Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 138 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
138
Dung lượng
2,77 MB
Nội dung
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC
PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY
CÚC MUI (TRIDAX PROCUMBENS L.)
MỌC HOANG Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS - TS. NGUYỄN HỮU HIỆP
TÔ HOÀNG DIỄM
MSSV: 3108481
LỚP: VSVH-K36
Cần Thơ, Tháng 12/ 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC
PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY CÚC
MUI (TRIDAX PROCUMBENS L.)
MỌC HOANG Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ
Cần Thơ, Tháng 12/2013
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(ký tên)
SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên)
PGs-Ts. Nguyễn Hữu Hiệp
Tô Hoàng Diễm
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)
LỜI CẢM TẠ
Trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp tại trường Đại học Cần Thơ, tôi đã
nhận được rất nhiều sự quan tâm và động viên từ gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận
tình của quý Thầy, Cô cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn. Để hoàn thành được
luận văn tốt nghiệp này, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Quý Thầy Cô tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại
học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực
hiện luận văn.
PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh
vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ người Thầy đã nhiệt tâm hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong
suốt quá trình học tập, xây dựng đề cương nghiên cứu, thực hiện thí nghiệm và hoàn
thành luận văn này.
Cán bộ quản lý tại phòng thí nghiệm vi sinh vật đã giúp đỡ, động viên và chia sẻ
những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến cha, mẹ đã luôn ủng hộ tôi về
mọi phương diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên trong cuộc sống.
Xin kính chúc quý Thầy, Cô và các bạn sinh viên luôn dồi dào sức khỏe và luôn
thành công.
Cần Thơ, ngày 17 tháng 11 năm 2013
Tô Hoàng Diễm
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
TÓM LƯỢC
Mười bảy dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ rễ, thân và lá của cây cúc
mui (Tridax procumbens) trong môi trường PDA. Phần lớn vi khuẩn đều có khuẩn lạc
dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, màu trắng đục, dạng hình que, Gram âm và có khả
năng chuyển động. Kết quả khảo sát khả năng cố định N và tổng hợp IAA của vi khuẩn
cho thấy, lượng ammonium và IAA này tăng cao nhất vào ngày thứ tư và giảm dần sau
sáu ngày chủng. Dòng R6, T3, L4, L5, L6 có khả năng tổng hợp lượng NH4+ cao nhất
so với các dòng còn lại (0,213 µg/ml - 0,221 µg/ml). Tuy nhiên các dòng vi khuẩn này
tổng hợp lượng ammonium khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở ngày thứ tư sau khi
chủng và lượng IAA cao nhất (16,67 µg/ml) do dòng R5 tổng hợp trong điều kiện
không có tryptophane vào ngày thứ 6 sau khi chủng. Bên cạnh đó, dòng L5 có khả
năng hòa tan lân cao nhất so với các dòng còn lại, đồng thời cũng có khả năng kháng
khuẩn. Hai dòng R2 và T2 có khả năng kháng lại hai vi khuẩn E. coli và Aeromonas
hydrophila gây bệnh.
Kết quả giải trình tự gene 16S-rDNA và so sánh với dữ liệu của ngân hàng gene
NCBI, dòng L5 được nhận diện là KC182058.1 Bacillus subtilis dòng M1, dòng R2 là
KC443084.1 Bacillus subtilis dòng BAB - 244 và dòng T2 là KC465726.1 Bacillus
subtilis dòng 14 với tỉ lệ đồng hình lần lượt là 99%, 99% và 95%.
Từ khóa: Ammonium, hòa tan lân, IAA, khả năng kháng khuẩn, phân lập, vi
khuẩn nội sinh.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
i
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT
TÓM LƯỢC ....................................................................................................................i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG .....................................................................................................v
DANH SÁCH HÌNH .....................................................................................................vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................... viii
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .......................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2 Mục tiêu của đề tài ..................................................................................................2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .....................................................................3
2.1 Thành phố Cần Thơ ............................................................................................... 3
2.1.1 Sơ lược về thành phố Cần Thơ ...........................................................................3
2.1.2 Vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên của thành phố Cần Thơ.................................3
2.2 Sơ lược cây cúc mui (Tridax procumbens) ............................................................. 5
2.2.1 Phân loại thực vật ............................................................................................... 5
2.2.2 Mô tả cây cúc mui ............................................................................................... 6
2.2.3 Vùng phân bố, thu hái và nhân giống cây cúc mui .............................................6
2.2.4 Đặc tính sinh học ................................................................................................ 7
2.2.5 Thành phần hoá học ............................................................................................ 7
2.2.6 Dược tính ............................................................................................................9
2.2.7 Công dụng, chỉ định và phối hợp ........................................................................9
2.3 Giới thiệu về vi khuẩn nội sinh .............................................................................10
2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh ............................................................................10
2.3.2 Các nhóm vi khuẩn nội sinh tiêu biểu .............................................................. 13
2.3.3 Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh ..................20
2.3.4 Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh lên hình thái và chức năng bộ rễ cây ..........23
2.3.5 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh ............................................................. 23
Chuyên ngành Vi sinh vật học
ii
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
2.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật cố định đạm trên thế giới và trong
nước ............................................................................................................................... 30
2.4.1 Trên thế giới ......................................................................................................30
2.4.2 Trong nước ........................................................................................................32
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................34
3.1 Phương tiện nghiên cứu ........................................................................................ 34
3.1.1 Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 34
3.1.2 Địa điểm thực hiện ............................................................................................ 34
3.1.3 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................... 34
3.1.4 Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................ 34
3.1.5 Hóa chất ............................................................................................................35
3.2 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 35
3.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui ..................................................35
3.2.2 Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn. ..................................................................37
3.2.3 Khảo sát khả năng cố định đạm của một số dòng vi khuẩn đã phân lập. .........39
3.2.4 Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn đã phân lập. ....41
3.2.5 Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn đã phân lập được.
