Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau (luận văn thạc sĩ)

Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau (luận văn thạc sĩ)Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau (luận văn thạc sĩ)Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau (luận văn thạc sĩ)Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau (luận văn thạc sĩ)Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau (luận văn thạc sĩ)Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau (luận văn thạc sĩ)Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau (luận văn thạc sĩ)Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau (luận văn thạc sĩ)Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau (luận văn thạc sĩ)Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau (luận văn thạc sĩ)Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau (luận văn thạc sĩ)

IH TRƢ QU GI H N I Ọ Ọ T - ÔT Ị TÁCH DÒNG VÀ B ỂU À Ệ CECROPIN TR VECTOR KHÁC NHAU U V T S i - 2012 Ọ Á Ệ MỞ ẦU Nhân ngày Sức khỏe Thế giới 7/4/2011, tổ chức Y tế Thế giới WHO đưa chủ đề “ hống kháng kháng sinh: không hành động hôm nay, không thuốc chữa mai sau” nhằm thức tỉnh cộng đồng vấn đề vi sinh vật kháng thuốc đe dọa toàn cầu hống kháng kháng sinh vấn đề mới, trở nên cấp bách, đòi hỏi nỗ lực tổng hợp giúp nhân loại tránh nguy quay trở lại thời kỳ chưa có kháng sinh ho đến nay, giải pháp đưa nhằm hạn chế tình trạng kháng kháng sinh chưa phát huy tác dụng mong đợi Trong hướng phát triển loại kháng sinh tình trạng bế tắc, nhà khoa học tìm nguồn kháng sinh tự nhiên đầy tiềm năng, peptide kháng khuẩn (antimicrobial peptides, MPs) Trong số peptide này, cecropin chủ yếu tách chiết từ côn trùng, có phổ kháng khuẩn rộng có nhiều tiềm ứng dụng nên thu hút nhiều quan tâm nhà khoa học ể sản xuất AMPs nói chung cecropin nói riêng, có ba đường tiếp cận (1) tách chiết từ tự nhiên (2) tổng hợp trực tiếp từ axit amin theo đường hóa học (3) biểu protein tái tổ hợp Tuy nhiên, với yêu cầu thu lượng lớn cecropin tinh khiết, hai phương pháp đầu có giá thành cao khó áp dụng điều kiện phòng thí nghiệm nước phát triển Việt Nam Vì vậy, với mong muốn giảm chi phí chủ động việc sản xuất cecropin phân lập từ côn trùng Việt Nam cho nghiên cứu tiếp theo, tiến hành đề tài “Tách dòng biểu cecropin hệ vector khác nhau” ây hướng nghiên cứu Việt Nam hứa hẹn nhiều triển vọng ề tài thực Phòng thí nghiệm Sinh Y Phòng Genomic, Trường ại học Khoa học Tự nhiên, ại học Quốc gia Hà Nội CHƢƠNG - TỔ QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tình hình kháng kháng sinh 1.1.1 Thực trạng kháng kháng sinh Kháng kháng sinh tượng vi sinh vật (virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng) có khả vô hiệu hóa tác dụng thuốc kháng sinh mà trước chúng mẫn cảm [63, 79] Khi loại thuốc tác dụng điều trị, vi sinh vật gây bệnh tồn phát triển khiến bệnh lây lan nhanh cộng đồng thành dịch bệnh khó kiểm soát ặc biệt nước nghèo nước phát triển phải đối mặt với hậu vô nghiêm trọng gánh nặng điều trị bệnh nhiễm khuẩn chi phí bắt buộc cho việc thay kháng sinh cũ kháng sinh đắt tiền Thực trạng kháng kháng sinh đã, vấn đề mang tính toàn cầu, thách thức toàn nhân loại iều Tổng giám đốc WHO Margaret han nhận định nhân ngày Sức khỏe Thế giới 7/4/2011: “Một mối quan ngại hàng đầu việc chăm sóc sức khỏe y tế tình trạng bệnh kháng thuốc kháng sinh ây nguy hàng đầu gây thách thức công tác chăm sóc y tế kiểm soát bệnh truyền nhiễm, đồng thời làm tăng chi phí chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng” Năm 1928 coi mốc quan trọng đánh dấu cho công tìm kiếm thuốc kháng sinh Alexander Fleming (1881-1955) phát penicillin [72, 75] Tuy nhiên, 60 năm sau phát gần 50 năm sau penicillin đưa vào sản xuất quy mô công nghiệp, giới xuất 95% chủng Staphylococcus aureus kháng lại penicillin 60% kháng lại dạng dẫn xuất methicillin [7] Ngày nay, vi khuẩn không kháng lại penicillin mà kháng nhiều loại kháng sinh khác trở thành mối đe dọa thực sức khoẻ nhân loại Theo thống kê năm 2006 WHO, vi khuẩn có tỷ lệ kháng kháng sinh cao Klebsiella (15.1%), E coli (13.3%), P aeruginosa (13.3%), Acinetobacter spp (9.9%) S aureus (9.3%) Nhóm thuốc cephalosporin hệ thứ tư có tỷ lệ kháng cao đặc biệt từ 66-83%, nhóm kháng sinh aminosid fluoroquinolon có tỷ lệ kháng xấp xỉ 60% áo cáo WHO cho biết, số quốc