Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau

Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 MỞ ĐẦU Nhân ngày Sức khỏe Thế giới 7/4/2011, tổ chức Y tế Thế giới WHO đưa chủ đề “Chống kháng kháng sinh: không hành động hôm nay, không thuốc chữa mai sau” nhằm thức tỉnh cộng đồng vấn đề vi sinh vật kháng thuốc đe dọa toàn cầu Chống kháng kháng sinh vấn đề mới, trở nên cấp bách, đòi hỏi nỗ lực tổng hợp giúp nhân loại tránh nguy quay trở lại thời kỳ chưa có kháng sinh Cho đến nay, giải pháp đưa nhằm hạn chế tình trạng kháng kháng sinh chưa phát huy tác dụng mong đợi Trong hướng phát triển loại kháng sinh tình trạng bế tắc, nhà khoa học tìm nguồn kháng sinh tự nhiên đầy tiềm năng, peptide kháng khuẩn (antimicrobial peptides, AMPs) Trong số peptide này, cecropin chủ yếu tách chiết từ côn trùng, có phổ kháng khuẩn rộng có nhiều tiềm ứng dụng nên thu hút nhiều quan tâm nhà khoa học Để sản xuất AMPs nói chung cecropin nói riêng, có ba đường tiếp cận (1) tách chiết từ tự nhiên (2) tổng hợp trực tiếp từ axit amin theo đường hóa học (3) biểu protein tái tổ hợp Tuy nhiên, với yêu cầu thu lượng lớn cecropin tinh khiết, hai phương pháp đầu có giá thành cao khó áp dụng điều kiện phòng thí nghiệm nước phát triển Việt Nam Vì vậy, với mong muốn giảm chi phí chủ động việc sản xuất cecropin phân lập từ côn trùng Việt Nam cho nghiên cứu tiếp theo, tiến hành đề tài “Tách dòng biểu cecropin hệ vector khác nhau” Đây hướng nghiên cứu Việt Nam hứa hẹn nhiều triển vọng Đề tài thực Phòng thí nghiệm Sinh Y Phòng Genomic, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 CHƯƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tình hình kháng kháng sinh 1.1.1 Thực trạng kháng kháng sinh Kháng kháng sinh tượng vi sinh vật (virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng) có khả vô hiệu hóa tác dụng thuốc kháng sinh mà trước chúng mẫn cảm [63, 79] Khi loại thuốc tác dụng điều trị, vi sinh vật gây bệnh tồn phát triển khiến bệnh lây lan nhanh cộng đồng thành dịch bệnh khó kiểm soát Đặc biệt nước nghèo nước phát triển phải đối mặt với hậu vô nghiêm trọng gánh nặng điều trị bệnh nhiễm khuẩn chi phí bắt buộc cho việc thay kháng sinh cũ kháng sinh đắt tiền Thực trạng kháng kháng sinh đã, vấn đề mang tính toàn cầu, thách thức toàn nhân loại Điều Tổng giám đốc WHO Margaret Chan nhận định nhân ngày Sức khỏe Thế giới 7/4/2011: “Một mối quan ngại hàng đầu việc chăm sóc sức khỏe y tế tình trạng bệnh kháng thuốc kháng sinh Đây nguy hàng đầu gây thách thức công tác chăm sóc y tế kiểm soát bệnh truyền nhiễm, đồng thời làm tăng chi phí chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng” Năm 1928 coi mốc quan trọng đánh dấu cho công tìm kiếm thuốc kháng sinh Alexander Fleming (1881-1955) phát penicillin [72, 75] Tuy nhiên, 60 năm sau phát gần 50 năm sau penicillin đưa vào sản xuất quy mô công nghiệp, giới xuất 95% chủng Staphylococcus aureus kháng lại penicillin 60% kháng lại dạng dẫn xuất methicillin [7] Ngày nay, vi khuẩn không kháng lại penicillin mà kháng nhiều loại kháng sinh khác trở thành mối đe dọa thực sức khoẻ nhân loại Theo thống kê năm 2006 WHO, vi khuẩn có tỷ lệ kháng kháng sinh cao Klebsiella (15.1%), E coli (13.3%), P aeruginosa (13.3%), Acinetobacter spp Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 (9.9%) S aureus (9.3%) Nhóm thuốc cephalosporin hệ thứ tư có tỷ lệ kháng cao đặc biệt từ 66-83%, nhóm kháng sinh aminosid fluoroquinolon có tỷ lệ kháng xấp xỉ 60% Báo cáo WHO cho biết, số quốc gia có bệnh lao kháng thuốc tăng từ 58 