Đang tải... (xem toàn văn)
Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba cây lương thực chủ yếu trên thế giới(lúa mì,lúa gạo,ngô),có tầm quan trọng sống còn với hơn nửa dân số thế giới
Đề cương thực tập tốt nghiệpĐề tài: “ Nghiên c u ng d ng ch th phân t ứ ứ ụ ỉ ị ửDNA đ ch n l c gen tms2 t o ra các ể ọ ọ ạdòng TGMS m i”ớNg i h ng d n : 1.PGS.TS.Phan H u Tônườ ướ ẫ ữ 2.KS.T ng Văn H iố ả B môn : Công ngh sinh h c ng ộ ệ ọ ứd ngụ Khoa CNSHTr ng ĐHNNHà N iườ ộNg i th c hi n : SV.Nguy n Th H ng H nhườ ự ệ ễ ị ồ ạL p :0602 CNSH ớ PHầN I :Mở ĐầU1.1.Đ t v n đặ ấ ề: Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba cây lương thực chủ yếu trên thế giới(lúa mì,lúa gạo,ngô),có tầm quan trọng sống còn với hơn nửa dân số thế giới.Hiện nay với sự gia tăng dân số nhanh và sự giảm dần diện tích đất nông nghiệp đặc biệt là đất canh tác lúa mỗi năm thì vấn đề đảm bảo an ninh lương thực là yêu cầu cấp thiết cần quan tâm trước mắt cũng như lâu dài.Do đó,để tăng năng suất lúa gạo,một trong những hướng đặt ra có hiệu quả cao đó là sử dụng ưu thế lai. Các giống lúa lai hiện nay cho có thể cho năng suất cao hơn 2030% so với các giống lúa thường.Hiện nay,chúng ta đang sử dụng hai hệ thống:hệ thống lúa lai hai dòng và hệ thống lúa lai ba dòng.Nhưng lúa lai hai dòng vượt trội hơn hẳn như:cơ hội chọn tạo các dòng bố lớn thuận lợi cho việc cải tạo chất lượng gạo,không có hiệu ứng đồng tế bào chất nên ít bị sâu hại hơn,năng suất cao hơn lúa lai ba dòng từ 510%,chỉ cần hai dòng khác nhau về bản chất di truyền(một là dòng TGMS hoặc PGMS,hai là dòng cho phấn) nên giá thành giảm,tính trạng bất dục đực mẫn cảm với điều kiện môi trường(EGMS) chủ yếu do một cặp gen lặn điều khiển thuận lợi cho việc tạo giống mới. Để chọn tạo lúa lai hai dòng thành công thì dòng TGMS phải nhiều và phong phú,từ đó mới tạo ra được tổ hợp cho ưu thế lai cao.Hiện nay các dòng TGMS đang được sử dụng như:103S,T1S96,64S,287S,36S2,Kim 76S,Pair 64S và 25S.Các nhà khoa học đã tìm được 6 gen TGMS(tms1, tms2, tms3, tms4, tms5, tms6).Mỗi gen này có ngưỡng chuyển hóa hữu dục và bất dục khác nhau,trong đó,gen tms2 có ngưỡng chuyển hóa hữu dục ổn định.Nhà chọn tạo giống đã sử dụng các gen TGMS này lai chuyển vào các dòng,giống lúa triển vọng để tạo dòng TGMS tốt,có khả năng phối hợp cao,tạo ra nhiều tổ hợp lai mới cho ưu thế lai cao như TH33,Việt Lai 20,TH34,… Bằng việc sử dụng ADN marker(chỉ thị phân tử) thời gian chọn tạo ra các dòng mới được rút ngắn.Các chỉ thị liên kết chặt với các tính trạng kiểu hình.Do đó,chúng ta có thể xác định được các tính trạng dựa trên sự có mặt của các gen mong muốn.Kỹ thuật này không chỉ có độ chính xác cao mà còn xác định được trên một lượng lớn vật liệu nghiên cứu. Để đáp ứng được mục tiêu chọn giống chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc gen tms2 để tạo ra các dòng TGMS mới”. 