gia có bệnh lao kháng thuốc tăng từ 58 năm 2010 lên 69 năm 2011 Mỗi năm, giới có khoảng 440,000 ca nhiễm lao đa kháng thuốc, 150,000 ca tử vong loại vi khuẩn [79] Tính riêng nước thuộc liên minh châu Âu EU năm có khoảng 25,000 người chết loài vi khuẩn đa kháng thuốc [80] ác kháng sinh hệ đắt tiền, chí số kháng sinh thuộc nhóm “lựa chọn cuối cùng” dần hiệu lực [1] ằng chứng lây lan chủng vi khuẩn kháng carbapenem (NDM-1) số nước châu Âu châu Á Loại “siêu vi khuẩn kháng thuốc” tiết enzyme NDM-1 kháng lại hầu hết loại thuốc kháng sinh, kể nhóm kháng sinh mạnh carbapenem [7, 79] ác nhà khoa học lo ngại “siêu vi khuẩn” lan khắp giới, đồng thời khẳng định tương lai gần chưa có loại thuốc có khả tiêu diệt Kháng kháng sinh không ảnh hưởng tới lĩnh vực y tế mà tác động sâu sắc đến kinh tế Theo ước tính WHO, Mỹ năm chi phí y tế cho thuốc điều trị nhiễm khuẩn xấp xỉ 20 tỉ $; với khối EU 1.5 tỉ € [80] Vì vậy, kháng kháng sinh trở thành vấn đề mang tính toàn cầu Hiện nay, tình hình kháng kháng sinh Việt Nam diễn biến phức tạp Theo báo cáo ộ Y tế năm 2008 nhiễm khuẩn chiếm tỷ lệ tử vong cao thứ hai (16.7%) sau bệnh tim mạch (18.4%) Báo cáo kết nghiên cứu 19 bệnh viện Hà Nội, thành phố Hồ hí Minh Hải Phòng hai năm (2009- 2010) tình trạng kháng kháng sinh cho thấy, có chủng vi khuẩn kháng kháng sinh thường gặp Acinetobacter spp, Pseudomonas spp, E coli Klebsiella Hầu hết kháng sinh thông thường như: penicillin, tetracycline, streptomycine, … bị kháng Theo báo cáo “Phân tích thực trạng: sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh Việt Nam” nhóm nghiên cứu Quốc gia Việt Nam thuộc tổ chức hiệp hội kháng kháng sinh toàn cầu (GARP, Global Antibiotic Resistance Partnership) vào tháng 10 năm 2010 tình trạng kháng kháng sinh nước ta đáng báo động [1] Bằng chứng tỷ lệ chủng Streptococcus pneumoniae, nguyên nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp, kháng penicillin 71.4%, kháng erythromycin 92.1% ây tỉ lệ kháng cao số 11 nước mạng lưới giám sát nguyên kháng thuốc hâu Á ( NSORP) năm 2000-2001 Năm 2009 tỷ lệ chủng vi khuẩn Gram âm kháng với ceftazidime 42%, kháng với gentamicin 63% kháng với axit nalidixic 74% bệnh viện cộng đồng Xu hướng gia tăng tình trạng kháng kháng sinh thể rõ rệt Những năm 1990, thành phố Hồ hí Minh, có 8% chủng pneumococcus kháng với penicillin ến năm 1999-2000, tỉ lệ tăng lên 56% [1] hính tình trạng kháng kháng sinh ngày có xu hướng tăng lên mà Việt Nam bị WHO xếp vào nhóm nước có tỷ lệ kháng kháng sinh cao giới (WHO, 2008) Thực trạng phức tạp không đặt cho ngành y tế Việt Nam nhiều thách thức mà đòi hỏi xã hội phải hành động để làm giảm bớt tình trạng kháng kháng sinh 1.1.2 Nguyên nhân v giải pháp cho tình trạng kháng kháng sinh ể hiểu rõ nguyên tình trạng kháng kháng sinh, báo cáo WHO ngày sức khỏe giới 7/4/2011 tổng kết nguyên nhân dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh cao sau [79]: Thứ nhất, kháng thuốc tượng tiến hóa tự nhiên Khi vi sinh vật tiếp xúc với chất có khả tiêu diệt chúng, vi sinh vật “may mắn” sống sót tự tạo chế tự vệ tránh tác dụng chất Từ hệ vi sinh vật kháng thuốc hình thành Không thế, gen kháng thuốc truyền ngang từ cá thể sang cá thể khác nên vi sinh vật kháng thuốc ngày nhiều Nguyên nhân quy luật tự nhiên nên khó có giải pháp ngăn chặn Tuy nhiên, nguyên nhân lại xuất phát chủ yếu từ phía người ó là: sử dụng thuốc không hợp lý; chất lượng thuốc kém; công tác phòng ngừa, kiểm soát bệnh lây truyền yếu thiếu hệ thống giám sát Chính nguyên nhân thúc đẩy nguyên nhân diễn nhanh góp phần không nhỏ dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh Vì vậy, muốn tình trạng kháng kháng sinh giảm xuống phải có hành động tích cực ngày hôm Nguyên nhân cuối dẫn tới tình trạng kháng kháng sinh ngày trầm trọng công cụ chống lại kháng thuốc ngày cạn kiệt ác loại thuốc kháng sinh dần tác dụng Trong đó, phát triển loại kháng sinh hệ ngày thu hẹp Hình Lịch sử phát thuốc kháng sinh Nhìn vào Hình thấy hàng loạt thuốc kháng sinh tìm chủ yếu khoảng từ năm 1940 đến năm 1970 ó thể nói thời đại hoàng kim thuốc kháng sinh Tuy nhiên, từ năm 1980 trở lại số lượng thuốc kháng sinh iều đặt mối lo ngại có phải nguồn kháng sinh cạn kiệt? Thêm vào tình trạng kháng kháng sinh ngày gia tăng liệu hệ tương lai hưởng lợi ích mà kháng sinh mang lại? ây mối băn khoăn đưa Ngày sức khỏe giới