năm 2010 lên 69 năm 2011 Mỗi năm, giới có khoảng 440,000 ca nhiễm lao đa kháng thuốc, 150,000 ca tử vong loại vi khuẩn [79] Tính riêng nước thuộc liên minh châu Âu EU năm có khoảng 25,000 người chết loài vi khuẩn đa kháng thuốc [80] Các kháng sinh hệ đắt tiền, chí số kháng sinh thuộc nhóm “lựa chọn cuối cùng” dần hiệu lực [1] Bằng chứng lây lan chủng vi khuẩn kháng carbapenem (NDM-1) số nước châu Âu châu Á Loại “siêu vi khuẩn kháng thuốc” tiết enzyme NDM-1 kháng lại hầu hết loại thuốc kháng sinh, kể nhóm kháng sinh mạnh carbapenem [7, 79] Các nhà khoa học lo ngại “siêu vi khuẩn” lan khắp giới, đồng thời khẳng định tương lai gần chưa có loại thuốc có khả tiêu diệt Kháng kháng sinh không ảnh hưởng tới lĩnh vực y tế mà tác động sâu sắc đến kinh tế Theo ước tính WHO, Mỹ năm chi phí y tế cho thuốc điều trị nhiễm khuẩn xấp xỉ 20 tỉ $; với khối EU 1.5 tỉ € [80] Vì vậy, kháng kháng sinh trở thành vấn đề mang tính toàn cầu Hiện nay, tình hình kháng kháng sinh Việt Nam diễn biến phức tạp Theo báo cáo Bộ Y tế năm 2008 nhiễm khuẩn chiếm tỷ lệ tử vong cao thứ hai (16.7%) sau bệnh tim mạch (18.4%) Báo cáo kết nghiên cứu 19 bệnh viện Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh Hải Phòng hai năm (20092010) tình trạng kháng kháng sinh cho thấy, có chủng vi khuẩn kháng kháng sinh thường gặp Acinetobacter spp, Pseudomonas spp, E coli Klebsiella Hầu hết kháng sinh thông thường như: penicillin, tetracycline, streptomycine, … bị kháng Theo báo cáo “Phân tích thực trạng: sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh Việt Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Nam” nhóm nghiên cứu Quốc gia Việt Nam thuộc tổ chức hiệp hội kháng kháng sinh toàn cầu (GARP, Global Antibiotic Resistance Partnership) vào tháng 10 năm 2010 tình trạng kháng kháng sinh nước ta đáng báo động [1] Bằng chứng tỷ lệ chủng Streptococcus pneumoniae, nguyên nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp, kháng penicillin 71.4%, kháng erythromycin 92.1% Đây tỉ lệ kháng cao số 11 nước mạng lưới giám sát nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP) năm 2000-2001 Năm 2009 tỷ lệ chủng vi khuẩn Gram âm kháng với ceftazidime 42%, kháng với gentamicin 63% kháng với axit nalidixic 74% bệnh viện cộng đồng Xu hướng gia tăng tình trạng kháng kháng sinh thể rõ rệt Những năm 1990, thành phố Hồ Chí Minh, có 8% chủng pneumococcus kháng với penicillin Đến năm 1999-2000, tỉ lệ tăng lên 56% [1] Chính tình trạng kháng kháng sinh ngày có xu hướng tăng lên mà Việt Nam bị WHO xếp vào nhóm nước có tỷ lệ kháng kháng sinh cao giới (WHO, 2008) Thực trạng phức tạp không đặt cho ngành y tế Việt Nam nhiều thách thức mà đòi hỏi xã hội phải hành động để làm giảm bớt tình trạng kháng kháng sinh 1.1.2 Nguyên nhân giải pháp cho tình trạng kháng kháng sinh Để hiểu rõ nguyên tình trạng kháng kháng sinh, báo cáo WHO ngày sức khỏe giới 7/4/2011 tổng kết nguyên nhân dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh cao sau [79]: Thứ nhất, kháng thuốc tượng tiến hóa tự nhiên Khi vi sinh vật tiếp xúc với chất có khả tiêu diệt chúng, vi sinh vật “may mắn” sống sót tự tạo chế tự vệ tránh tác dụng chất Từ hệ vi sinh vật kháng thuốc hình thành Không thế, gen kháng thuốc Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 truyền ngang từ cá thể sang cá thể khác nên vi sinh vật kháng thuốc ngày nhiều Nguyên nhân quy luật tự nhiên nên khó có giải pháp ngăn chặn Tuy nhiên, nguyên nhân lại xuất phát chủ yếu từ phía người Đó là: sử dụng thuốc không hợp lý; chất lượng thuốc kém; công