1.2.M c đích và yêu c uụ ầ :1.2.1.M c đíchụ :Xác định gen tms2 trong tập đoàn các dòng TGMS bằng chỉ thị phân tử.Nghiên cứu di truyền gen tms2. 1.2.2 Yêu c uầ : Khảo sát một số đặc điểm nông sinh học của các tổ hợp lai F1Chiết tách AND để tiến hành phản ứng PCRĐánh giá được khả năng hữu – bất dục bằng phương pháp truyền thống của các tổ hợp lai F2.Phát hiện gen tms2 ở các dòng TGMS và thế hệ F2 . PHầN II : TổNG QUAN TÀI LIệU2.1. Hi n t ng u th lai ệ ượ ư ế2.2. H th ng lúa lai hai dòngệ ố Khái niệm hệ thống lúa lai hai dòng Ưu điểm của hệ thống lúa lai hai dòng Các phương pháp chọn tạo dòng mẹ lúa lai hai dòng(EGMS). + Phương pháp truyền thống + Chỉ thị phân tử và ứng dụng 2.3. Tình hình nghiên c u và ng d ng ch th phân ứ ứ ụ ỉ ịt trong ch n t o lúa lai hai dòng ử ọ ạ Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới Tình hình nghiên cứu và ứng dụng ở Việt Nam PHầN III : VậT LIệU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CứU3.1. Đ i t ng , v t li u , đ a đi m và th i gian nghiên ố ượ ậ ệ ị ể ờc u ứ 3.1.1. Đ i t ng nghiên c u ố ượ ứ Gồm một số tổ hợp lai F1 , quần thể F2 3.1.2. V t li u nghiên c u ậ ệ ứ * Thí nghi m trong phòng:ệThi t bế ị :+ Máy PCR , máy chạy điện di , máy chụp ảnh điện di , máy li tâm , máy votex , tủ lạnh , lò vi sóng . + Các loại ống effendof , các loại pipet và đầu tiếp đi kèm . Thành phần cho phản ứng PCR + Cặp mồi phát hiện gen bất dục đực tms2 theo M.T.Lopez và cộng sự (2003)có trình tự là : RM11_F:5’TCTCCTCTTCCCCCGATC3’ RM11_R:5’ATAGCGGGCGAGCTTAG3’Hóa ch t ch y PCR :ấ ạ dNTD , MgCl2 , Taq ADN polymerase , PCR mastermix , nước cất Hóa ch t dùng đ chi t tách ADN h gen :ấ ể ế ệ Thành ph nầ N ng đ dung ồ ộd ch mị ẹN ng đ dung ồ ộd ch làm vi cị ệH n h p 10ml ỗ ợdung d ch chi t ị ếtáchTrisHCl(pH=8) 1M 50mM 0,5mlEDTA(pH=8) 0,5M 0,25mM 0,5mlSDS 10% 1% 1,0mlNaCl 5M 300mM 0,6mlH2O 7,4mlThành phần dung dịch đệm chiết tách Ngoài ra còn có : •Hỗn hợp Phenol : Chlorofom : Isoamylalcohol ( 25:24:1 )•Ethanol 70%•Đá lạnh•Dung dịch đệm TE Thành ph nầ N ng d dung ồ ộd ch mị ẹN ng đ dung ồ ộd ch làm vi cị ệH n h p 50ml ỗ ợdung d ch TE ịlàm vi cệTrisHCl(pH=8) 1M 10mM 0,5mlEDTA(pH=8) 0,5M 1mM 0,1mlH2O 49,4mlThành phần dung dịch đệm TE•Hóa chất dùng cho chạy điện di trên Gel agarose : Agarose 1% , Ethidium Bromide 10mg/ml, loading Bufer(Bromo phenol blue , Xylen cyanol , Saccarose )* Thí nghiệm ngoài đồng ruộng:•Gồm 1 vài tổ hợp lai F1 giữa dòng mẹ TGMS là 103S với các dòng bố khác •Cọc tre, nilon, thước. [...]