năm Một giải pháp nhằm đáp ứng nguồn kháng sinh khai thác peptide kháng khuẩn MPs (antimicrobial peptides) [7, 79] Hàng loạt nghiên cứu thể sinh vật mang hệ thống peptide có khả kháng khuẩn [22, 30] húng có đầy đủ tiềm để trở thành nguồn nguyên liệu quý người khai thác “thời đại kháng kháng sinh” [28, 49] 1.2 Peptide kháng khuẩn (AMPs) 1.2.1 iới thiệu chung MPs Tất thể đa bào tiến hóa qua hàng triệu năm môi trường có nhiều loại vi sinh vật Mặc dù thường xuyên tiếp xúc với mầm bệnh qua đường khác nhiều loài sinh vật bảo vệ kháng thể tế bào miễn dịch [30, 57] Lý mà chúng tồn nhờ hệ miễn dịch bẩm sinh tạo hàng loạt MPs tham gia đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu [20, 28] Một thực tế quan trọng mầm bệnh vi sinh vật dường không hình thành tính kháng với peptide ây lý để nhà nghiên cứu hãng dược phẩm tin tưởng AMPs trở thành liệu pháp chữa bệnh thay cho loại thuốc kháng sinh dễ bị vi sinh vật gây bệnh kháng lại [22, 45, 70] 1.2.1.1 Hoạt tính sinh học AMPs AMPs có hoạt tính kháng lại vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, vi rút, nấm, kí sinh trùng [20, 28, 37, 48] Tùy thuộc vào loại MPs mà có hoạt tính kháng mạnh hay yếu, phổ tác dụng rộng hay hẹp Ngoài ra, số loại MPs có hoạt tính kháng viêm, diệt tế bào ung thư đảm nhiệm chức định hệ thống miễn dịch bẩm sinh hệ thống miễn dịch tiếp thu [28, 30] 1.2.1.2 Sự đa dạng AMPs AMPs tìm thấy nhiều mô quan khác tất giới, ngành sinh vật, từ prokaryote người [28, 60] Tuy nhiên, nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung phân tích AMPs có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn ến có khoảng 800 loại MPs khác tìm thấy sinh vật nhân chuẩn [37] Dựa vào mức độ tương đồng độ tích điện, trình tự, chức cấu trúc không gian, AMPs chia thành nhóm sau [4, 9]:  Nhóm peptide phân đoạn protein lớn hơn: ác peptide tạo protein lớn bị phân cắt enzyme Trong số peptide thuộc nhóm này, peptide quan tâm nhiều lactoferricin tạo lactoferrin (một protein có hoạt tính kháng khuẩn, tiết chủ yếu mô nhầy) bị phân cắt enzyme pepsin ác nghiên cứu cho thấy lactoferricin peptide có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng [62]  Nhóm peptide tích điện âm: Lần vào năm 1992, nhà khoa học phân lập peptide kích thước nhỏ (721.6 đến 823.8 Da) tích điện âm từ cừu có hoạt tính kháng lại Mannheimia haemolytica, Escherichia coli Klebsiella pneumoniae [8] ến nhà nghiên cứu tìm nhiều loại peptide kháng khuẩn tích điện âm từ lưỡng cư (maximin H5), từ người (dermcidin) [9]  Nhóm peptide tích điện dương: ây nhóm peptide nghiên cứu nhóm lớn nhất, có mặt động vật lẫn thực vật phần lớn phân lập từ loài côn trùng [5] Một số loại peptide kháng khuẩn tích điện dương điển cecropin, andropin, moricin, ceratotoxin, melittin từ côn trùng hay magainin, dermaseptin, brevinin-1, esculentins, buforin II từ lưỡng cư [9] 1.2.1.3 Tiềm ứng dụng AMPs ho đến nay, bên cạnh việc phát triển để thay dần loại kháng sinh bị kháng, AMPs hứa hẹn trở thành liệu pháp chữa trị ung thư đầy hiệu [42, 58, 64] Hơn nữa, gen mã cho AMPs nguồn gen quan trọng để tạo nên sinh vật chuyển gen có khả kháng lại mầm bệnh Thực tế cho thấy hàng loạt loại thực vật động vật chuyển gen mã cho AMPs tạo [27, 47] Riêng lĩnh vực phát triển thuốc kháng sinh hệ từ MPs thu kết khả quan Rất nhiều loại MPs hãng dược phẩm đưa vào sản xuất, thử nghiệm số loại thương mại hóa ( ảng 1) [22] Bảng ác loại MPs tương tự AMPs sản xuất thương mại [22] Tên hãng sản xuất Tên thuốc iai đoạn phát triển Sử dụng y học AM-Pharma (Phần Lan) hLF-1-11 (petide nhỏ có nguồn gốc từ lactoferrin người) Phase II Các nhiễm trùng liên quan đến cấy ghép tủy xương loài Ceragenix (Denver) CSA-13 (steroid tích điện dương bắt chước peptide thuộc hệ thống bảo vệ thể) Tiền thử nghiệm lâm sàng Chống nhiễm khuẩn Helix Biomedix (USA) HB-50 (peptide tổng hợp tự nhiên bắt chước cecropin) HB-107 (đoạn dài 19 axit amin cecropin B) Tiền thử nghiệm lâm sàng Chống nhiễm khuẩn Tiền thử nghiệm lâm sàng Chữa lành vết thương IMX942 (peptide dài axit amin) Trong trình tối ưu hóa iều chỉnh hệ miễn dịch; điều trị sốt giảm bạch cầu trung tính bệnh nhân hoá trị liệu Phát minh Chống nhiễm khuẩn ung thư Inimex (Canada) Lytix Biopharma (Na Uy) hưa công bố Novacta Biosystems Ltd (Anh) Mersaxitin (bacteriocin) Tiền thử nghiệm lâm sàng Kháng vi khuẩn Gram dương