tác phòng ngừa, kiểm soát bệnh lây truyền yếu thiếu hệ thống giám sát Chính nguyên nhân thúc đẩy nguyên nhân diễn nhanh góp phần không nhỏ dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh Vì vậy, muốn tình trạng kháng kháng sinh giảm xuống phải có hành động tích cực ngày hôm Nguyên nhân cuối dẫn tới tình trạng kháng kháng sinh ngày trầm trọng công cụ chống lại kháng thuốc ngày cạn kiệt Các loại thuốc kháng sinh dần tác dụng Trong đó, phát triển loại kháng sinh hệ ngày thu hẹp Hình Lịch sử phát thuốc kháng sinh Nhìn vào Hình thấy hàng loạt thuốc kháng sinh tìm chủ yếu khoảng từ năm 1940 đến năm 1970 Có thể nói thời đại hoàng kim Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 thuốc kháng sinh Tuy nhiên, từ năm 1980 trở lại số lượng thuốc kháng sinh Điều đặt mối lo ngại có phải nguồn kháng sinh cạn kiệt? Thêm vào tình trạng kháng kháng sinh ngày gia tăng liệu hệ tương lai hưởng lợi ích mà kháng sinh mang lại? Đây mối băn khoăn đưa Ngày sức khỏe giới năm Một giải pháp nhằm đáp ứng nguồn kháng sinh khai thác peptide kháng khuẩn AMPs (antimicrobial peptides) [7, 79] Hàng loạt nghiên cứu thể sinh vật mang hệ thống peptide có khả kháng khuẩn [22, 30] Chúng có đầy đủ tiềm để trở thành nguồn nguyên liệu quý người khai thác “thời đại kháng kháng sinh” [28, 49] 1.2 Peptide kháng khuẩn (AMPs) 1.2.1 Giới thiệu chung AMPs Tất thể đa bào tiến hóa qua hàng triệu năm môi trường có nhiều loại vi sinh vật Mặc dù thường xuyên tiếp xúc với mầm bệnh qua đường khác nhiều loài sinh vật bảo vệ kháng thể tế bào miễn dịch [30, 57] Lý mà chúng tồn nhờ hệ miễn dịch bẩm sinh tạo hàng loạt AMPs tham gia đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu [20, 28] Một thực tế quan trọng mầm bệnh vi sinh vật dường không hình thành tính kháng với peptide Đây lý để nhà nghiên cứu hãng dược phẩm tin tưởng AMPs trở thành liệu pháp chữa bệnh thay cho loại thuốc kháng sinh dễ bị vi sinh vật gây bệnh kháng lại [22, 45, 70] Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 1.2.1.1 Hoạt tính sinh học AMPs AMPs có hoạt tính kháng lại vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, vi rút, nấm, kí sinh trùng [20, 28, 37, 48] Tùy thuộc vào loại AMPs mà có hoạt tính kháng mạnh hay yếu, phổ tác dụng rộng hay hẹp Ngoài ra, số loại AMPs có hoạt tính kháng viêm, diệt tế bào ung thư đảm nhiệm chức định hệ thống miễn dịch bẩm sinh hệ thống miễn dịch tiếp thu [28, 30] 1.2.1.2 Sự đa dạng AMPs AMPs tìm thấy nhiều mô quan khác tất giới, ngành sinh vật, từ prokaryote người [28, 60] Tuy nhiên, nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung phân tích AMPs có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn Đến có khoảng 800 loại AMPs khác tìm thấy sinh vật nhân chuẩn [37] Dựa vào mức độ tương đồng độ tích điện, trình tự, chức cấu trúc không gian, AMPs chia thành nhóm sau [4, 9]:  Nhóm peptide phân đoạn protein lớn hơn: Các peptide tạo protein lớn bị phân cắt enzyme Trong số peptide thuộc nhóm này, peptide quan tâm nhiều lactoferricin tạo lactoferrin (một protein có hoạt tính kháng khuẩn, tiết chủ yếu mô nhầy) bị phân cắt enzyme pepsin Các nghiên cứu cho thấy lactoferricin peptide có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng [62]  Nhóm peptide tích điện âm: Lần vào năm 1992, nhà khoa học phân lập peptide kích thước nhỏ (721.6 đến 823.8 Da) tích điện âm từ cừu có hoạt tính kháng lại Mannheimia haemolytica, Escherichia coli Klebsiella pneumoniae [8] Đến nhà nghiên cứu tìm nhiều loại peptide kháng khuẩn tích điện âm từ lưỡng cư (maximin