....................................................................................................................................42
3.2.6 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn ............................. 43
3.2.7 Nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh tiêu biểu .........................................44
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn ...................................................................................48
4.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc........................................................................................... 49
4.1.2 Đặc điểm tế bào vi khuẩn .................................................................................52
4.2 Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập
dựa trên lượng NH4+ (ammonium) tổng hợp được. .................................................54
4.2.1 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân lập ở rễ và
thân cây cúc mui (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4) .......................................................... 54
4.2.2 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân lập từ lá
của cây cúc mui (L1 - L7) .......................................................................................... 56
Chuyên ngành Vi sinh vật học
iii
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
4.2.3 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn triển vọng ở cả nhóm 1 và
nhóm 2 được phân lập ở rễ, thân và lá của cây cúc mui ............................................58
4.3. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân ở các dòng vi khuẩn phân lập được
trên môi trường PDA. .................................................................................................60
4.4. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) ở các dòng vi
khuẩn được nuôi trong môi trường Nfb lỏng không bổ sung Tryptophan ............61
4.4.1 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân lập ở rễ và thân
cây cúc mui (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4) ..................................................................62
4.4.2 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân lập từ lá của cây
cúc mui (L1- L7) ........................................................................................................64
4.4.3 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng ở cả nhóm 1 và nhóm 2
được phân lập ở rễ, thân và lá của cây cúc mui ......................................................... 65
4.5 Kết quả khả năng tạo kháng khuẩn ở các dòng vi khuẩn .................................66
4.5.1 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh ở đường ruột (E. coli).............66
4.5.2 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh cá (Aeromonas hydrophila)....67
4.6 Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR.......................... 69
4.6.1 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng R2 ................................................70
4.6.2 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng T2 ................................................71
4.6.3 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng L5 ................................................73
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................76
5.1 Kết luận ..................................................................................................................76
5.2 Kiến nghị ................................................................................................................76
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 77
PHỤ LỤC .....................................................................................................................95
Chuyên ngành Vi sinh vật học
iv
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Thành phần môi trường PDA ..........................................................................37
Bảng 2. Thành phần môi trường Nfb ............................................................................37
Bảng 3. Công thức môi trường NBRIP lỏng.................................................................42
Bảng 4. Thành phần môi trường LB agar .....................................................................44
Bảng 5. Thành phần các chất trong phản ứng PCR ...................................................... 46
Bảng 6. Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen của vi khuẩn nội sinh ................46
Bảng 7. Vị trí và địa điểm thu mẫu của các dòng vi khuẩn được phân lập từ cây cúc
mui trên môi trường PDA .............................................................................................. 49
Bảng 8. Đặc tính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường
PDA ............................................................................................................................... 52
Bảng 9. Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA
.......................................................................................................................................53
Bảng 10. Lượng ammonium trung bình do các dòng vi khuẩn nhóm 1 (R1, R2, R5 R8 và T1-T4) tổng hợp được theo thời gian (µg/ml) ...................................................56
Bảng 11. Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường
NBRIP đặc .....................................................................................................................61
Bảng 12. Lượng IAA trung bình do các dòng vi khuẩn nhóm 1 (R1, R2, R5 - R8 và
T1-T4) tổng hợp được theo thời gian(µg/ml) ................................................................ 63
Bảng 13. Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn
E.coli .............................................................................................................................. 67
Bảng 14. Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn
Aeromonas hydrophila ..................................................................................................68
Chuyên ngành Vi sinh vật học
v
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1: Bản đồ hành chính thành phố Cần Thơ ............................................................. 4
Hình 2: Cây cúc mui (Tridax procumbens) ....................................................................5
Hình 3: Hoa cây cúc mui ở Hyderabad, Ấn Độ .............................................................. 6
Hình 4: Các cấu trúc của các hợp chất (1- 6) .................................................................8
Hình 5: Vi khuẩn Escherichia coli ...............................................................................29
Hình 6: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila.....................................................................30
Hình 7: Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ NH4+ ....................................................... 41
Hình 8: Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ IAA ........................................................ 43
Hình 9: Gel trước khi chụp hình DNA .........................................................................47
Hình 10: Môi trường NFb bán đặc (a) và vòng pellicle xuất hiện sau khi chủng vi
khuẩn (b) ........................................................................................................................ 48
Hình 11: Một số khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA Agar…..
.......................................................................................................................................51
Hình 12: Vi khuẩn Gram âm (dòng T4) và vi khuẩn Gram dương (dòng L5) được
chụp dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 100X. ............................................................... 53
Hình 13: Lượng NH4+ (µg/ml) do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (L1- L7) tạo ra ............57
Hình 14: Lượng NH4+ (µg/ml) do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra ....................... 59
Hình 15: Vòng halo do vi khuẩn tạo ra khi chủng vào trong môi trường NBRIP. ......60
Hình 16: Lượng IAA do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (L1 - L7) tạo ra được phân lập từ
lá của cây cúc mui .........................................................................................................64
Hình 17: Lượng IAA do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra được phân lập từ rễ, thân
và lá của cây cúc mui .....................................................................................................66
Hình 18: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn T4 với vi khuẩn E. coli theo thời
gian ................................................................................................................................ 67
Hình 19: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn L2 và L3 với vi khuẩn Aeromonas
hydrophila gây bệnh ở cá .............................................................................................. 68
Hình 20: Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S rDNA ................................ 70
Chuyên ngành Vi sinh vật học
vi
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Hình 21: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng R2 ........................................71
Hình 22: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng T2.........................................72
Hình 23: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng L5.........................................74
Chuyên ngành Vi sinh vật học
vii
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
16S-rRNA
16S ribosomal RNA
ĐBSCL
Đồng bằng sông Cửu Long
Đ.K
Đường kính
DNA
Deoxyribonucleic Acid
EDTA
Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid
IAA
Indol -3- acetic acid
PCR
Polymerase Chain Reaction
PGPR
Plant Growth Promoting Rhizobacteria
VKNS
Vi khuẩn nội sinh
VSV
Vi sinh vật
Chuyên ngành Vi sinh vật học
viii
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Thiên nhiên là một nguồn nguyên liệu của các loại dược phẩm khoảng hàng ngàn
năm nay và một con số ấn tượng của các loại thuốc ngày nay đã được điều chế từ tài
nguyên thiên nhiên. Một số loài thực vật và các giá trị cần thiết của chúng đã được
nghiên cứu và công bố, nhưng cho đến nay nhiều loài trong số chúng vẫn còn chưa
được khám phá. Vì vậy, điều cần thiết để khám phá công dụng của chúng và để tiến
hành nghiên cứu ngành dược liệu học và y học để khám phá ra các loại thuốc chữa
bệnh. Cây cúc mui (Tridax procumbens L.) là một thảo dược quý được tìm thấy ở khắp
Ấn Độ nhưng tiếc là nó là một trong những cây dược liệu bị bỏ quên.