... Bằng việc sử dụng ADN marker (chỉ thị phân tử) thời gian chọn tạo ra các dịng mới được rút ngắn .Các chỉ thị liên kết chặt với các tính trạng kiểu hình.Do đó,chúng ta có thể xác định được các tính trạng dựa trên sự có mặt của các gen mong muốn.Kỹ thuật này khơng chỉ có độ chính xác cao mà cịn xác định được trên một lượng lớn vật liệu nghiên cứu. Để đáp ứng được mục tiêu chọn giống chúng tơi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc gen tms2 để tạo ra các dịng TGMS mới . Để chọn tạo lúa lai hai dịng thành cơng thì dịng TGMS phải nhiều và phong phú,từ đó mới tạo ra được tổ hợp cho ưu thế lai cao.Hiện nay các dịng TGMS đang được sử dụng như:103S,T1S96,64S,287S,36S 2 ,Kim 76S,Pair 64S và 25S. Các nhà khoa học đã tìm được 6 gen TGMS( tms1, tms2, tms3, tms4, tms5, tms6).Mỗi gen này có ngưỡng chuyển hóa hữu dục và bất dục khác nhau,trong đó ,gen tms2 có ngưỡng chuyển hóa hữu dục ổn định.Nhà chọn tạo giống đã sử dụng các gen TGMS này lai chuyển vào các dịng,giống lúa triển vọng để tạo dịng TGMS tốt,có khả năng phối hợp cao ,tạo ra nhiều tổ hợp lai mới cho ưu thế lai cao như TH33,Việt Lai 20,TH34,… ... Bằng việc sử dụng ADN marker (chỉ thị phân tử) thời gian chọn tạo ra các dịng mới được rút ngắn .Các chỉ thị liên kết chặt với các tính trạng kiểu hình.Do đó,chúng ta có thể xác định được các tính trạng dựa trên sự có mặt của các gen mong muốn.Kỹ thuật này khơng chỉ có độ chính xác cao mà cịn xác định được trên một lượng lớn vật liệu nghiên cứu. Để đáp ứng được mục tiêu chọn giống chúng tơi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc gen tms2 để tạo ra các dịng TGMS mới . ... : 1.2.1.M c đíchụ : Xác định gen tms2 trong tập đồn các dịng TGMS bằng chỉ thị phân tử. Nghiên cứu di truyền gen tms2. 1.2.2 u c uầ : Khảo sát một số đặc điểm nơng sinh học của các tổ hợp lai F 1 Chiết tách AND để tiến hành phản ứng PCR Đánh giá được khả năng hữu – bất dục bằng phương pháp truyền thống của các tổ hợp lai F 2 . Phát hiện gen tms2 ở các dịng TGMS và thế hệ F 2 . Đề cương... ố Khái niệm hệ thống lúa lai hai dịng Ưu điểm của hệ thống lúa lai hai dịng Các phương pháp chọn tạo dịng mẹ lúa lai hai dịng(EGMS). + Phương pháp truyền thống + Chỉ thị phân tử và ứng dụng 2.3. Tình hình nghiên c u và ng d ng ch th phân ứ ứ ụ ỉ ị t trong ch n t o lúa lai hai dòng ử ọ ạ Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới Tình hình nghiên cứu và ứng dụng ở Việt Nam Step Nhi t đ (ệ ộ o C) Th i gian(phút)ờ 1... Để chọn tạo lúa lai hai dịng thành cơng thì dịng TGMS phải nhiều và phong phú,từ đó mới tạo ra được tổ hợp cho ưu thế lai cao.Hiện nay các dịng TGMS đang được sử dụng như:103S,T1S96,64S,287S,36S 2 ,Kim 76S,Pair 64S và 25S. Các nhà khoa học đã tìm được 6 gen TGMS( tms1, tms2, tms3, tms4, tms5, tms6).Mỗi gen này có ngưỡng chuyển hóa hữu dục và bất dục khác nhau,trong đó ,gen tms2 có ngưỡng chuyển hóa hữu dục ổn định.Nhà chọn tạo giống đã sử dụng các gen TGMS này lai chuyển vào các dịng,giống lúa triển vọng để tạo dịng TGMS tốt,có khả năng phối hợp cao ,tạo