H5), từ người (dermcidin) [9] Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011  Nhóm peptide tích điện dương: Đây nhóm peptide nghiên cứu nhóm lớn nhất, có mặt động vật lẫn thực vật phần lớn phân lập từ loài côn trùng [5] Một số loại peptide kháng khuẩn tích điện dương điển cecropin, andropin, moricin, ceratotoxin, melittin từ côn trùng hay magainin, dermaseptin, brevinin-1, esculentins, buforin II từ lưỡng cư [9] 1.2.1.3 Tiềm ứng dụng AMPs Cho đến nay, bên cạnh việc phát triển để thay dần loại kháng sinh bị kháng, AMPs hứa hẹn trở thành liệu pháp chữa trị ung thư đầy hiệu [42, 58, 64] Hơn nữa, gen mã cho AMPs nguồn gen quan trọng để tạo nên sinh vật chuyển gen có khả kháng lại mầm bệnh Thực tế cho thấy hàng loạt loại thực vật động vật chuyển gen mã cho AMPs tạo [27, 47] Riêng lĩnh vực phát triển thuốc kháng sinh hệ từ AMPs thu kết khả quan Rất nhiều loại AMPs hãng dược phẩm đưa vào sản xuất, thử nghiệm số loại thương mại hóa (Bảng 1) [22] Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Bảng Các loại AMPs tương tự AMPs sản xuất thương mại [22] Tên hãng sản xuất Tên thuốc Giai đoạn phát triển Sử dụng y học AM-Pharma (Phần Lan) hLF-1-11 (petide nhỏ có nguồn gốc từ lactoferrin người) Phase II Các nhiễm trùng liên quan đến cấy ghép tủy xương loài Ceragenix (Denver) CSA-13 (steroid tích điện dương bắt chước peptide thuộc hệ thống bảo vệ thể) Tiền thử nghiệm lâm sàng Chống nhiễm khuẩn Helix Biomedix (USA) HB-50 (peptide tổng hợp tự nhiên bắt chước cecropin) HB-107 (đoạn dài 19 axit amin cecropin B) Tiền thử nghiệm lâm sàng Chống nhiễm khuẩn Tiền thử nghiệm lâm sàng Chữa lành vết thương Inimex (Canada) IMX942 (peptide dài axit amin) Trong trình tối ưu hóa Điều chỉnh hệ miễn dịch; điều trị sốt giảm bạch cầu trung tính bệnh nhân hoá trị liệu Lytix Biopharma (Na Uy) Chưa công bố Phát minh Chống nhiễm khuẩn ung thư Novacta Biosystems Ltd (Anh) Mersaxitin (bacteriocin) Tiền thử nghiệm lâm sàng Kháng vi khuẩn Gram dương Novozymes A/S (Đan Mạch) Plectasin (defensin nấm) Tiền thử nghiệm lâm sàng Kháng loại vi khuẩn Gram dương, đặc biệt trường hợp nhiễm phế cầu khuẩn khuẩn liên cầu Pacgen (Canada) PAC113 (dựa đoạn hoạt động histatin 5protein tìm thấy nước bọt người) Được phê chuẩn loại thuốc nghiên cứu Thuốc uống điều trị chứng sưng tấy nấm lan âm đạo, ruột, miệng da Ngô Thị Hà K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 1.2.2 Peptide kháng khuẩn tích điện dương (CAMPs) cecropin 1.2.2.1 Giới thiệu chung CAMPs CAMPs định nghĩa peptide có từ 12-50 axit amin với điện tích +2 đến +9 có đuôi lysine arginine có tới 50% axit amin kỵ nước [11, 38] Trong số nhóm peptide kháng khuẩn trình bày nhóm quan tâm nhiều đặc điểm: (1) có mặt hầu hết loài sinh vật; (2) có phổ kháng khuẩn rộng; (3) vi sinh vật khó hình thành tính kháng (4) có mức độ đa dạng cao sinh vật Đặc điểm giúp CAMPs có tiềm phát triển thành loại thuốc khác [14, 28, 63] Đến nay, có khoảng 600 CAMPs phát từ vi sinh vật người [38] Từ năm 1990, hãng dược phẩm lớn giới Magainin Pharmaceuticals (Plymouth Meeting, PA), XOMA (Santa Monica, CA), Demegen (Durham, NC), IntraBiotics Pharmaceuticals (Mountain View, CA), … nhận thấy nhóm CAMPs mang nhiều triển vọng tập trung phát triển để sản xuất thành thuốc thương mại (Bảng 2) [7] Bảng Một số sản phẩm từ CAMPs công ty sản xuất phát triển phục vụ điều trị bệnh [7] Công ty sản xuất Sản phẩm Giai đoạn phát triển Magainin Pharmaceuticals (Plymouth Meeting, PA) Pexiganan, loại CAMPs có nguồn gốc Hoàn thành từ da ếch phase III Micrologix Biotech (Vancouver, BC, Canada) Đoạn 12 axit amin loại CAMPs loài động vật có vú có khả chống nhiễm khuẩn máu Phase II XOMA Corporation (Santa Monica, CA) CAMPs BPI dùng để kháng Neisseria meningitidis Phase III Dựa vào đặc điểm cấu trúc cuộn gấp, CAMPs phân thành lớp: lớp peptide dạng phiến gấp nếp  làm bền đến cầu disulfit (ví dụ , Ngô Thị Hà 10 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 -defensin, plectasin, protegrins); lớp peptide dạng xoắn  (ví dụ LL-37, cecropin, magainin); lớp peptide có cấu trúc giàu glycine, proline, tryptophan, arginine histidine (ví dụ indolicidin); lớp peptide dạng loop với cầu disulfide (ví dụ bactenecin) [22] 1.2.2.2 Peptide kháng khuẩn cecropin Cecropin peptide kháng khuẩn phân lập nghiên cứu cách đầy đủ [31, 45] Cecropin phân lập lần (năm 1981) từ loài bướm đêm Hyalophora cecropia sau bị nhiễm với vi khuẩn [55] Kể từ đó, người ta nhận thấy cecropin hay peptide tương tự cecropin tồn loài côn trùng khác, chủ yếu thuộc Bộ Cánh phấn Bộ Hai cánh [14, 55] Hàng loạt loại cecropin phân lập từ nhiều loài côn trùng vùng địa lý khác nghiên cứu chi tiết để có hiểu biết đầy đủ trước đưa vào ứng dụng thực tế 1.2.2.2.1 Các đặc trưng cấu trúc cecropin Kết so sánh trình tự axit amin cho thấy cecropin loài thuộc Bộ Hai cánh có độ tương đồng 70% Đặc biệt cecropin IA (sarcotoxin IA) loài nhặng xanh Sarcophaga peregrina có độ tương đồng đến 100% với cecropin A loài ruồi giấm Drosophila melanogaster Trong đó, cecropin loài thuộc Bộ Cánh phấn lại có trình tự tương đồng với [13] Trình tự axit amin số cecropin trình bày Bảng Ngô Thị Hà 11 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Bảng Trình tự axit amin số cecropin [13] Loài Trình tự axit amin Drosophila melanogaster Cecropin A GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR Sarcophaga peregrina Sarcotoxin IA GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR Aedes aegypti Cecropin A GGLKKLGKKLEGAGKRVFNAAEKALPVVAGAKALRK Aedes albopictus Cecropin A1 GGLKKLGKKLEGVGKRVFKASEKALPVAVGIKALGK Hyalophora cecropia Cecropin A KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK Bombyx mori Cecropin D GNFFKDLEKMGQRVRDAVISAAPAVDTLAKAKALGQ Các phân tích cho thấy cecropin sau tổng hợp thường có từ 62-64 axit amin Trong đó, 20-26 axit amin đầu tận amino không xuất phân tử cecropin trưởng thành Chúng đóng vai trò trình tự peptide dẫn Phân tử cecropin trưởng thành thường gồm khoảng 29-42 axit amin, không chứa cystein [5] Cấu trúc bậc hai điển hình cecropin xoắn α-helix (Hình 2) Đặc biệt, hầu hết phân tử cecropin mang tính lưỡng cực cho phép cecropin tương tác dễ dàng với màng tế bào [28] Phân tích cấu trúc cecropin A phương pháp khối phổ cộng hưởng từ cho thấy peptide có đầu N-terminal dài, dạng xoắn  lưỡng cực (từ vị trí đến 21) đuôi ngắn kị nước đầu xoắn C-terminal (từ vị trí 24 đến 37); hai vùng nối với thông qua khớp nối Gly-Pro [23] Hình ảnh cấu trúc không gian cecropin A minh họa Hình Ngô Thị Hà 12 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Khớp nối Gly-Pro Hình Cấu trúc cecropin A Hyalophora cecropia phân tích khối phổ cộng hưởng từ [23] 1.2.2.2.2 Đặc điểm bật cecropin Là peptide kháng khuẩn tích điện dương điển hình, cecropin mang nhiều đặc điểm bật hứa hẹn nhiều tiềm ứng dụng Cecropin có phổ hoạt tính kháng khuẩn rộng: Nhìn chung nhà nghiên cứu thống cecropin có phổ hoạt tính rộng bao gồm vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương, nấm, số virus kí sinh trùng [14, 26, 32, 36, 60, 61, 66] Trong đó, số loại AMPs khác có phổ hoạt tính