Cây cúc mui là một loại thảo dược thường được sử dụng trong y học dân tộc,
thuộc họ Cúc. Nó có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Mỹ, nhưng nó đã được lan rộng ở
vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và giữa các vùng ôn đới trên toàn thế giới. Cây cúc mui
là một loại cây thân cỏ, mọc lan bò (procumbens) và dược tính của nó rất có giá trị.
Từ thuở xa xưa con người đã biết sử dụng các cây cỏ để làm thuốc phòng chữa
bệnh và bảo vệ sức khỏe. Cùng với sự tồn tại và phát triển của lịch sử loài người,
những kinh nghiệm nghiên cứu, sử dụng dược liệu để làm thuốc phòng chữa bệnh
cũng ngày một phát triển. Trong sự nghiệp chăm sóc sức khỏe hiện nay, cây thuốcdược liệu càng được quan tâm và phát triển mạnh mẽ hơn. Theo số liệu thông kê gần
đây ở nước ta có hơn 3.800 loài cây làm thuốc trên tổng số hơn 10.600 loài thực vật.
Hàng năm cả nước sử dụng khoảng 50.000 tấn dược liệu (http://duoclieu.net/caythuo
cvn2.html, ngày 20/8/2113). Với số lượng lớn như vậy có rất nhiều cây thuốc, vị thuốc
còn xa lạ với người dùng, hoặc nghe nhắc đến nhiều nhưng chưa hiểu đầy đủ về
chúng.
Ngày nay, dân số thế giới đang gia tăng với tốc độ đáng báo động, và một loạt
các vấn đề mới về sức khỏe tăng lên. Ví dụ, số lượng các vi khuẩn kháng thuốc tăng
lên là một nguyên nhân khá được quan tâm. Sự nghiên cứu về thuốc kháng sinh và các
sản phẩm tự nhiên khác từ vi sinh vật là quan trọng trong cuộc chiến toàn cầu chống
lại vấn đề ngày càng tăng của việc kháng kháng sinh. Vì vậy, để đối phó với số lượng
ngày càng tăng của mầm bệnh kháng thuốc, vi khuẩn nội sinh (VKNS) có thể phục vụ
như là một nguồn tiềm năng của thuốc kháng sinh mới.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
1
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Hiện nay, việc nghiên cứu và ứng dụng các dòng VKNS thực vật đã và đang là
những đề tài được nghiên cứu rộng rãi trên khắp thế giới. Tập đoàn vi sinh vật nội sinh
hoặc sống ở vùng rễ cây trong đó có cây dược liệu có khả năng giúp cây tăng trưởng
và đồng hóa tốt. Ngoài ra chúng còn có khả năng sản xuất trực tiếp các hợp chất kháng
khuẩn tự nhiên (Strobel, 2003) nhưng chúng cũng có khả năng kích thích cây chủ sản
xuất ra các hợp chất biến dưỡng trung gian như ở cây dược liệu chúng có thể sản xuất
ra các hợp chất có tính kháng khuẩn rất tốt (Hardoim et al., 2008). Nhiều nghiên cứu
từ các cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Sài đất (Wedelia calendulacea,
Less), cây Diếp cá (Houttuynia cordata, Thunb), cây Diệp hạ châu (Phyllanthus
urinaria, Less)… đã được nghiên cứu chứng tỏ chúng có hoạt tính kháng khuẩn nhờ
chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyde và các dẫn xuất ceton như methyl nnonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất α-pinen,
camphen,… có tác dụng trên các vi khuẩn Streptococcus pneumonia, Staphylococcus
aureus, Shigella, Salmonella, E. coli (Đỗ Tất Lợi, 2006;) vì nguyên liệu làm thuốc từ
các cây cỏ rất ít độc, rẻ tiền, dễ kiếm mà hiệu quả cao, sử dụng đơn giản, thân thiện
với môi trường và giúp hạn chế điều kiện kháng thuốc. Vì vậy, đề tài: “Phân lập vi
khuẩn nội sinh trong cây cúc mui (Tridax procumbens) ở Cần Thơ” nhằm nghiên
cứu các tác động có ích và khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội trong cây
dược liệu nói chung và cây cúc mui nói riêng ở thành phố Cần Thơ.
1.2 Mục tiêu của đề tài
Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui
(Tridax procumbens) có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và có khả
năng kháng khuẩn.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
2
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Thành phố Cần Thơ
2.1.1 Sơ lược về thành phố Cần Thơ
Cần Thơ là một thành phố trực thuộc trung ương, nằm bên hữu ngạn của sông
Hậu, thuộc vùng đồng bằng sông Cửu Long. Đây là một trong 5 thành phố trực thuộc
trung ương của Việt Nam. Ngày 24 tháng 6 năm 2009, thành phố Cần Thơ chính thức
được Thủ tướng Chính phủ ra quyết định công nhận là đô thị loại 1 của Việt Nam
thuộc vùng kinh tế trọng điểm của vùng đồng bằng sông Cửu Long và là vùng kinh tế
trọng điểm thứ tư của Việt Nam (http://cantho.gov.vn, ngày 23/11/2013).
2.1.2 Vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên của thành phố Cần Thơ
Về vị trí địa lý: Thành phố Cần Thơ nằm ở vùng hạ lưu của Sông Mê Kông và
ở vị trí trung tâm đồng bằng châu thổ Sông Cửu Long, nằm cách thành phố Hồ Chí
Minh 169 km, cách thành phố Cà Mau 178 km, cách thành phố Rạch Giá 128 km, cách
biển khoảng 100 km theo đường sông Hậu.