Novozymes A/S ( an Mạch) Plectasin (defensin nấm) Tiền thử nghiệm lâm sàng Kháng loại vi khuẩn Gram dương, đặc biệt trường hợp nhiễm phế cầu khuẩn khuẩn liên cầu Pacgen (Canada) PAC113 (dựa đoạn hoạt động histatin 5protein tìm thấy nước bọt người) ược phê chuẩn loại thuốc nghiên cứu Thuốc uống điều trị chứng sưng tấy nấm lan âm đạo, ruột, miệng da M làm tan nửa GST-cecropin làm tan His+GST-cecropin Kết khẳng định vai trò Tag đến trạng thái biểu cecropin đồng thời đặt thách thức cho muốn có lợi sử dụng đồng thời hai loại Tag His GST trình bày Sử dụng chất biến tính khác Sarcozyl, Guanidine phải thay đổi điều kiện biểu hướng nghiên cứu mà mong muốn thu His+GST-cecropin dạng tan Khi sử dụng hệ thống vector biểu pET-32b-cecropin với loại Tag Trx thu cecropin dung hợp trạng thái tan ây loại Tag đánh giá có khả giúp protein biểu dạng tan cao [33, 66] Nhiều nghiên cứu biểu AMPs dung hợp với loại Tag thu kết khả quan iển nghiên cứu Xu cs thu nhận cecropin Mdmcec dung hợp với Trx Tag dạng tan [66] Tuy nhiên, Lu cs không thành công biểu Trx-Mdc-hly (một peptide lai cecropin (Mdc) với lysozyme người (hly)) E coli BL21 (DE3) Protein dung hợp Trx-Mdc-hly thu toàn dạng thể vùi [36] Kết lần khẳng định việc lựa chọn Tag để thu AMPs dung hợp trạng thái tan phụ thuộc nhiều vào loại peptide nghiên cứu 4.3 Phương pháp thu nhận cecropin dung hợp dạng hòa tan cách thức tinh ảnh hưởng tới hiệu suất tinh Trong nghiên cứu này, sử dụng phương thức biến tính không biến tính để thu nhận dạng hòa tan cecropin dung hợp Trường hợp protein dung hợp biểu dạng tan không cần xử lý biến tính nên sử dụng trực tiếp để tinh iển hình trường hợp GST-Md- ec tinh cột sắc ký lực Glutathione Sepharose 4B [34] Trong đó, phương thức biến tính tiến hành protein dung hợp biểu dạng thể vùi ể thu protein dung hợp dạng hòa tan cho khâu tinh phải sử dụng đến chất biến tính ure, sarkozyl, guanidine, DTT, ây trường hợp biểu protein Mdc-hly (loại protein lai cecropin từ Musca domestica lysozyme người) Protein dung hợp Trx-6His-Mdc-hly dạng thể vùi làm tan ure M; protein dung hợp sau tinh HisTrap kit (GE Healthcare) [36] Trong nghiên cứu mình, nhận thấy kết tinh cecropin dạng hòa tan theo phương thức biến tính không biến tính có khác biệt rõ rệt Lượng cecropin dung hợp GST-cecropin tinh thu nhờ làm tan biến tính ure hẳn so với Trxcecropin làm tan phương pháp không biến tính Kết phần sau GST-cecropin làm tan ure, phải tiến hành loại bỏ ure thẩm tách trước tinh qua cột Tuy nhiên, sau thẩm tách nửa GSTcecropin trở dạng không tan Chính mà lượng GST-cecropin lại để dùng cho tinh hẳn ban đầu Kết cho thấy có mặt chất biến tính ure GST-cecropin dạng tan, loại bỏ ure phần lớn cecropin dung hợp lại trở dạng không tan húng thay đổi hướng tinh từ không biến tính (tức ure bị loại bỏ trước tiến hành tinh sạch) sang biến tính (giữ nguyên ure tiến hành tinh sạch) Tuy nhiên, thay đổi không thành công sau tinh theo hướng biến tính thu băng GST-cecropin Khi sử dụng loại chất biến tính ure SDS để xử lý GST-cecropin dạng thể vùi, kết cho thấy có khác biệt mức độ ảnh hưởng loại chất biến tính đến cấu trúc cecropin dung hợp Mặc dù xử lý với SDS 0.5% giúp GSTcecropin tan nhiều so với ure M kết tinh thu hoàn toàn ngược lại Sau xử lý với SDS 0.5% dù tiến hành tinh theo hướng không biến tính (loại SDS trước tinh sạch) hay biến tính (giữ nguyên SDS) không thu GST-cecropin Như vậy, GST-cecropin dù làm tan ure hay SDS mà tinh theo hướng biến tính không thu kết iều giải thích GST điều kiện biến tính với SDS không giữ cấu trúc để liên kết với glutathione cột gel sắc ký lực nên dẫn đến tinh GST-cecropin Khi sử dụng ure M để xử lý GST-cecropin dạng thể vùi, sau loại bỏ ure trước tinh thu GST-cecropin dù hiệu suất không cao iều chứng tỏ sau loại bỏ ure, GST giữ cấu trúc đủ để liên kết với glutathione cột gel Kết cho thấy có khác biệt rõ rệt sử dụng SDS ure để xử lý thể vùi GST-cecropin iều đặt cho câu hỏi liệu có phải SDS làm biến tính hoàn toàn cấu trúc GST-cecropin hồi tính lại hay nguyên nhân khác? ể kiểm tra giả thiết biểu GST (không dung hợp với cecropin) việc biến nạp vector pGEX-4T-1 vào chủng E coli L21 (DE3) húng đồng thời tiến hành xử lý GST với SDS 0.5% với ure M theo quy trình tiến hành với protein dung hợp GST-cecropin Sau xử lý, tiến hành thẩm tách loại bỏ hai loại chất biến tính tinh qua cột Kết