hẹp ví dụ attacin diptericin có hoạt tính kháng lại vi khuẩn Gram âm hay drosomycin có hoạt tính kháng lại nấm [57] Đây đặc điểm mà nhà nghiên cứu hãng dược phẩm mong muốn thu từ sản phẩm Nhìn chung, hoạt tính kháng khuẩn cecropin vi khuẩn Gram âm thường hiệu so với vi khuẩn Gram dương [13] Cấu trúc phù hợp với hoạt tính kháng khuẩn: Các nghiên cứu đặc điểm thành phần axit amin, cấu trúc không gian, độ tích điện tính lưỡng cực cecropin có đặc điểm hoàn hảo cho hoạt tính kháng khuẩn Cụ thể là: Cecropin có cấu trúc lưỡng cực, dạng xoắn α-helix mà peptide có cấu trúc dạng thường có hoạt tính mạnh peptide có cấu trúc bậc không rõ ràng khác Mặt khác, cấu trúc dạng xoắn α-helix giúp peptide bền, bị tác động Ngô Thị Hà 13 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 làm ảnh hưởng đến hoạt tính [35] Thực nghiệm cho thấy nhờ cấu trúc mà cecropin giữ hoạt tính sau ủ 1000C tới 10 phút lâu [41] Không thế, có cấu trúc lưỡng cực nên cecropin có khả tan nước lớp màng lipit kép tốt Nhờ vậy, cecropin dễ dàng tương tác với thành phần ưa nước kị nước vi sinh vật [35] Cecropin peptide tích điện dương nên thường có hoạt tính kháng khuẩn cao hẳn so với peptide trung hòa khác [9, 39] Hơn nữa, peptide tích điện âm cần cofactor kẽm để hoạt động peptide tích điện dương cecropin không cần đến Đặc biệt, cecropin đảm nhiệm nhiều chức khác hệ miễn dịch bẩm sinh [4, 10] Do tích điện dương nên cecropin có khả cô lập cấu tử Lipopolysacharite (LPS) vi khuẩn Gram âm Chính cấu tử hoạt động nội độc tố gây tượng nhiễm trùng Ngoài nhờ tích điện dương, cecropin có tính hóa ứng động cao giúp thu hút tập trung tế bào trình diện kháng nguyên, nhờ làm thúc đẩy phản ứng hệ miễn dịch tiếp thu [19, 30, 70] Như vậy, hoạt tính kháng khuẩn, cecropin đóng vai trò quan trọng hệ thống miễn dịch bẩm sinh hệ thống miễn dịch tiếp thu Đích tác động cecropin làm vi sinh vật khó hình thành tính kháng: Khác với thuốc kháng sinh truyền thống, AMPs nói chung cecropin nói riêng có đích tác động chủ yếu cấu trúc màng tế bào vi sinh vật Chúng tuơng tác, phá vỡ cấu trúc màng, qua làm dung giải tế bào [12] Với đặc điểm thành phần axit amin, tính lưỡng cực, độ tích điện kích thước, cecropin tương tác với màng tế bào vi sinh vật theo bốn mô mô tả Hình [28] Ngô Thị Hà 14 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Hình Một số mô hình tương tác cecropin với màng tế bào vi sinh vật Trong hình, lớp kép lipit màng tế bào: màu vàng; peptide cecropin: hình trụ; vùng ưa nước cecropin: màu đỏ; vùng kị nước: màu xanh; A: mô hình “tập hợp”; B: mô hình “lỗ hình xuyến”; C: mô hình “thùng thủng lỗ”; D: mô hình “tấm thảm” [28] Trong mô hình “tập hợp” (A), phân tử cecropin tạo thành cầu qua màng tập hợp giống phức mixen peptide lipit Đối với mô hình “lỗ hình xuyến” (B), cecropin dạng xoắn chèn vào màng, lớp đơn lipit bị uốn cong liên tục làm cho vùng trung tâm chứa nước bị đầy peptide chèn vào đầu lipit Trong mô hình “thùng thủng lỗ” (C), cecropin xoắn hình thành bó màng với lỗ hổng giống thùng Với mô hình “tấm thảm” (D), cecropin tập hợp bề mặt lớp kép có xu hướng song song với bề mặt màng Do tích điện dương nên cecropin hấp dẫn nhóm phospholipit tích điện âm nhiều vị trí bao lấy màng tế bào theo kiểu trải thảm Ngô Thị Hà 15 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Trong nhiều thập kỷ, nhà khoa học tập trung nghiên cứu hoạt tính phá vỡ thành màng tế bào vi khuẩn cecropin A Năm 2003, nghiên cứu Hong cs thuộc trường đại học Y Pennsylvania rằng, liều lượng thấp cecropin A không đủ để giết tế