Cần Thơ có tọa độ địa lý 105o13’38” - 105o50’35” kinh độ Đông và 9o 55’08” 10o19’38” vĩ độ Bắc, trải dài trên 55 km dọc bờ Tây sông Hậu. Phía bắc giáp tỉnh An
Giang, phía đông giáp tỉnh Đồng Tháp và tỉnh Vĩnh Long, phía tây giáp tỉnh Kiên
Giang, phía nam giáp tỉnh Hậu Giang. Diện tích nội thành là 53 km². Thành phố Cần
Thơ có tổng diện tích tự nhiên là 1.409,0 km², chiếm 3,49% diện tích toàn vùng và dân
số vào khoảng 1.200.300 người, mật độ dân số tính đến 2011 là 852 người/km². Cần
Thơ cũng là thành phố hiện đại và lớn nhất của cả vùng hạ lưu sông Mê Kông
(http://cantho.gov.vn, ngày 23/11/2013) (Hình 1).
Chuyên ngành Vi sinh vật học
3
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Hình 1: Bản đồ hành chính thành phố Cần Thơ
(*Nguồn:http://cantho.gov.vn/wps/wcm/connect/sotnmt/sub+site/sitemenu/linhvucquanly/datdai/can+th
o-qhsdd+den+nam+2020, ngày 30/07/2013)
Về điều kiện tự nhiên: Thành phố Cần Thơ nằm toàn bộ trên đất có nguồn gốc
phù sa sông Mê Kông bồi đắp và được bồi lắng thường xuyên qua nguồn nước có phù
sa của dòng sông Hậu. Địa chất trong thành phố được hình thành chủ yếu qua quá trình
bồi lắng trầm tích biển và phù sa của sông Cửu Long, trên bề mặt ở độ sâu 50 mét có
hai loại trầm tích là Holocen (phù sa mới) và Pleistocene (phù sa cổ).
Địa hình nhìn chung tương đối bằng phẳng, phù hợp cho sản xuất nông, ngư
nghiệp, với độ cao trung bình khoảng 1 - 2 mét dốc từ đất giồng ven sông Hậu, và
sông Cần Thơ thấp dần về phía nội đồng tức là từ phía đông bắc sang phía tây nam.
Bên cạnh đó, thành phố còn có các cồn và cù lao trên sông Hậu như Cồn Ấu, Cồn
Khương, Cồn Sơn, Cù lao Tân Lập. Thành phố Cần Thơ có 3 dạng địa hình chính là
Địa hình ven sông Hậu hình thành dải đất cao là đê tự nhiên và các cù lao ven sông
Hậu.
Ngoài ra do nằm cạnh sông lớn, nên Cần Thơ có mạng lưới sông, kênh, rạch khá
chằng chịt. Vùng tứ giác Long Xuyên, thấp trũng, chịu ảnh hưởng lũ trực tiếp hàng
năm. Đồng bằng châu thổ chịu ảnh hưởng thủy triều cùng lũ cuối vụ.
Cần Thơ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, ít bão, quanh năm nóng ẩm,
không có mùa lạnh. Mùa mưa kéo dài từ tháng 5 đến tháng 11, mùa khô từ tháng 12
tới tháng 4 năm sau. Nhiệt độ trung bình năm khoảng 28°C, số giờ nắng trung bình cả
năm khoảng 2.249,2 giờ, lượng mưa trung bình năm đạt 1600 cm. Độ ẩm trung bình
Chuyên ngành Vi sinh vật học
4
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
năm giao động từ 82% - 87%. Do chịu ảnh hưởng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có lợi thế
về nền nhiệt độ, chế độ bức xạ nhiệt, chế độ nắng cao và ổn định theo hai mùa trong
năm (http://cantho.gov.vn, ngày 23/11/2013).
Các lợi thế này rất thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển của sinh vật, có thể tạo
ra một hệ thống nông nghiệp nhiệt đới có năng suất cao, với nhiều chủng loại cây con,
đặc biệt là các cây cỏ hoang dại có tác dụng làm thuốc chẳng hạn như cây cúc mui
(Tridax procumbens).
2.2 Sơ lược cây cúc mui (Tridax procumbens)
2.2.1 Phân loại thực vật (Amita et al., 2012)
Giới : Thực vật
Ngành phụ: Tracheobionta (Thực vật có mạch)
Phân loại: Magnoliophyta (Thực vật có hoa)
Lớp: Magnoliopsida (Cây song tử diệp)
Lớp phụ: Asteridae
Bộ: Asterales
Họ: Asteraceae (Cúc)
Giống (chi): Tridax
Loài: Tridax procumbens (L.)
Tên khác: Cúc mui, Sài lan, Sài lông, Thu thảo
Hình 2: Cây cúc mui (Tridax procumbens)
(*Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Tridax_procumbens, ngày 01/08/2013)
Chuyên ngành Vi sinh vật học
5
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
2.2.2 Mô tả cây cúc mui (Amita et al., 2012)
Cây cúc mui là cây thân thảo sống lâu năm.
Thân cao từ 30 - 50 cm, có lông trắng dày, phân nhánh, mọc bò sát mặt đất.
Lá lá đơn, mọc đối, có lông ở cả hai mặt, mép có răng to, nhọn, không đều.
Cụm hoa hình đầu, mọc ở ngọn thân, trên một cán dài 20 - 30cm. Hoa cái hình
môi, màu trắng; hoa lưỡng tính hình ống, màu vàng.
Quả bế còn lông, mào lông do 10 lông to dài và 10 lông ngắn.
Đài hoa được tạo thành bởi các vảy hoặc mào lông ngắn lại.
Hạt rơi xuống phôi và không có phôi nhũ.
Cây ra hoa, kết quả tháng 4 - 6 và tháng 8 - 12.
Hình 3: Hoa cây cúc mui ở Hyderabad, Ấn Độ
(*Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Tridax_procumbens, ngày 01/08/2013)
Bộ phận dùng: Toàn cây - Herba Tridacis Procumbentis.