ra nhiều tổ hợp lai mới cho ưu thế lai cao như TH33,Việt Lai 20,TH34,… ... : Khảo sát một số đặc điểm nơng sinh học của các tổ hợp lai F 1 Chiết tách AND để tiến hành phản ứng PCR Đánh giá được khả năng hữu – bất dục bằng phương pháp truyền thống của các tổ hợp lai F 2 . Phát hiện gen tms2 ở các dịng TGMS và thế hệ F 2 . Đề cương thực tập tốt nghiệp Đề tài: “ Nghiên c u ng d ng ch th phân t ứ ứ ụ ỉ ị ử DNA đ ch n l c gen tms2 t o ra các ể ọ ọ ạ dòng TGMS m i”ớ Ng i h ng d n : 1.PGS.TS.Phan H u Tônườ ướ ẫ ữ 2.KS.T ng Văn H iố ả B môn : Công ngh sinh h... 2 Chạy với 35 chu kỳ từ bước 2 Kết thúc 72 7 Bảo quản 4 Tùy theo Chu trình nhi t PCR cho c p m i tms2 ặ ồ Chạy điện di phát hiện sản phẩm PCR trên gel agarose 1 % 3.2.2. Ph ng pháp nghiên c u ươ ứ * Xác đ nh kh năng ch a gen b t d c đ c m n c m v i ị ả ứ ấ ụ ự ẫ ả ớ nhi t đ tms2 b ng ph ng pháp PCRệ ộ ằ ươ : +) Chiết tách ADN tổng số của dịng mẹ TGMS ,các tổ hợp phân ly F 2 theo quy trình cải tiến của Bộ mơn Cơng nghệ sinh học. Bước 1:Thu ngắt mẫu lá khỏe,dài khoảng 2cm bỏ vào ống eppendorf có dung tích 1,5ml,đánh dấu tên giống rồi bỏ vào đá lạnh. Bước 2:Cối,chày sứ dùng để nghiền mẫu đã được hấp khử trùng và đặt trong đá lạnh .Các mẫu lá được cắt nhỏ khoảng 0,5cm rồi bỏ vào cối. Bước 3:Nhỏ 400 µl dung dịch đệm chiết suất ADN vào cối rồi nghiền nhỏ mẫu lá cho đến khi dung dịch chuyển sang màu xanh đen. Bước 4:Bổ sung thêm 400 µl dung dịch chiết suất AND vào pha trộn lẫn sau đó hút 400 µl vào ống eppendorf đã được đánh dấu. Bước 5: Cho 700 µl hỗn hợp Phenol : Chlorofom : Isoamylalcohol ( 25:24:1 ) ... phenol blue , Xylen cyanol , Saccarose ) * Thí nghiệm ngồi đồng ruộng: • Gồm 1 vài tổ hợp lai F 1 giữa dịng mẹ TGMS là 103S với các dịng bố khác • Cọc tre, nilon, thước. 3.2. N i dung và ph ng pháp nghiên c u ộ ươ ứ * N i dung nghiên c u ộ ứ +) Theo dõi đ c đi m nơng sinh h cặ ể ọ : Các ch tiêu nơng sinh h cỉ ọ : + Thời gian từ cấy đến bắt đầu trổ(10% số bơng thốt khỏi lá địng). + Thời gian trổ từ khi bắt đầu trỗ(10% số bơng thốt khỏi lá địng) đến khi kết thúc trổ (85% thốt khỏi lá địng) . + Thời gian tự cấy đến chín(85% số hạt chắc màu vàng) + Tổng thời gian sinh trưởng từ gieo đến khi thu hoạch . + Chiều cao cây (cm) cuối cùng : đo từ mặt đất đến mút đầu bơng dài nhất khơng kể râu . + Chiều dài lá địng : đo từ gối lá đến đầu mút lá , đo vào giai đoạn chín sáp. + Chiều rộng lá địng. + Góc độ lá địng . + Chiều dài bơng : đo từ cổ bơng đến hết bơng vào thời kì chín chắc . ... ể tích(Microlit 1 Nước cất vơ trùng 12,5 2 PCR buffer 1X 2,0 3 dNTPs 0,2mM 0,4 4 PrimerF 10pmol 1,0 5 PrimerR 10pmol 1,0 6 MgCl 2 2,5mM 1,0 7 ADN Taqpolymerase 0,25 unit/Mcrolit 0,1 8 ADN nguyên bản 50ng/microlit 1,0 Thành phần cho phản ứng PCR Ch tiêu các y u t c u thành năng su t:ỉ ế ổ ấ ấ + Tổng số