bào vi khuẩn thông qua chế tác động màng, đủ để tác động đến phiên mã gen Trong số 26 gen chịu tác động có 11 gen mã cho protein mang chức quan trọng vi khuẩn [24] Vi khuẩn khả thay đổi máy di truyền chúng; điều giải thích vi khuẩn khó hình thành tính kháng lại với cecropin A Không thế, nghiên cứu Wachinger cs số loại cecropin tác động tới chu kì nhiễm bệnh virus HIV cách ức chế biểu gen HIV-1, qua làm ảnh hưởng tới trình nhân lên virus HIV [61] Vì vậy, đến nhà khoa học khẳng định màng tế bào đích tác động để cecropin giết vi sinh vật Cecropin tác động tới vi sinh vật cách thay đổi hình dạng vách ngăn màng tế bào chất, ức chế tổng hợp thành tế bào, ức chế tổng hợp axit nucleic, ức chế tổng hợp protein ức chế hoạt động enzyme minh họa Hình [28] Tái ADN Tổng hợp mARN Tổng hợp thành tế bào Tổng hợp protein Gấp nếp protein Các enzyme biến đổi aminoglycoside Hình Các đích tác động khác cecropin màng tế bào [28] Không gây hại đến tế bào thực vật, động vật người: Với nhiều tiềm phát triển thành liệu pháp chữa trị lí tưởng câu hỏi quan trọng Ngô Thị Hà 16 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 đặt liệu cecropin có gây độc tế bào nhân chuẩn không cách thức mà chúng chọn lọc đích tác động nào? Kết nghiên cứu kiểm tra tính an toàn cecropin đưa câu trả lời đầy khả quan phần lớn cecropin không gây độc tế bào nhân chuẩn [43, 70] Ví dụ năm 1996, Moore cs kiểm tra khả làm tan hồng cầu người cecropin B có nguồn gốc từ bướm đêm Hyalophora cecropia (một số loại cecropin có hoạt tính mạnh nhất) Kết thu cho thấy nồng độ cecropin B cao 500 M (cao hàng triệu lần so với nồng độ diệt vi sinh vật khác) không quan sát thấy tượng hồng cầu người bị tan [43] Ngoài ra, cecropin không gây ảnh hưởng đến hình thái, tốc độ tăng sinh đặc tính biệt hóa dòng tế bào nuôi cấy [42, 58, 64] Một giả thuyết giải thích chế chọn lọc đích tác động AMPs nói chung cecropin nói riêng dựa vào khác biệt cấu trúc màng tế bào [21] Không giống màng tế bào nhân sơ, màng tế bào nhân chuẩn có thành phần cholesterol giúp cho phân tử phospholipit kép co đặc hơn, màng tế bào trở nên bền vững khiến cecropin khó tạo lỗ hổng bề mặt màng Ngoài ra, phân bố cách bất đối xứng phân tử phospholipit tích điện âm trung hòa hai lớp màng đơn nguyên nhân giúp màng tế bào nhân chuẩn không nhạy cảm với cecropin Khả giết tế bào ung thư cách chọn lọc: Hoạt tính kháng ung thư cecropin quan tâm sớm với nghiên cứu Moore cs (1994) Trong điều kiện in vivo, cecropin B giúp kéo dài thời gian sống sót chuột bị ung thư cổ trướng ác tính Trong thử nghiệm in vitro, cecropin B có hoạt tính làm tan bào dòng tế bào ung thư vú ung thư buồng trứng người [42] Tiếp đó, năm 2008 nghiên cứu Suttmann cs cho thấy cecropin B có khả ức chế tăng sinh tế bào ung thư bàng quang, phá hủy cấu trúc màng tế bào gây chết tế bào ung thư (Hình 5) [58] Ngô Thị Hà 17 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Hình Hoạt tính cecropin B lên tế bào ung thư bàng quang A: tế bào ung thư bàng quang 486P không bị xử lý với cecropin B; B: tế bào ung thư bàng quang 486P bị xử lý với cecropin B nồng độ 65 µM [58] Kết nghiên cứu công bố năm 2010 Xiaobao cs cho thấy cecropin Musca domestica có khả ức chế phát triển dòng tế bào gan ung thư biểu mô BEL-7402 Đặc biệt, cecropin không làm ảnh hưởng tới phát triển tế bào gan lành xung quanh [64] Kết Hình cho thấy xử lý tế bào ung thư với cecropin nồng độ cao (từ 25 µM đến 100 µM) số lượng tế bào ung thư bị tiêu diệt nhiều Hình Hình thái học tế bào BEL-7402 xử lý với cecropin nồng độ khác