thu cho thấy GST xử lý với ure tinh tốt với hiệu suất cao GST xử lý với SDS không tinh Kết chứng minh giả thiết đặt Với mục đích sản xuất AMPs nói chung cecropin nói riêng, nhà nghiên cứu mong muốn thu protein dung hợp dạng tan nhằm giữ toàn vẹn hoạt tính, giảm thời gian, chi phí tinh đạt hiệu suất tinh cao Kết cho thấy cecropin biểu dạng tan tiến hành tinh theo hướng không biến tính hiệu suất tinh cao hẳn so với dạng không tan tinh theo hướng biến tính Khi tiến hành biểu tinh đồng thời cecropin nhận thấy khác biệt sử dụng hệ thống biểu hiện, Tag dung hợp khác mà cecropin có khác Trường hợp sử dụng loại Tag dung hợp, hệ thống biểu hiện, phương pháp xử lý xong mức độ biểu hiệu suất tinh cecropin có khác Cụ thể số cecropin cecT biểu khó tinh hẳn so với loại lại iều đặt cho câu hỏi liệu khác biệt có phải hoạt tính khác cecropin có nguồn gốc khác gây hay không? Bởi lẽ nhiều nghiên cứu cecropin hoạt tính loại cecropin khác có khác biệt [5, 26, 35] Vì vậy, để trả lời câu hỏi trên, hướng nghiên cứu cần thu lượng lớn cecropin tinh loại bỏ Tag tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn để có kết luận cụ thể xác KẾT LU N Tổng hợp kết thu được, đưa số kết luận sau: Thiết kế thành công hệ thống vector biểu cecropin: hệ thống pGEX4T-1 (pGEX-cecH, pGEX-cecN, pGEX-cecT); hệ thống pET-28a với có mặt đồng thời loại Tag (pET-28a-cecH, pET-28a-cecN, pET-28a-cecT) hệ thống pET-32b (pET-32b-cecH, pET-32b-cecN, pET-32b-cecT) Biểu thành công:  CecH, cecN cecT dạng dung hợp với GST chủng tế bào biểu E coli BL21 (DE3) E coli JM109  ecH cecN dạng dung hợp với Tag His+GST chủng tế bào biểu E coli BL21 (DE3)  ecH, cecN cecT dạng dung hợp với Trx chủng tế bào biểu E coli BL21 (DE3) Xác định trạng thái biểu cecropin dung hợp:  GST-cecH, GST-cecN, GST-cecT; His+GST-cecH, His+GST-cecN dạng thể vùi  Trx-cecH, Trx-cecN, Trx-cecT dạng tan Làm tan thành công cecropin dung hợp với GST dạng thể vùi SDS 0.5% ure M Tinh thành công cecropin dung hợp với Trx (Trx-cecH, Trx-cecN, Trx-cecT) cecropin dung hợp với GST (GST-cecH, GST-cecN, GST- cecT) sau làm tan ure M Hiệu suất tinh cecropin dung hợp với Tag Trx cao hẳn so với Tag GST ước đầu xử lý cecropin H dung hợp với GST protease thrombin KIẾN NGHỊ Những kết luận thu đặt phương hướng nghiên cứu cho thời gian tới sau: Chuẩn hóa điều kiện giải phóng loại cecropin khỏi GST Trx protease tương ứng thrombin enterokinase Loại bỏ GST Trx để thu cecropin tinh Thử hoạt tính kháng khuẩn loại cecropin: cecH, cecN cecT chủng vi sinh vật kiểm định Từ đánh giá khác biệt hoạt tính kháng khuẩn cecropin khác biệt hoạt tính cecropin theo hai cách làm tan biến tính không biến tính TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt GARP-Nhóm nghiên cứu Quốc gia Việt Nam (2010), Phân tích thực trạng: Sử dụng kháng sinh v kháng kháng sinh Việt am, Hà Nội Nguyễn Thị Thu Hường (2011), Tách dòng cecropin từ nhộng Bombyx mori v biểu cecropin tái tổ hợp Escherichia coli, Luận văn cử nhân Sinh học, Trường đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội Tiếng nh rnau J., Lauritzen , Petersen G E., Pedersen J (2006), “Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins”, Protein Expression and Purification, 48, pp 1-13 Boman H G (1995), “Peptide antibiotics and their role in innate immunity”, Annual Review of Immunology, 13, pp 61-92 Boman H G., Faye I., Gan R., Gudmundsson G H., Lidholm D A., Lee J Y., Xanthopoulos K G (1987), “Insect immunity-a gene system for antibacterial proteins”, Mem Inst Oswaldo Cruz, 82(3), pp 115-124 ondos S E., icknell (2003), “Detection and prevention of protein aggregation before, during, and after purification”, Analytical Biochemistry, 316, pp 223-231 reithaupt H (1999), “The new antibiotics”, Nature Biotechnology, 17, pp 11651169 Brogden K (1992), “Ovine pulmonary surfactant induces killing of Pasteurella haemolytica, Escherichia coli, and Klebsiella pneumoniae by normal serum”, Infection and Immunity, 60, pp 5182-5189 Brogden K (2005), “ ntimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?”, Nature, 3, pp 238-250 10 Brogden K A., Ackermann M., McCray P B., Jr., Tack B F (2003), “Antimicrobial peptides in animals and their role in host defences”, International Journal of Antimicrobial Agents, 22, pp 465-478 11 rown K L., Hancock R E W (2006), “ ationic host defense (antimicrobial) peptides”, Current Opinion in Immunology, 18, pp 24-30 12 Bulet P., Charlet M., Hetru C (2003), Innate Immunity, Humana Press, Totowa, pp 89-107 13 Bulet P., Stöcklin R (2005), “Insect antimicrobial peptides: Structures, properties and gene regulation”, Protein and Peptide Letters, 12, pp 3-11 14 Bulet P., Stöcklin R., Menin L (2004), “Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates”, Immunological Reviews, 198, pp 169-184 15 Callaway J E., Lai J., Haselbeck B., Baltaian M., Bonnesen S P., Weickmann J., Wilcox G., Lei S P (1993), “Modification of the terminus of cecropin is essential for broad-spectrum antimicrobial activity”, Antimicrobial agents and Chemotherapy, 37(8), pp 1614-1619 16 Chen Y Q., Zhang S Q., Li B C., Qiu W., Jiao B., Zhang J., Diao Z Y (2008), “Expression of a cytotoxic cationic antibacterial peptide in Escherichia coli using two fusion partners”, Protein Expression and Purification, 57, pp 303-311 17 romwell M E M., Hilario E., Jacobson F (2006), “Protein aggregation and bioprocessing”, The AAPS Journal, 8(3), pp E572-E579 18 Fei D., Wei X., Xueyin D., Xianxiu X (1999), “The terminal structure plays an important role in the biological activity of cecropin MIV”, Science in China, 42(5), pp 494-500 19 Ganz T (1999), “Defensins and host defense”, Science, 286, pp 420-421 20 Ganz T (2003), “The role of antimicrobial peptides in innate immunity”, Integrative and Comparative Biology, 43, pp 300-304 21 Hancock R E W (1997), “Peptide antibiotics”, Lancet, 349, pp 418-422 22 Hancock R E W., Sahl H G (2006), “Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies”, Nature Biotechnology, 24(12), pp 15511557 23 Holak T A., Engstrom A., Kraulis P J., Lindeberg G., Bennich H., Jones T A., Gronenborn A M., Clore G M (1988), “The solution conformation of the antibacterial peptide cecropin A: a nuclear magnetic resonance and dynamical simulated annealing study”, Biochemistry, 27(20), pp.7620-7676 24 Hong R W., Shchepetov M., Weiser J N., xelsen P H (2003) “Transcriptional profile of the Escherichia coli response to the antimicrobial insect peptide Cecropin A”, Antimicrobia agents and Chemotherapy, 47(1), pp 1-6 25 Hongbiao W., Baolong N., Mengkui X., Lihua H., Weifeng S., Zhiqi M (2005), “Biological activities of cecropin B-thanatin hybrid peptides”, The journal of peptide research official journal of the American Peptide Society, 66(6), pp 382386 26 Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Kapur R., Boman H G (1982), “Insect immunity: isolation and structure of cecropin D and fourminor antibacterial components from cecropia pupae”, European Journal Biochemistry, 127, pp 207217 27 Jan P S., Huang H Y., Chen H M (2010), “Expression of a synthesized gene encoding cationic peptide Cecropin B in transgenic tomato plants protects against bacterial diseases”, Applied and Environmental Microbiology, 76(3), pp 769-775 28 Jenssen H., Hamill P., Hancock R E W (2006), “Peptide antimicrobial agents”, Clinical microbiology reviews, pp 491-511 29 Jin F., Xu X., Zhang W., Gu D (2006), “Expression and characterization of a housefly cecropin gene in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 49(1), pp 39-46 30 Kamysz W., Okrój M., Lukasiak J (2003), “Novel properties of antimicrobial peptides”, Acta Biochimica Polonica, 50(2), pp 461-469 31 Kang C S., Son S Y., ang I S (2008), “ iologically active and -Amidated HinnavinII-38-Asn produced from a Trx fusion construct in Escherichia coli”, The Journal of Microbiology, 46(6), pp 656-661 32 Li L., Wang J X., Zhao X F., Kang C J., Liu N., Xiang J H., Li F H., Sueda S., Kondo H (2005), “High level expression, purification, and characterization of the shrimp antimicrobial peptide, Ch-penaeidin, in Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 39, pp 144-151 33 Li Y (2009), “MINIREVIEW arrier proteins for fusion expression of antimicrobial peptides in Escherichia coli”, Biotechnology and Applied Biochemistry, 54, pp 1-9 34 Liang Y., Wang J X., Zhao X F., Du X J., Xue J F (2006), “Molecular cloning and characterization of cecropin from the housefly (Musca domestica), and its expression in Escherichia coli”, Developmental and Comparative Immunology, 30, pp 249-257 35 Liu Z., Zhang F., L., Zhao G., Wang (2003), “Studies on the properties