Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA để chọn lọc gen tms2 tạo ra các dòng TGMS mới
Đề cương thực tập tốt nghiệp Đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng thị phân tử DNA để chọn lọc gen tms2 tạo dòng TGMS mới” Người hướng dẫn : 1.PGS.TS.Phan Hữu Tôn 2.KS.Tống Văn Hải Bộ môn : Công nghệ sinh học ứng dụng Khoa CNSH-Trường ĐHNN-Hà Nội Người thực : SV.Nguyễn Thị Hồng Hạnh Lớp :06-02 CNSH PHầN I :Mở ĐầU 1.1.Đặt vấn đề: Cây lúa (Oryza sativa L.) ba lương thực chủ yếu giới(lúa mì,lúa gạo,ngơ),có tầm quan trọng sống với nửa dân số giới.Hiện với gia tăng dân số nhanh giảm dần diện tích đất nơng nghiệp đặc biệt đất canh tác lúa năm vấn đề đảm bảo an ninh lương thực yêu cầu cấp thiết cần quan tâm trước mắt lâu dài.Do đó,để tăng suất lúa gạo,một hướng đặt có hiệu cao sử dụng ưu lai Các giống lúa lai cho cho suất cao 20-30% so với giống lúa thường.Hiện nay,chúng ta sử dụng hai hệ thống:hệ thống lúa lai hai dòng hệ thống lúa lai ba dòng.Nhưng lúa lai hai dòng vượt trội hẳn như:cơ hội chọn tạo dòng bố lớn thuận lợi cho việc cải tạo chất lượng gạo,không có hiệu ứng đồng tế bào chất nên bị sâu hại hơn,năng suất cao lúa lai ba dòng từ 5-10%,chỉ cần hai dòng khác chất di truyền(một dòng TGMS PGMS,hai dòng cho phấn) nên giá thành giảm,tính trạng bất dục đực mẫn cảm với điều kiện môi trường(EGMS) chủ yếu cặp gen lặn điều khiển thuận lợi cho việc tạo giống Để chọn tạo lúa lai hai dịng thành cơng dịng TGMS phải nhiều phong phú,từ tạo tổ hợp cho ưu lai cao.Hiện dòng TGMS sử dụng như:103S,T1S-96,64S,287S,36S2,Kim 76S,Pair 64S 25S Các nhà khoa học tìm gen TGMS(tms1, tms2, tms3, tms4, tms5, tms6).Mỗi gen có ngưỡng chuyển hóa hữu dục bất dục khác nhau,trong đó,gen tms2 có ngưỡng chuyển hóa hữu dục ổn định.Nhà chọn tạo giống sử dụng gen TGMS lai chuyển vào dòng,giống lúa triển vọng để tạo dịng TGMS tốt,có khả phối hợp cao,tạo nhiều tổ hợp lai cho ưu lai cao TH3-3,Việt Lai 20,TH3-4,… Bằng việc sử dụng ADN marker(chỉ thị phân tử) thời gian chọn tạo dòng rút ngắn.Các thị liên kết chặt với tính trạng kiểu hình.Do đó,chúng ta xác định tính trạng dựa có mặt gen mong muốn.Kỹ thuật khơng có độ xác cao mà cịn xác định lượng lớn vật liệu nghiên cứu Để đáp ứng mục tiêu chọn giống tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng thị phân tử DNA chọn lọc gen tms2 để tạo dịng TGMS mới” 1.2.Mục đích u cầu: 1.2.1.Mục đích: -Xác định gen tms2 tập đồn dịng TGMS thị phân tử -Nghiên cứu di truyền gen tms2 1.2.2 Yêu cầu : -Khảo sát số đặc điểm nông sinh học tổ hợp lai F1 -Chiết tách AND để tiến hành phản ứng PCR -Đánh giá khả hữu – bất dục phương pháp truyền thống tổ hợp lai F2 -Phát gen tms2 dòng TGMS hệ F2 PHầN II : TổNG QUAN TÀI LIệU 2.1 Hiện tượng ưu lai 2.2 Hệ thống lúa lai hai dòng - Khái niệm hệ thống lúa lai hai dòng - Ưu điểm hệ thống lúa lai hai dòng - Các phương pháp chọn tạo dòng mẹ lúa lai hai dòng(EGMS) + Phương pháp truyền thống + Chỉ thị phân tử ứng dụng 2.