2.2.3 Vùng phân bố, thu hái và nhân giống cây cúc mui
Cây gốc ở Trung Mỹ được truyền vào nước ta, nay mọc hoang ở bờ đường, bãi
cỏ, đất hoang, đồi núi. Để làm thuốc, thu hái toàn cây quanh năm, dùng tươi hay phơi
khô (http://danhydatviet.vn/vi/news/Duoc-lieu/Cuc-mui-5441/, ngày 24/11/2013).
Nó không thể vi nhân giống bằng các cách thức như ở thực vật ví dụ như cắt. Sự
nhân giống thông qua các hạt gây ra các biến thể. Các phương pháp đã được phát triển
để bảo tồn sự di chuyển của chúng thông qua phương pháp vi nhân giống (Saini et al.,
2008). Cây cúc mui phân bố rộng rãi là do thân sản xuất nhiều hạt và phát tán
(Chauhan và Germination, 2008). Không giống như các cây lâu năm, cây cúc mui
không có bất kỳ phương tiện phát tán, vì vậy nó được phân tán gần như hoàn toàn
Chuyên ngành Vi sinh vật học
6
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
bằng hạt của nó. Các chùm của lông trên quả bế cho phép chúng được phát tán theo
gió.
2.2.4 Đặc tính sinh học
Cây cúc mui là loài thảo dược lâu năm sinh sản bằng hạt và yêu cầu phải được
tiếp xúc đầy đủ cho sự phát triển. Các loại thảo mộc này chịu được hạn hán, nhiệt độ
và độ ẩm, ô nhiễm môi trường, bờ biển, độ dốc và gió (Amita et al., 2012).
2.2.5 Thành phần hoá học
Một số thành phần hóa học đã được nghiên cứu từ cây cúc mui như: alkaloid,
flavonoid, carotenoid, β-sitisterol, n-hexane, acid fumaric, luteolin, quercitin, oxoester,
acid lauric, myristic, palmitic, arachidic, acid linoleic và tannin…(Singh và Ahirwar,
2010). Trước đây, nó đã được báo cáo về sự hiện diện của dexamethasone, luteolin,
glucoluteolin, betasitosterol và quercitin (Reddy et al., 2006; Subramanian et al.,
1968).
Acid linolenic cũng đã được báo cáo trong các phần ở phía trên của cây. Hai
polysaccharide tan trong nước; WSTP - IA và WSTP - IB có chứa chuỗi chính β - (1 6) - D - Galactan cũng đã được tinh chế từ lá của cây (Raju và Davidson, 1994). Sự
xác định một số sterol bằng GC - MS và các thành phần lipid của cây cúc mui cũng đã
được báo cáo. Một flavonoid mới "Procumbenetin" được phân lập từ các bộ phận phía
trên của cây đã được mô tả là 3,6 dimetoxy - 5,7,2',3',4' - pentahydroxyflavone 7 - O β - glucopyranoside (Singh và Ahirwar, 2010).
Thành phần khoáng chất được nghiên cứu từ lá của cây cúc mui có chứa calci,
magie, kali, natri và selen. Nó đã được quan sát thấy rằng có thể phục vụ như một
nguồn cung cấp protein thực vật và bổ sung kali, cũng như là nguồn tiềm năng của tiền
chất vitamin A (caroten) cho người dân (Chen et al., 2008; Jude et al., 2009).
Bốn terpenoid mới cùng với bis-bithiophene đã được báo cáo từ Tridax
procumbens là acetate taraxasteryl, beta-amyrenone, acid lupeol và oleanolic (Ali và
Jahangir,
2002).
Hai
flavon
mới,
8,3'-dihydroxy-3,7,4'-trimethoxy-6-O-β-D-
glucopyranosyl flavone (1) và 6,8,3'-trihydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavone (2) được
phân lập từ Tridax procumbens Linn., cùng với bốn hợp chất đã được biết là puerarin
(3), esculetin (4), acid oleanolic (5) và acid betulinic (6) (Hình 4). Các cấu trúc của hai
flavon mới đã được giải thích dựa trên phân tích hóa học và phương pháp quang phổ
Chuyên ngành Vi sinh vật học
7
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
(IR, 1D và 2D NMR, ESIMS, HR-ESI-MS). Các hoạt động chống oxy hóa của hai
flavon mới được đánh giá bằng hai phương pháp 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
(DPPH) hoạt động loại bỏ triệt để gốc tự do và các xét nghiệm làm giảm năng lượng
chống oxy hóa của sắt (FRAP), và các dữ liệu cho thấy các hợp chất (1) và (2) có hoạt
động chống oxy hóa nhất định, với các hoạt động chống oxy hóa của hợp chất (2) là
mạnh hơn so với hợp chất (1). Có thể thấy rằng các phân tử 1 có cấu trúc taraxasteryl
acetate, hình dạng của các mảnh triterpene trong số đó thực tế cũng giống như của
taraxasterol acetate (Runsheg et al., 2010).
Hình 4: Các cấu trúc của các hợp chất (1- 6)
(*Nguồn: www.ijpbs.net/vol-3/issue-1/bio/P% 20 -% 2061.pdf, ngày 04/08/2013)
Cây cúc mui giàu natri, kali và calci (Jude, 2009). Lá của nó chủ yếu chứa
protein thô 26%, chất xơ thô 17%, và carbohydrate hòa tan 39%, calcium oxide 5%.
Acid oleanolic cũng thu được với số lượng nhiều từ cây cúc mui và nó được cho là
một tác nhân trị đái tháo đường tiềm năng khi thử nghiệm với a-glucosidase (Verma et
al., 1998; Ali và Jahagir, 2002).
Chuyên ngành Vi sinh vật học
8
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
2.2.6 Dược tính
Cây cúc mui đã được biết đến với một số hoạt động điều trị tiềm năng như tác
động bảo vệ gan, khả năng điều hòa miễn dịch, hứa hẹn hoạt động chữa lành vết
thương, chống tiểu đường, hạ huyết áp, giảm sưng tấy do côn trùng cắn, chống viêm
và chống oxi hóa, viêm phế quản, kiết lỵ và tiêu chảy. Cây cúc mui cũng ngăn rụng tóc
và được sử dụng như một loại thuốc bổ tóc (Nazeruddin et al., 2011).
Hoạt động kháng khuẩn
Toàn bộ cây cúc mui đã được báo cáo cho hoạt động kháng khuẩn của nó trên
nhiều loài vi khuẩn. Dịch chiết cây tươi được sử dụng hai lần một ngày trong 3-4 ngày
để chữa trị các vết đứt và vết thương. Chiết xuất của cả cây cúc mui cho thấy hoạt tính
kháng khuẩn chỉ chống lại Pseudomonas aeruginosa. Bốn chủng vi khuẩn được sử
dụng trong thử nghiệm là cả vi khuẩn gram dương và gram âm Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus và cả hai vi khuẩn gram âm Escherichia coli và Pseudomonas
aeruginosa (Mahato và Chaudhary, 2005). Theo nghiên cứu của Bharathi et al., 2012
đã xác định hoạt động kháng khuẩn của chiết xuất methanolic và ethyl acetate từ lá của
cây cúc mui có khả năng chống lại Echerichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Salmonella typhi, Bacillus cereus, Staphylococcus eureus. Chiết xuất n-hexane từ hoa
cây cúc mui cho thấy hoạt động chống Bacillus cereus và Klebsiella sp, chiết xuất ethy
acetate ở những phần phía trên của hoa cây cúc mui chỉ chống lại Mycobacterium
smegmatis và Staphylococcus aureus. Chiết xuất n-hexan của tất cả những phần phía
trên của cây cúc mui đã được báo cáo về hoạt động chống Mycobacterium smegmatis,
Escherichia coli, Salmonella nhóm C và Salmonella paratyphi (Taddei và Rosas,
2000).
2.2.7 Công dụng, chỉ định và phối hợp
Thường được dùng trong phạm vi dân gian làm thuốc sát trùng, chữa sưng tấy
thay vị Sài đất. Ở Campuchia, cây dùng làm thuốc giải nhiệt, trị ho và đau thấp khớp.
Ngày dùng 20 - 30g, sắc nước uống (http://danhydatviet.vn/vi/news/Duoc-lieu/Cucmui-5441/, ngày 24/11/2013).
Chuyên ngành Vi sinh vật học
9
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
2.3 Giới thiệu về vi khuẩn nội sinh
2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh
Endophytes, theo định nghĩa là các vi sinh vật (VSV) (chủ yếu là nấm và vi
khuẩn) sống trong mô của cây còn tươi cả đời hoặc một phần chu kỳ sống của chúng
mà không gây ra các triệu chứng có hại rõ ràng cho các cây chủ (Sturz et al., 2000;
Wellington và Marcela, 2004). Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập
trung vào các hoạt động sinh học của nấm nội sinh và vi khuẩn nội sinh (Strobel,
2003). Bởi vì sống trong một môi trường tương đối ổn định - trong mô thực vật,
endophytes có thể sản xuất được nhiều hoạt tính sinh học hơn các vi khuẩn vùng rễ
hoặc bất kỳ vi khuẩn khác mà được phân lập từ bề mặt cây trồng hoặc từ đất (Dowler
và Weaver, 1974; Andrews, 1992). Là một thành viên của endophytes, VKNS cũng đã
được quan tâm nhiều hơn về hoạt động sinh học đối kháng của chúng bao gồm cả kiểm
soát sinh học của các bệnh thực vật, kích thích tăng trưởng thực vật, và cố định
đạm…(Harris et al., 1994; Chen et al., 1995; Cui et al., 2003; Qiao et al., 2006).
Vi khuẩn nội sinh được tìm thấy hầu hết ở các loài thực vật, chúng cư trú ở trong
nội mô của thực vật ký chủ và giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác
nhau như cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh… Hầu hết các dạng nội
sinh này bắt đầu xuất hiện từ vùng rễ hay bề mặt lá, tuy nhiên, một số loại có thể ký
sinh trên hạt. Vi khuẩn nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng
vai trò là một tác nhân điều hòa sinh học. Vi khuẩn nội sinh sản xuất hàng loạt các sản
phẩm tự nhiên có lợi cho thực vật ký chủ mà ta có thể khai thác những tác nhân đó để
ứng dụng trong y học, nông nghiệp hay công nghiệp. Ngoài ra nó còn có tiềm năng
loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong đất bằng cách tăng cường khả năng khử độc trên
thực vật và làm cho đất trở nên màu mỡ thông qua chu trình phosphate và cố định
đạm. Ngày càng có nhiều quan tâm trong việc phát triển các ứng dụng tiềm năng công
nghệ sinh học của VKNS để phát triển các giống cây trồng có khả năng khử độc đồng
thời có khả năng sản xuất sinh khối và nhiên liệu sinh học.
Những tương tác có lợi giữa thực vật - vi khuẩn thúc đẩy sức khỏe, sự phát triển
của cây trồng, vấn đề này đang được các nhà nghiên cứu quan tâm. Gần đây, họ đang
nghiên cứu tiềm năng cho giải pháp nâng cao khả năng phân hủy sinh học của các chất
gây ô nhiễm trong đất. Hầu hết các nghiên cứu này tập trung vào các vi khuẩn ở rễ
(Lindow và Brandt, 2003; Kuiper et al., 2004; Berg et al., 2005). Vi khuẩn nội sinh có
Chuyên ngành Vi sinh vật học
10
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
thể được xem như là vi khuẩn tập trung trong mô thực vật mà có những dấu hiệu
nhiễm bệnh hay hậu quả tiêu cực đối với cây chủ (Schulz và Boyle, 2005). Vi khuẩn
nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trong cây trồng (Quispel, 1992). Từ
vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3 cách là: bám ở bề
mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots), thông qua lông hút,
giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như Azotbacter, Bacillus,
Beijerinckia,
Derxia,
Enterobacteriaceae
(Klebsiella,
Enterobacter,
Pantoea),
Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum,
Gluconacetobacter và Paenibacillus (Elmerich, 2007). Tuy nhiên nó cũng có thể xâm
nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị trí bị tổn thương của lá (Roos và
Hittingh, 1983). Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các VKNS có thể tập trung tại vị trí
xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các khoảng
trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002). Mật số của quần thể
VKNS rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây
chủ; nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi
trường (Pillay và Nowak, 1997; Tan et al., 2003).
