 5 lần so với đường kính glycosid nên thích hợp cho việc sử dụng để tinh chế các glycosid

1.2.2.3.3 Ứng dụng trong tách chiết saponin

dụng rất rộng rãi trong chiết xuất, phân lập và tinh chế các chất có nguồn gốc

tự nhiên flavonoid, saponin, tách kim loại,… [28] Trong đó saponin là nhóm chất có nhiều nghiên cứu (khoảng 30 bài báo) sử dụng hạt nhựa D101 với mục đích tinh chế, phân lập

Năm 2013, Liu Z và cộng sự đã tinh chế saponin steroid từ thân rễ

của Paris Polyphylla var yunnanensis để chọn loại hạt nhựa phù hợp nhất

nhằm thiết lập một phương pháp đơn giản, bảy loại hạt nhựa macroporous đã được lựa chọn để khảo sát hấp phụ và giải hấp phụ Kết quả hạt nhựa D101

steroid Saponin steroid toàn phần trong sản phẩm tăng 4,83 lần với hàm

lượng thu hồi lên tới 85.47% [21]

Hấp phụ và giải hấp phụ flavonoid và saponin toàn phần của

Astragalus trên các hạt nhựa macroporous khác nhau bao gồm D101, AB-8,

XAD-1, HP-20, SP8-25, LSA-40, LX-18, XDA-5 và ADS-7 được so sánh Theo kết quả, XDA-5, D101 và AB-8 khả năng hấp phụ, giải hấp phụ

và tốc độ hấp phụ cao hơn flavonoid và saponin các loại hạt nhựa khác [34]

Một nghiên cứu khác sử dụng hạt nhựa macroporous D101 để làm sạch

gypenosid từ dịch chiết thô Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino

Theo điều kiện tối ưu được xác định như sau: nồng độ mẫu 6 mg/mL và giải hấp phụ với dung dịch ethanol 50% , kết quả hàm lượng saponin thu được đạt 92,76% [14]

Tinh chế saponin toàn phần từ Gynostemma bằng cách chiết nước nóng

và sau đó tinh chế bằng hấp phụ lên hạt nhựa D101 Sau tinh chế bằng hạt nhựa D101 kết quả cho thấy hàm lượng saponin toàn phần tăng từ 26,2% lên 83% [12]

Năm 2006, Xu Xianxiang, Xia Lunzhu thiết lập một phương pháp tách

và tinh chế saponin toàn phần từ Radix clematidis: chiết xuất với 70% ethanol

và sau đó được tinh sạch bằng hạt nhựa D101 Sau khi rửa với nước cất và ethanol các nồng độ 30%, 50% và 70% thì so sánh bằng các chỉ số: tốc độ rửa giải và tỷ lệ rửa giải Kết quả saponin toàn phần được giải hấp phụ với ethanol 50% Tỷ lệ rửa giải là 71,26% và khả năng hấp phụ là 53,36 mg/g [35]

1.2.2.4.4 Ứng dụng hạt nhựa trong nghiên cứu Ngưu tất

Cho đến nay, ứng dụng hạt nhựa macroporous trong nghiên cứu Ngưu tất đã được chú ý rất nhiều, trong đó nhựa macropopous D101 đã được sử dụng trong một số nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc của một số chất trong Ngưu tất khi kết hợp với những phương pháp khác

Năm 2007, với mục tiêu phân lập các thành phần từ Ngưu tất và làm sáng tỏ cấu trúc của chúng Zhao Wan-ting và cộng sử đã sử dụng hạt nhựa

C-NMR để xác định cấu trúc Kết quả cho 5 hợp chất đã được xác định là:

stachysteron A, podecdyson C, β-ecdysteron, 25-(R)-inokosteron, 25-(S)–

inokosteron [40]

Qiu-Hong Wang và cộng sự đã xác định được cấu trúc 3 hợp chất phytoecdysteroid mới, có tên niuxixinsteron A, B và C Các cấu trúc đã được

xác định là 2β,3β,14α,25-tetrahydroxy-5β-ergost-7-en-6-one, (20R,22R)-20-O,22-O-(5′- hydroxymethyl)-furfuryliden-2β,3β,25-trihydroxy-14β-methyl-18-nor-5β- cholesta-7,12-dien-6-one và (20R,22R,25R)-20-O,22-O-(5′-hydroxymethyl)- furfuryliden-2β,3β,5β,14α,26-pentahydroxycholest-7-en-6-one) bằng chứng

(20R,22R,24S)-20-O,22-O-(5′-hydroxymethyl)-furfuryliden-quang phổ Dịch chiết ban đầu được xử lý và phân lập bằng hạt nhựa macroporous D101 và sắc ký cột silica gel [32]

Tiếp theo đó công bố năm 2012 đã thu được 2 glycosid tyramin

feruloyl và 7 saponin triterpenoid đã thu được, chúng xác định là feruloyl-3-methoxytyramin-4′-O-β-D-glucopyranosid, N-trans-feruloyl-3- methoxytyra min-4-O-β-D-glucopyranosid, PJS-1, chikusetsusaponin IVa, oleanolic acid 3-O-[β-D-glucuronopy ranosid-6-O-methyl ester]-28-O-β-D- glucopyranosid (5), oleanolic acid 3-O-[β-D-glucuronopyran-osid-6-O-

3-O-[β-D-glucuronopyranosid-6-O-butyl ester]-28-O-β-D-glucopyranosid, ginsenosid

trên được phân lập và tinh chế bằng hạt nhựa D101, silica gel và sắc ký điều chế HPLC sử dụng cột ODS Cấu trúc của chúng đã được làm sáng tỏ trên cơ

sở phân tích 1D và 2D- NMR [37]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, nguyên liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu

Rễ Ngưu tất đã được xông sinh nguồn gốc ở Thái Bình đạt tiêu chuẩn hàm lượng saponin trong dược liệu khô >1% theo Dược điển Hong Kong

Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Ngưu tất

Hạt nhựa D101 nguồn gốc từ Trung Quốc được mua của công ty Anhui sanxing resin technology

Hình 2.2 Hình ảnh hạt nhựa macroporous D101

2.1.2 Hoá chất, thiết bị, dụng cụ

2.1.2.1 Hoá chất

Bảng 2.1 Tên hoá chất và nguồn gốc

TT Tên hóa chất Tiêu chuẩn, nguồn gốc

2.1.2.2 Dụng cụ

- Cột thuỷ tinh (đường kính trong: 1,5 cm; 2 cm; 2,5 cm; 4 cm )

- Pipet pasteur; pipet 1 ml, 5 ml, 10 ml

- Phễu thuỷ tinh

- Máy cất quay Daihan scientific (Hàn Quốc)

- Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thuỵ Sỹ)

- Cân phân tích Wisd (Đức)

- Máy đo quang Shimadzu

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Hệ thống lọc hút Buchner

- Máy siêu âm Daihan scientific (Hàn Quốc)

- Bể điều nhiệt

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu cách xử lý hạt nhựa ban đầu

2.2.2 Nghiên cứu quá trình hấp phụ saponin từ dịch chiết lên hạt nhựa macroporous D101

- Khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột

- Xác định dung lượng hấp phụ của hạt nhựa

2.2.3 Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ saponin từ hạt nhựa macroporous D101

- Khảo sát dung môi rửa giải

- Khảo sát thể tích rửa giải

2.2.4 Đề xuất và ổn định quy trình trình làm giàu saponin ứng dụng hạt nhựa macroporous D101

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1.Phương pháp định tính, định lượng

2.3.1.1 Phương pháp thuỷ phân

- Dịch được thuỷ phân trong môi trường axit HCl 10% với tỷ lệ dịch thuỷ phân: axit là 2:1 (v:v)

2.3.1.2 Phương pháp định tính

Phương pháp: sắc ký lớp mỏng với các điều kiện như sau:

- Lựa chọn điều kiện pha động: cloroform: methanol (20:1) (v:v)

- Pha tĩnh: bản mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merck)

- Mẫu thử: dịch được thuỷ phân như mục 2.3.1.1 và lấy phần tủa đem hoà với 1ml ethanol tuyêt đối

- Chất đối chiếu: axit oleanolic

- Thuốc thử hiện màu: bản mỏng được nhúng thuốc thử vanlin/ axit sulphuric (pha theo DĐVN IV), sau đó sấy ở 100˚C và quan sát dưới ánh sáng thường Saponin cho vết màu tím trên bản mỏng

2.3.1.3 Phương pháp định lượng

Định lượng bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 550 nm theo quy trình sau:

- Chuẩn bị mẫu trắng:

+ Lấy chính xác 1ml methanol cho vào ống nghiệm và cô đến cắn rồi

phút sau đó định mức 10 ml bằng axit acetic

- Chuẩn bị mẫu cần định lượng:

+ Hút chính xác vào ống nghiệm 2 ml dịch cần định lượng đem pha loãng với 2 ml nước cất rồi tiến hành thuỷ phân như đã nêu ở mục 2.3.1.1 Sau thuỷ phân, lọc lấy tủa hoà tan bằng methanol rồi định mức 10 ml bằng

methanol và lắc đều

+ Lấy chính xác 1 ml dịch này cho vào ống nghiệm cô thành cắn rồi hoà

phút Sau đó định mức 10 ml bằng axit acetic Lắc đều và đem đi đo quang

 Nồng độ saponin trong mẫu được tính toán như sau:

Từ phương trình tuyến tính giữa giá trị mật độ quang đo được và nồng độ axit oleanolic có dạng: A= aC+ b

1000 aTrong đó:

C%: nồng độ saponin trong mẫu (mg/ml)

A: mật độ quang đo được của mẫu

a, b: các hệ số của phương trình đường chuẩn

2.3.2 Phương pháp chiết

Dược liệu sau khi được rửa sạch và cắt nhỏ đem chiết hồi lưu với ethanol 50% với tỷ lệ dược liệu: dung môi (kl:v) là 1: 8

Lọc dịch chiết, bỏ phần bã Gộp dịch chiết ethanol 50% của 3 lần

2.3.3 Phương pháp xử lý dịch chiết

- Dịch chiết ethanol 50% thu được đem cô quay dưới áp suất giảm đến cao đặc

- Hoà cao vào nước (tỷ lệ nước: dịch chiết ethanol là 1:1)

- Lọc dịch nước bằng phễu lọc Buchner được dịch trong đem chạy cột

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu xử lý hạt nhựa ban đầu

1 g hạt nhựa có thể hấp phụ được Cách xử lý ban đầu ảnh hưởng rất lớn đến thông số dung lượng hấp phụ của hạt Tham khảo từ các tài liệu và thông tin

từ nhà sản xuất, xử lý hạt nhựa ban đầu có thể dùng các dung dịch a cid, ba zơ

và chủ yếu bằng ethanol tuyệt đối Mục tiêu: xác định quá trình xử lý ban đầu

để loại hết tạp bám trên hạt nhựa trong quá trình sản xuất và hạt sau xử lý cho