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng thị phân tử chọn tạo lúa lai hai dòng - Tình hình nghiên cứu ứng dụng giới - Tình hình nghiên cứu ứng dụng Việt Nam PHầN III : VậT LIệU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CứU 3.1 Đối tượng , vật liệu , địa điểm thời gian nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Gồm số tổ hợp lai F1 , quần thể F2 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu * Thí nghiệm phòng: Thiết bị :+ Máy PCR , máy chạy điện di , máy chụp ảnh điện di , máy li tâm , máy votex , tủ lạnh , lị vi sóng + Các loại ống effendof , loại pipet đầu tiếp kèm Thành phần cho phản ứng PCR + Cặp mồi phát gen bất dục đực tms2 theo M.T.Lopez cộng (2003)có trình tự : RM11_F:5’-TCTCCTCTTCCCCCGATC-3’ RM11_R:5’-ATAGCGGGCGAGCTTAG-3’ Hóa chất chạy PCR : dNTD , MgCl , Taq ADN polymerase , PCR mastermix , nước cất Hóa chất dùng để chiết tách ADN hệ gen : Thành phần dung dịch đệm chiết tách Thành phần Nồng độ dung dịch mẹ Nồng độ dung Hỗn hợp 10ml dịch làm việc dung dịch chiết Tris-HCl(pH=8) 1M 50mM tách 0,5ml EDTA(pH=8) 0,5M 0,25mM 0,5ml SDS 10% 1% 1,0ml NaCl 5M 300mM 0,6ml H2O Ngồi cịn có : •Hỗn hợp Phenol : Chlorofom : Isoamylalcohol ( 25:24:1 ) •Ethanol 70% •Đá lạnh •Dung dịch đệm TE 7,4ml Thành phần dung dịch đệm TE Thành phần Nồng dộ dung dịch mẹ Nồng độ dung dịch làm việc Hỗn hợp 50ml dung dịch TE làm việc Tris-HCl(pH=8) 1M 10mM 0,5ml EDTA(pH=8) 0,5M 1mM 0,1ml H2O 49,4ml •Hóa chất dùng cho chạy điện di Gel agarose : Agarose 1% , Ethidium Bromide 10mg/ml, loading Bufer(Bromo phenol blue , Xylen cyanol , Saccarose ) * Thí nghiệm ngồi đồng ruộng: •Gồm vài tổ hợp lai F1 dòng mẹ TGMS 103S với dịng bố khác •Cọc tre, nilon, thước 3.1.3 Địa điểm nghiên cứu:tại phịng cơng nghệ sinh học ứng dụng khu thí nghiệm đồng ruộng khoa nơng học – Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội 3.1.4 Thời gian nghiên cứu : Đề tài thực từ tháng 1/2010 đến tháng 5/2010 3.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu * Nội dung nghiên cứu +) Theo dõi đặc điểm nông sinh học : Các tiêu nông sinh học : + Thời gian từ cấy đến bắt đầu trổ(10% số bơng khỏi đòng) + Thời gian trổ từ bắt đầu trỗ(10% số bơng khỏi địng) đến kết thúc trổ (85% khỏi địng) + Thời gian tự cấy đến chín(85% số hạt màu vàng) + Tổng thời gian sinh trưởng từ gieo đến thu hoạch + Chiều cao (cm) cuối : đo từ mặt đất đến mút đầu dài khơng kể râu + Chiều dài địng : đo từ gối đến đầu mút , đo vào giai đoạn chín sáp + Chiều rộng địng + Góc độ địng + Chiều dài bơng : đo từ cổ đến hết vào thời kì chín Chỉ tiêu yếu tổ cấu thành suất: + Tổng số nhánh(số nhánh max) + Số nhánh hữu hiệu /khóm : đến tồn số nhánh trổ thành + Tổng số hạt/bông + Số hạt chắc/bông + Khối lượng 1000 hạt + Số bơng hữu hiệu/khóm: đến tồn số bơng có từ 10 hạt trở lên + Năng suất lý thuyết tính theo cơng thức : NSLT = A x B x C x mật độ/đơn vị diện tích(g) Trong đó: A: số bơng hữu hiệu/khóm B: số hạt chắc/bông C: khối lượng 1000 hạt Ưu lai tổ hợp lai so với bố mẹ : Ưu lai trung bình F1 MP 100% H(MP%) = MP MP (mit parent) giá trị trung bình hai bố mẹ ƯTL trung bình biểu hẳn tính trạng lai F1 so với giá trị trung bình dó hai bố mẹ F1 BP 100% Ưu lai thực H(BP%) = BP BP(best parent) bố mẹ tốt Ưu lại thực biểu hẳnn tính trạng lai F1 so với giá trị bố mẹ tốt Nghiên cứu thị phân tử nhằm xác định gen tms2 có dịng TGMS , tổ hợp F2 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu * Xác định khả chứa gen bất dục đực mẫn cảm với nhiệt độ tms2 phương pháp PCR : +) Chiết tách ADN tổng số dòng mẹ TGMS,các tổ hợp phân ly F2 theo quy trình cải tiến Bộ môn Công nghệ sinh học Bước 1:Thu ngắt mẫu khỏe,dài khoảng 2cm bỏ vào ống eppendorf có dung tích 1,5ml,đánh dấu tên giống bỏ vào đá lạnh Bước 2:Cối,chày sứ dùng để nghiền mẫu hấp khử trùng đặt đá lạnh.Các mẫu cắt nhỏ khoảng 0,5cm bỏ vào cối Bước 3:Nhỏ 400 µl dung dịch đệm chiết suất ADN vào cối nghiền nhỏ mẫu dung dịch chuyển sang màu xanh đen Bước 4:Bổ sung thêm 400 µl dung dịch chiết suất AND vào pha trộn lẫn sau hút 400 µl vào ống eppendorf đánh dấu Bước 5: Cho 700 µl hỗn hợp Phenol : Chlorofom : Isoamylalcohol ( 25:24:1 ) Bước 6:Cho 600 µl hỗn hợp Chlorofom : Isoamylalcohol(24:1),lắc va ly tâm phút với tốc độ 13000 vòng/phút hút phần dung dịch vào ống eppendorf đánh dấu tương ứng Bước 7: Cho 800 µl Ethanol(96%)(hoặc 600 µl Isopropanol),trộn ly tâm phút với tốc độ 13000 vòng/phút.Sau đổ phần dung dịch phía giữ lại phần kết tủa đáy ống nghiệm Bước 8: Rửa kết tủa Ethanol 70%,làm khô tự nhiên nhiệt độ phòng cách úp ngược ống nghiệm lên giấy thấm Bước 9:Hịa tan kết tủa 50 µl dung dịch TE bảo quản nhiệt độ -20oC +Kiểm tra độ tinh ADN cáchđiện di gel agarose 1% +Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi RM11 cho gen tms2 Thành phần cho phản ứng PCR STT Thành phần Nồng độ dung dịch làm Nước cất vô trùng PCR buffer 1X 2,0 dNTPs 0,2mM 0,4 Primer-F 10pmol 1,0 Primer-R 10pmol 1,0 MgCl2 2,5mM 1,0 ADN Taqpolymerase 0,25 unit/Mcrolit 0,1 ADN nguyên 50ng/microlit 1,0 việc Thể tích(Microlit 12,5 Chu trình nhiệt PCR cho cặp mồi tms2 Step Nhiệt độ(oC) Thời gian(phút) 95 94 58 72 Chạy với 35 chu kỳ từ bước Kết thúc 72 Bảo quản Tùy theo Chạy điện di phát sản phẩm PCR gel agarose % *Nghiên cứu ưu lai tổ hợp lai F1 so với bố +Bố trí thí nghiệm: -Thí nghiệm bố trí theo phương pháp khảo sát tập đoàn,các lai F1 trồng cạnh bố tương ứng.Các tổ hợp lai bố trí khơng nhắc lại -Ơ thí nghiệm bố trí theo hình chữ nhật,mỗi 5m2 +Các biện pháp kỹ thuật: -Làm đất cày bừa -Thời vụ: Vụ chiêm xuân 2010 -Ngày gieo mạ :01/2010 -Ngày cấy: 02/2010 -Cấy dảnh/khóm,cây x 11cm,hàng x hàng 20cm -Mật đọ cấy 45 khóm/m2 -Lượng phân bón cho ha: Phân đạm 120 kg Phân lân 90kg Phân kali 60kg +Kỹ thuật bón phân: -Bón lót:100%lân + 30%đạm,bón sau bừa -Bón thúc lần 1:50% phân đạm +40% phân kali,bón vào thời kì bắt đầu đẻ nhánh -Bón thúc lần 2:bón hết số đạm,kali cịn lại,bón lúa làm đòng PHầN IV:Dự KIếN Kế HOạCH VÀ KếT QUả ĐạT ĐƯợC 4.1.Kế hoạch: -01/2010,viết đề cương bảo vệ đề cương -Gieo mạ:06/01/2010 -Cấy: 10/02/2010 -Từ 21/02/2010 khảo sát đặc điểm nông sinh học,tiến hành phản ứng PCR viết báo cáo tốt nghiệp 4.2.Kết quả: -Phát tổ hợp chứa gen tms2 -Tìm marker-PCR liên quan đến tính trạng nghiên cứu ... nghiên cứu Để đáp ứng mục tiêu chọn giống tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu ứng dụng thị phân tử DNA chọn lọc gen tms2 để tạo dòng TGMS mới? ?? 1.2.Mục đích yêu cầu: 1.2.1.Mục đích: -Xác định gen tms2. .. pháp chọn tạo dòng mẹ lúa lai hai dòng( EGMS) + Phương pháp truyền thống + Chỉ thị phân tử ứng dụng 2.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng thị phân tử chọn tạo lúa lai hai dịng - Tình hình nghiên cứu ứng. .. dòng, giống lúa triển vọng để tạo dịng TGMS tốt,có khả phối hợp cao ,tạo nhiều tổ hợp lai cho ưu lai cao TH3-3,Việt Lai 20,TH3-4,… Bằng việc sử dụng ADN marker (chỉ thị phân tử) thời gian chọn tạo