nhánh(số nhánh max) + Số nhánh hữu hiệu /khóm : đến tồn bộ số nhánh trổ thành bơng . + Tổng số hạt/bơng. + Số hạt chắc/bơng + Khối lượng 1000 hạt . + Số bơng hữu hiệu/khóm: đến tồn bộ số bơng có từ 10 hạt chắc trở lên + Năng suất lý thuyết được tính theo cơng thức : NSLT = A x B x C x m... : +) Chiết tách ADN tổng số của dịng mẹ TGMS ,các tổ hợp phân ly F 2 theo quy trình cải tiến của Bộ mơn Cơng nghệ sinh học. Bước 1:Thu ngắt mẫu lá khỏe,dài khoảng 2cm bỏ vào ống eppendorf có dung tích 1,5ml,đánh dấu tên giống rồi bỏ vào đá lạnh. Bước 2:Cối,chày sứ dùng để nghiền mẫu đã được hấp khử trùng và đặt trong đá lạnh .Các mẫu lá được cắt nhỏ khoảng 0,5cm rồi bỏ vào cối. Bước 3:Nhỏ 400 µl dung dịch đệm chiết suất ADN vào cối rồi nghiền nhỏ mẫu lá cho đến khi dung dịch chuyển sang màu xanh đen. Bước 4:Bổ sung thêm 400 µl dung dịch chiết suất AND vào pha trộn lẫn sau đó hút 400 µl vào ống eppendorf đã được đánh dấu. Bước 5: Cho 700 µl hỗn hợp Phenol : Chlorofom : Isoamylalcohol ( 25:24:1 ) . ề: Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba cây lương thực chủ yếu trên thế giới(lúa mì,lúa gạo,ngô),có tầm quan trọng sống còn với hơn nửa dân số thế giới.Hiện nay với sự gia tăng dân số nhanh và sự giảm dần diện tích đất nông nghiệp đặc biệt là đất canh tác lúa mỗi năm thì vấn đề đảm bảo an ninh lương thực là yêu cầu cấp thiết cần quan tâm trước mắt cũng như lâu dài.Do đó ,để tăng năng suất lúa gạo,một trong những hướng đặt ra có hiệu quả cao đó là sử dụng ưu thế lai. Các giống lúa lai hiện nay cho có thể cho năng suất cao hơn 2030% so với các giống lúa thường.Hiện nay,chúng ta đang sử dụng hai hệ thống:hệ thống lúa lai hai dòng và hệ thống lúa lai ba dòng. Nhưng lúa lai hai dòng vượt trội hơn hẳn như:cơ hội chọn tạo các dòng bố lớn thuận lợi cho việc cải tạo chất lượng gạo,không có hiệu ứng đồng tế bào chất nên ít bị sâu hại hơn,năng suất cao hơn lúa lai ba dòng từ 510% ,chỉ cần hai dòng khác nhau về bản chất di truyền(một là dòng TGMS hoặc PGMS,hai là dòng cho phấn) nên giá thành giảm,tính trạng bất dục đực mẫn cảm với điều kiện môi trường(EGMS) chủ yếu do một cặp gen lặn điều khiển thuận lợi cho việc tạo giống mới. Để chọn tạo lúa lai hai dòng thành công thì dòng TGMS phải nhiều và phong phú,từ đó mới tạo ra được tổ hợp cho ưu thế lai cao.Hiện nay các dòng TGMS đang được sử dụng như:103S,T1S96,64S,287S,36S2,Kim 76S,Pair 64S và 25S. Các nhà khoa học đã tìm được 6 gen TGMS( tms1, tms2, tms3, tms4, tms5, tms6).Mỗi gen này có ngưỡng chuyển hóa hữu dục và bất dục khác nhau,trong đó ,gen tms2 có ngưỡng chuyển hóa hữu dục ổn định.Nhà chọn tạo giống đã sử dụng các gen TGMS này lai chuyển vào các dòng, giống lúa triển vọng để tạo dòng TGMS tốt,có khả năng phối hợp cao ,tạo ra nhiều tổ hợp lai mới cho ưu thế lai cao như TH33,Việt