Một số nhóm VKNS không gây hại hay gây bệnh cho cây chủ, mà trái lại chúng
có thể thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kích thích sự
sinh trưởng thực vật và sự cố định đạm từ không khí (Sturz et al., 2000). Hơn nữa, một
số dòng VKNS có thể cải thiện sự phát triển bệnh (Benhamou et al., 1996) và kích
thích sự chống chịu của cây trồng đối với sự tác động của các nhân tố vô sinh và hữu
sinh (Hallmann et al., 1997).
Vùng rễ là nơi tiếp giáp giữa rễ thực vật và đất, là nơi lắng động các chất hữu cơ,
và là nơi xuất phát của các môi trường sống và các nguồn sống khác nhau cho các vi
sinh vật đất. Thực vật có thể thay đổi vùng rễ của chúng nhờ sự hấp thu các chất dinh
dưỡng, độ ẩm và oxy từ vùng rễ; và các chất do rễ tiết ra. Đặc tính quan trọng của các
dịch rễ là có tỉ lệ C/N cao nên có thể đẩy mạnh sự phong phú của các vi khuẩn cố định
đạm trong vùng rễ (Döbereiner, 1974). Ngược lại, vi sinh vật vùng rễ có thể ảnh hưởng
đến quá trình sinh trưởng của cây do sự tác động của chúng đến giá trị của các chất
dinh dưỡng, sự phát triển và hình thái của rễ (Harari et al., 1988). Nhờ sự đa dạng của
cây trồng và sự đa dạng của vùng rễ nên các nhà khoa học đã khám phá được nhiều
nhóm VKNS khác nhau từ các loại cây khác nhau.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
11
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Các vi khuẩn vùng rễ làm tăng sự hấp thu dinh dưỡng và sự chuyển hóa các chất
trong các cây còn non (Rovira et al., 1983). Azospirillum brasilense đã thúc đẩy sự
phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ ở Panicum miliaceum
(Harari et al., 1988). Vi khuẩn nốt rễ sống trong rễ lúa giúp cây hấp thu nhiều nitơ, lân,
kali và sắt tăng từ 10 - 64% (Biswas et al., 2000). Chaintreuil et al. (2000) đã phát hiện
những vi khuẩn nốt rễ còn sống trong rễ lúa hoang (Oryza breviligulata) ở vùng Châu
Phi và chúng có nguồn gốc từ những cây điên điển (Sesbania sp.) mọc chen lẫn với
cây lúa hoang. Như vậy vi khuẩn nốt rễ không những nội sinh ở cây họ đậu mà còn
xâm nhiễm vào cả cây hòa bản và cố định đạm sinh học cho cây.
Hơn 300.000 loại thực vật được biết trên trái đất, mỗi loài có một hay nhiều loài
VKNS (Strobel et al., 2004). Tuy nhiên chỉ có một số ít cây trồng được nghiên cứu
tường tận vì hiệu quả kinh tế của chúng và tìm thấy nhiều loài VKNS mới với nhiều
đặc tính tốt (Ryan et al., 2008). Vi khuẩn nội sinh giúp tăng cường sinh trưởng và
chuyển hóa các chất trong cây. Vi khuẩn nội sinh có thể sống bám ở bề mặt rễ, hay
chui vào rễ qua lông hút hoặc các vị trí tổn thương của cây. Sau khi xâm nhập vào cây
chủ các VKNS có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây,
vào các khoảng gian bào, vào hệ mạch (Sprent và James, 1995; Reinhold - Hurek,
1988; Zinniel et al., 2002), giúp tăng cường sự dinh dưỡng của cây bằng nhiều cơ chế
trực tiếp hay gián tiếp, bao gồm sự cố định Nitơ trong khí quyển, cung cấp khoáng
chất như phosphate tổng hợp hoocmon thực vật (Hill et al., 1972; Khalil et al., 1989;
Kloepper và Beauchamp, 1992; Kloepper et al., 1992; Hallmann et al., 1997;
Kobayashi và Palmudo, 2000; Hung và Annnapurna, 2004; Lãng Ngọc Dậu et al.,
2007). Vi khuẩn nội sinh có vai trò quan trọng trong việc cố định đạm cho cây trồng.
Thí nghiệm trên mía ở Brazil cho thấy VKNS có thể cung cấp 80 kg/ha/năm (Boddey
et al., 1995). Đây là những vi sinh vật có lợi, có vai trò quan trọng trong sự ổn định
chu trình dinh dưỡng Nitơ, bổ sung nguồn đạm cho đất và dinh dưỡng cây trồng, ổn
định năng suất mùa vụ, phát triển bền vững sinh thái (Persello - Cartieaux et al., 2003).
Nhiều VKNS trong cây lúa mùa, cây cỏ chăn nuôi, cây khóm như Azospirillum
lipoferum, Klebsiella pneumoniae, Burkholderia tropica… cũng có khả năng hòa tan
lân khó tan (Lăng Ngọc Dậu et al., 2007; Nguyễn Thị Thu Hà et al., 2009; Cao Ngọc
Điệp và Nguyễn Ái Chi, 2009). Vi khuẩn Enterobacter cloacae có khả năng tổng hợp
IAA từ tiền chất L-tryptophan (Koga et al., 1991). Vi khuẩn Azotobacter cũng có khả
Chuyên ngành Vi sinh vật học
12
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
năng tổng hợp IAA từ tiền chất L - tryptophan (Ahmad et al., 2005). Nghiên cứu của
Somers et al. (2005) cho thấy vi khuẩn Azospirillum brasilense có khả năng tổng hợp
IAA từ L - tryptophan.