of Cecropin-XJ expressed in yeast from Xinjiang silkworm”, Wei Sheng Wu Xue Bao, 43(5), pp 635-641 36 Lu X M., Jin X B., Zhu J Y., Mei H F., Chu F J., Wang Y., Li X B (2010), “Expression of the antimicrobial peptide cecropin fused with human lysozyme in Escherichia coli”, Applied Microbiology and Biotechnology, 87(6), pp 2169-2178 37 McDermott A M (2004), “Defensins and other antimicrobial peptides at the ocular surface”, Ocul Surf., 2(4), pp 229-247 38 Mookherjee N., Hancock R E W (2007), “Cationic host defence peptides: innate immune regulatory peptides as a novel approach for treating infections”, Cellular and molecular life sciences, 64(7-8), pp 922-933 39 Melo M N., Ferre R., Castanho M A (2009), “ ntimicrobial peptides: linking partition, activity and high membrane-bound concentrations”, Nature Reviews, Microbiology, 7, pp 245-250 40 Mercado-Pimentel M E., Jordan N C., isemberg G O (2002), “ ffinity purification of GST fusion proteins for immunohistochemical studies of gene expression”, Protein Expression and Purification, 26, pp 260-265 41 Moore J., eazley W D., ibby M ., Devine D (1996), “ ntimicrobial activity of cecropins”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 37, pp 1077-1089 42 Moore A J., Devine D A., Bibby M (1994), “Preliminary experimental anticancer activity of cecropins”, Peptide research, 7(5), pp 265-269 43 Nakajima Y., Qu X.M., Natori S (1987), “Interaction between liposomes and sarcotoxin IA, a potent antibacterial protein of Sarcophaga peregrina (flesh fly)”, The Journal of Biological Chemistry, 262, pp 1665-1669 44 Pryor K D., Leiting (1997), “High-level expression of soluble protein in Escherichia coli using a His6-Tag and Maltose-Binding-Protein double-affinity fusion system”, Protein Expression and Purification, 10, pp 309-319 45 Sallum U W., Chen T T (2008), “Inducible resistance of fish bacterial pathogens to the MPs ecropin ”, Antimicrobial agents and Chemotherapy, 52(9), pp 3006-3012 46 Sambrook J., Russel D W (2001), Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Habor laboratory Press, New York 47 Sarmasik A., Warr G., Chen T T (2002), “Production of transgenic Medaka with increased resistance to bacterial pathogens”, Marine Biotechnology, 4, pp 310-322 48 Sato H., Feix J (2006), “Peptide–membrane interactions and mechanisms of membrane destruction by amphipathic α-helical antimicrobial peptides”, Biochimica et Biophysica Acta, 1758, pp 1245-1256 49 Schmitt P., Mercado L., Díaz M., Guzmán F., Arenas G., Marshall S H (2008), “ haracterization and functional recovery of a novel antimicrobial peptide (CECdir-CECret) from inclusion bodies after expression in Escherichia coli”, Peptides, 29, pp 512-519 50 Serón J M., Contreras-Moreno J., Puertollano E., Cienfuegos G A., Puertollano M A., Pablo M A (2010), “The antimicrobial peptide cecropin A induces caspaseindependent cell death in human promyelocytic leukemia cells”, Peptides, 31, pp 1494-1503 51 Shahravan S H., Qu X., Chan I., Shin J (2008), “Enhancing the specificity of the enterokinase cleavage reaction to promote efficient cleavage of a fusion tag”, Protein Expression and Purification, 59(2), pp 314-319 52 Shen L., Ding M., Zhang L., Jin F., Zhang W., Li D (2010), “Expression of ccRoyalisin gene from Royal Jelly of Chinese Honeybee in Escherichia coli and its antibacterial activity”, Journal of agricultural and food chemistry, 58, pp 22662273 53 Shen Y., Lao X G., hen Y., Zhang H Z., Xu X X (2007), “High-level expression of cecropin X in Escherichia coli”, International Journal of Molecular Sciences, 8, pp 478-491 54 Shin S Y., Kang J H., Hahm K S (1999), “Structure-antibacterial, antitumor and hemolytic activity relationships of cecropin A-magainin and cecropin A-melittin hybrid peptides”, The journal of peptide research official journal of the American Peptide Society, 53(1), pp 82-90 55 Steiner H., Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H G (1981), “Sequencec and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity”, Nature, 292, pp 246-248 56 Steinmetz E (2011), “Expresso® loning and Expression Systems: Expressioneering™ Technology streamlines recombinant protein expression”, Nature methods, 8(6), pp iii-iv 57 Strominger J L (2009), “Animal Antimicrobial Peptides: Ancient Players in Innate