phân tích kính hiển vi điện tử (A) phương pháp TUNEL (B) [64] Ngô Thị Hà 18 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 Cecropin có khả giết tế bào ung thư cách chọn lọc màng tế bào ung thư có hàm lượng phosphatidylserin cao so với tế bào bình thường Phosphatidylserin tích điện âm nên có lực cao với cecropin tích điện dương [26, 30] Đồng thời, tế bào ung thư có độ nhớt cao giúp cho phân tử cecropin dễ dàng công vào bên tế bào Các vi nhung mao bề mặt tế bào ung thư có số lượng lớn, đa dạng kích cỡ hình dạng, giữ vai trò quan trọng giúp cecropin chọn lọc đích tác động [58] 1.2.2.2.3 Tiềm ứng dụng tình hình nghiên cứu cecropin Với đặc điểm bật trên, cecropin trở thành đối tượng quan tâm nghiên cứu hàng đầu số AMPs [36] Đã có nhiều loại cecropin phân lập từ nhiều nguồn côn trùng khác nhau, chí cecropin cải biến lai với AMPs khác để làm tăng hoạt tính [25, 54] Tuy nhiên, đường để biến cecropin trở thành thuốc kháng sinh hệ thay cho loại kháng sinh đòi hỏi nhiều nghiên cứu cách thức thu nhận cecropin tinh chúng Đầu tiên, nhà khoa học mong muốn chủ động tổng hợp cecropin in vivo in vitro Chính vậy, hướng nghiên cứu phân lập gen mã cho cecropin để tạo nên động vật, thực vật chuyển gen có khả kháng lại mầm bệnh quan tâm [27, 47] Những sinh vật mang gen cecropin có khả đề kháng tốt với mầm bệnh điều kiện in vivo Kết nghiên cứu Sarmasik cs cho thấy 10% cá Medaka có gen cecropin chết lây nhiễm với Pseudomonas fluorescens 10-30% chết lây nhiễm với Vibrio anguillarum so với tỉ lệ chết lên tới 40% cá Medaka không mang gen cecropin [47] Việc chuyển gen cecropin B vào cà chua Solanum lycopersicum làm tăng khả kháng Ralstonia solanasearum, Xanthomonas campestris [27] Điều mở hướng đầy hứa hẹn ứng dụng Ngô Thị Hà 19 K18 Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2009-2011 cecropin vào công nghệ sinh học chăn nuôi trồng trọt [27] Hướng sản xuất cecropin tái tổ hợp tiến hành hệ thống biểu khác vi khuẩn [16, 31, 34, 66], nấm men [29, 32] côn trùng [67] Đặc biệt hệ thống biểu tế bào vi khuẩn E coli nhiều nhà nghiên cứu lựa chọn Năm 2006, Liang cs tách dòng gen cecropin phân lập từ ruồi nhà Musca domestica vector pGEX-4T-1; biểu tinh thành công cecropin có hoạt tính từ hệ thống biểu E coli [34] Tương tự, hinnavinII-38-Asn (một loại AMP thuộc họ cecropin) sản xuất tái tổ hợp chủng E coli BL21 (DE3) pLysS có hoạt tính kháng lại Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Bacillus megaterium Staphyloccus aureus [31] Có thể nói, nghiên cứu cecropin để biến tiềm trở thành nguồn kháng sinh hệ cần cho chiến chống kháng kháng sinh công nghệ sinh học quan tâm đặc biệt 1.2.2.2.4 Các phương pháp thu nhận cecropin Để thu nhận lượng lớn cecropin, có ba đường tiếp cận sau: (1) tách chiết từ tự nhiên; (2) tổng hợp trực đường hóa học (3) biểu cecropin tái tổ hợp vi khuẩn hay hệ thống biểu khác Tách chiết cecropin từ tự nhiên phải qua nhiều công đoạn phức tạp, khó đảm bảo mặt sinh khối, mức độ tinh khiết không chủ động nguồn nguyên liệu Việc tổng hợp cecropin nhân tạo đường hóa học lại có giá thành sản xuất cao [33] Điều trở nên khó khăn điều kiện nước phát triển Việt Nam Vì vậy, sử dụng “nhà máy vi khuẩn toàn năng” để sản xuất cecropin tái tổ hợp lựa chọn phù hợp Rất nhiều nghiên cứu sản xuất cecropin tái tổ hợp vừa đảm bảo có sinh khối cao, mức độ tinh khiết, hoạt tính sản phẩm tốt, giảm chi phí chủ động nguồn peptide để sử dụng cho nghiên cứu khác [33, 34, 66] Đây đường sản xuất quy mô công nghiệp hầu hết kháng sinh dùng Ngô Thị Hà 20 K18 Sinh học