Lai 20,TH34,… Bằng việc sử dụng ADN marker (chỉ thị phân tử) thời gian chọn tạo ra các dòng mới được rút ngắn .Các chỉ thị liên kết chặt với các tính trạng kiểu hình.Do đó,chúng ta có thể xác định được các tính trạng dựa trên sự có mặt của các gen mong muốn.Kỹ thuật này không chỉ có độ chính xác cao mà còn xác định được trên một lượng lớn vật liệu nghiên cứu. Để đáp ứng được mục tiêu chọn giống chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc gen tms2 để tạo ra các dòng TGMS mới . 1.2.M. ề: Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba cây lương thực chủ yếu trên thế giới(lúa mì,lúa gạo,ngô),có tầm quan trọng sống còn với hơn nửa dân số thế giới.Hiện nay với sự gia tăng dân số nhanh và sự giảm dần diện tích đất nông nghiệp đặc biệt là đất canh tác lúa mỗi năm thì vấn đề đảm bảo an ninh lương thực là yêu cầu cấp thiết cần quan tâm trước mắt cũng như lâu dài.Do đó ,để tăng năng suất lúa gạo,một trong những hướng đặt ra có hiệu quả cao đó là sử dụng ưu thế lai. Các giống lúa lai hiện nay cho có thể cho năng suất cao hơn 2030% so với các giống lúa thường.Hiện nay,chúng ta đang sử dụng hai hệ thống:hệ thống lúa lai hai dòng và hệ thống lúa lai ba dòng. Nhưng lúa lai hai dòng vượt trội hơn hẳn như:cơ hội chọn tạo các dòng bố lớn thuận lợi cho việc cải tạo chất lượng gạo,không có hiệu ứng đồng tế bào chất nên ít bị sâu hại hơn,năng suất cao hơn lúa lai ba dòng từ 510% ,chỉ cần hai dòng khác nhau về bản chất di truyền(một là dòng TGMS hoặc PGMS,hai là dòng cho phấn) nên giá thành giảm,tính trạng bất dục đực mẫn cảm với điều kiện môi trường(EGMS) chủ yếu do một cặp gen lặn điều khiển thuận lợi cho việc tạo giống mới. Để chọn tạo lúa lai hai dòng thành công thì dòng TGMS phải nhiều và phong phú,từ đó mới tạo ra được tổ hợp cho ưu thế lai cao.Hiện nay các dòng TGMS đang được sử dụng như:103S,T1S96,64S,287S,36S2,Kim 76S,Pair 64S và 25S. Các nhà khoa học đã tìm được 6 gen TGMS( tms1, tms2, tms3, tms4, tms5, tms6).Mỗi gen này có ngưỡng chuyển hóa hữu dục và bất dục khác nhau,trong đó ,gen tms2 có ngưỡng chuyển hóa hữu dục ổn định.Nhà chọn tạo giống đã sử dụng các gen TGMS này lai chuyển vào các dòng, giống lúa triển vọng để tạo dòng TGMS tốt,có khả năng phối hợp cao ,tạo ra nhiều tổ hợp lai mới cho ưu thế lai cao như TH33,Việt Lai 20,TH34,… Bằng việc sử dụng ADN marker (chỉ thị phân tử) thời gian chọn tạo ra các dòng mới được rút ngắn .Các chỉ thị liên kết chặt với các tính trạng kiểu hình.Do đó,chúng ta có thể xác định được các tính trạng dựa trên sự có mặt của các gen mong muốn.Kỹ thuật này không chỉ có độ chính xác cao mà còn xác định được trên một lượng lớn vật liệu nghiên cứu. Để đáp ứng được mục tiêu chọn giống chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc gen tms2 để tạo ra các dòng TGMS mới . 1.2.M