Immunity”, Journal of Immunol, 182, pp 6633-6634 58 Suttmann H., Retz M., Paulsen F., Harder J., Zwergel U., Kamradt J., Wullich B., Unteregger G., Stöckle M., Lehmann J (2008), “ ntimicrobial peptides of the Cecropin-family show potent antitumor activity against bladder cancer cells”, BioMed Central Urology, pp 1-7 59 Tian Y., Zhang J., hen Z., Peng T., Xu X., Jiang W., n J (2006), “Expression, purification of DENV-2 nonstructural protein (NS3) and production of the polyclonal antibody for NS3”, Dengue Bulletin, 30, pp 146-156 60 Ueno S., Kusaka K., Tamada Y., Minaba M., Zhang H., Wang P C., Kato Y (2008), “ nionic -terminal proregion of Nematode antimicrobial peptide Cecropin P4 precursor inhibits antimicrobial activity of the mature peptide”, Bioscience Biotechnology Biochemistry, 72(12), pp 3281-3284 61 Wachinger M., Kleinschmidt A., Winder D., Pechmann N.V., Ludvigsen A., Neumann M., Holle R., Salmons , Erfle V (1998), “ ntimicrobial peptides melittin and cecropin inhibit replication of human immunodeficiency virus by suppressing viral gene expression”, Journal of General Virology, 4, pp 731-740 62 Wakabayashi H., Takase M., Tomita M (2003), “Lactoferricin derived from milk protein lactoferrin”, Current Pharmaceutical Design, 9(16), pp 1277- 1287 63 Wilcox S (2004), “The new antimicrobials: ationic peptides”, BioTeach Journal, 2, pp 88-91 64 Xiaobao J., Hanfang M., Xiaobo L., YanMa, Ai-hua Z., Yan W., Xuemei L., Fujiang , Qiang W., Jiayong Z (2010), “ poptosis-inducing activity of the antimicrobial peptide cecropin of Musca domestica in human hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402 and the possible mechanism”, Acta Biochim Biophys Sin, pp 259-265 65 Xie W., Qiu Q., Wu H., Xu X (1996), “Expression of cecropin MIV fusion protein in E coli under T7 promoter”, Biochemistry and molecular biology international, 39(3), pp 487-492 66 Xu X., Jin F., Yu X., Ji S., Wang J., Cheng H., Wang C., Zhang W (2007), “Expression and purification of a recombinant antibacterial peptide, cecropin, from Escherichia coli”, Protein Expression and Purification, 53, pp 293-301 67 Yamada K., Nakajima Y., Natori S (1990), “Production of recombinant sarcotoxin UA in Bombyx mori cells”, Biochemistry Jounal, 272, pp 633-636 68 Yang W., Cheng T., Ye M., Deng X., Yi H., Huang Y., Tan X., Han D., Wang B., Xiang Z., ao Y., Xia Q (2011), “Functional Divergence among Silkworm Antimicrobial Peptide Paralogs by the Activities of Recombinant Proteins and the Induced Expression Profiles”, PloS One, 6(3), pp e18109 69 Yu F., Wang J., Zhang P., Hong Y., Liu W (2010), “Fusion expression of cecropin B-like antibacterial peptide in Escherichia coli and preparation of its antiserum”, Biotechnology Letters, 32, pp 669-673 70 Zasloff M (2002), “ ntimicrobial peptides of multicellular organisms”, Nature, 415, pp 389-395 Trang Web 71 http://cancer.med.unc.edu/vandykelab/protocols/miscellaneous/dialysis_tubing_pre paration.pdf 72 http://history1900s.about.com/od/medicaladvancesissues/a/penicillin.htm 73 http://www.blueskybiotech.com/cellCulture-insectExp.html 74 http://www.globeimmune.com/technology/ 75 http://www.historylearningsite.co.uk/alexander_fleming_and_penicillin.htm 76 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Protein-ExpressionSystems-and-Vectors/Protein-Expression-Systems.html 77 http://www.nhandan.com.vn/cmlink/nhandandientu/thoisu/khoa-hoc/khoa-h-c/baong-tinh-tr-ng-khang-thu-c-khang-sinh-1.292643#y2iCFxHSBTzz 78 http://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-andapplications-guide/protein-expression/ 79 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/en/ 80 www.who.int/world-health-day/2011/presskit/WHD2011-QA-EN.pdf ... giảm chi phí chủ động việc sản xuất cecropin phân lập từ côn trùng Việt Nam cho nghiên cứu tiếp theo, tiến hành đề tài Tách dòng biểu cecropin hệ vector khác nhau ây hướng nghiên cứu Việt Nam... mong muốn đường sản xuất protein tái tổ hợp, đề tài Tách dòng v biểu cecropin hệ vector khác nhau mang nhiều ý nghĩa Thứ nhất, nghiên cứu cecropin phân lập từ loài côn trùng Việt Nam Từ mở hướng... pCR2.1 mang gen cecropin B tổng hợp nhân tạo - Vector nhân dòng: pBluescript II KS(+) (kí hiệu p S) hãng Stratagene - Vector biểu hiện: Vector pGEX-4T-1 hãng GE Healthcare, vector pET28a vector pET-32b