Một trong những khám phá mới về VKNS là chúng có khả năng tổng hợp ra
những hợp chất chống lại mầm bệnh như vi khuẩn, nấm, tuyến trùng… gây bệnh cho
cây trồng, có thể xem những hợp chất này (phytophathogens) như là một hợp chất
kiểm soát sinh học hay đối kháng (biocontrol agents) (Berg et al., 2005). Ngoài ra,
chúng còn có thể tổng hợp ra những hợp chất tự nhiên phân hủy các hóa chất độc hại
như thuốc bảo vệ thực vật, dung môi hữu cơ…nên còn gọi là các hợp chất phân hủy
thực vật (phytoremediation) (Siciliano et al., 2001) góp phần trong việc xây dựng nền
nông nghiệp bền vững.
2.3.2 Các nhóm vi khuẩn nội sinh tiêu biểu
Ngày nay các nhà khoa học đã phát hiện nhiều nhóm VKNS trong nhiều loại cây
trồng và cả những loài thực vật hoang dại, các nhóm VKNS thường gặp sẽ mô tả dưới
đây:
2.3.2.1 Vi khuẩn Azospirillum
Vào năm 1923, Beijerinck phân lập được nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn,
và đã được Becking (1963) phát hiện lại. Đến năm 1976, Döbereiner và Day mô tả về
sự liên hợp của những vi khuẩn này với các cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác nhau.
Sau đó các vi khuẩn này được phân thành giống mới, và được gọi là Azospirillum
(Tarrand et al., 1978).
Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động và có
dạng hình que ngắn; kích thước biến thiên trong khoảng 0,8-1,7μm chiều rộng và 1,4 3,7μm chiều dài (Nguyễn Hữu Hiệp et al., 2005). Các loài Azospirillum biểu hiện sự
phân bố sinh thái vô cùng rộng lớn và được gắn liền với sự đa dạng to lớn của cây
trồng (Van Berkum và Bohlool, 1980).
Trong những năm 1984 - 1985, người ta đã phát hiện nhiều loài của giống
Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca) (Reinhold et al., 1986);
trong đó các vi khuẩn xâm nhập vào bên trong nhu mô rễ có khả năng cố định đạm,
hòa tan lân ở dạng khoáng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Seshadri et al., 2000;
Richardson, 2003), sản xuất kích thích tố thực vật (Vande Broek et al., 1999), hay
Chuyên ngành Vi sinh vật học
13
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng (Rangarajan et al., 2003). Khi Okon
và Labandera - Gonzalez (1994) phân tích tài liệu về các thử nghiệm ngoài đồng ở các
cây trồng được chủng với Azospirillum thì nhận thấy sản lượng cây trồng tăng 5 30%, cao hơn nhiều so với khi sử dụng phân bón hóa học. Sản lượng tăng là do hệ
thống rễ phát triển tốt hơn, tương quan với việc tăng tỉ lệ nước và khoáng được rễ hấp
thu.
2.3.2.2 Vi khuẩn Azotobacter
Năm 1966, Döbereiner phân lập được loài Azotobacter paspali từ các cây cỏ
đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm của bà (Döbereiner, 1974). Sự khám phá ra
vi khuẩn A. paspali là một bước quan trọng trong sự cố định đạm cộng sinh. Đây là
loài đặc hiệu cho Paspalum notatum và khoai lang. Tuy nhiên, khi Brown (1976) theo
dõi sự khử acetylene thì nhận thấy không phải lúc nào Paspalum notatum cũng được
cộng sinh với sự có mặt của A. paspali ở vùng rễ, và bà cho rằng A. paspali cải thiện
sự sinh trưởng của Paspalum notatum chủ yếu là bằng việc tạo ra các auxin hơn là
bằng sự cố định đạm.
2.3.2.3 Vi khuẩn Klebsiella
Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm γ - Proteobacteria, là vi khuẩn Gram âm, có
dạng hình que, không hay ít chuyển động, kết nang, sống kỵ khí không bắt buộc. Có 2
loài quan trọng là Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca. Vi khuẩn Klebsiella
thường xuất hiện tự nhiên trong đất, một số xâm nhập vào cây trồng và sống nội sinh
trong cây. Có khoảng 30% các dòng của 2 loài này có thể cố định đạm trong các điều
kiện kỵ khí (http://en.wikipedia.org/wiki/Klebsiella, 24/11/2013).
Theo Lü và Song (2001), vi khuẩn Klebsiella oxytoca dòng SG-11 được phân lập
từ rễ lúa là vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật nhờ vào khả năng cố định đạm từ
nitơ không khí và khả năng tổng hợp IAA từ tryptophan theo lộ trình indole -3pyruvic acid của chúng.
Ở Ấn Độ, Jha và Kumar (2007) nghiên cứu vi khuẩn K. oxytoca dòng GR - 3
được phân lập từ rễ và thân của cây cỏ đuôi mèo (Typha australis) thì nhận thấy chúng
có mật số ở rễ là 6x106 CFU/g, khả năng tổng hợp IAA từ tiền chất tryptophan là
30μg/mg trọng lượng khô, khả năng hòa tan lân khó tan là 31,5 μg/mg trọng lượng
khô, và mức độ biểu hiện hoạt tính của phức hệ nitrogenase qua phản ứng khử
acetylene là khá cao (1,25μmol C2H4/mg protein/h). Sau đó, các nhà nghiên cứu sử
Chuyên ngành Vi sinh vật học
14
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
dụng vi khuẩn K. oxytoca dòng GR - 3 chủng cho giống lúa Malviya dhan - 36 thì
nhận thấy vi khuẩn này giúp gia tăng toàn bộ chiều dài cây và tăng hàm lượng
chlorophyll - a có hiệu quả; đồng thời chúng còn kích thích sự thành lập rễ bên và rễ
bất định cho cây.
2.3.2.4 Vi khuẩn Enterobacter
Vi khuẩn Enterobacter cũng thuộc nhóm γ - Proteobacteria, hầu hết là vi khuẩn
Gram âm, có dạng hình que, sống kỵ khí không bắt buộc. Một số loài của vi khuẩn này
sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật có khả năng cố định đạm, là vi
khuẩn kích thích sự sinh trưởng thực vật (http://en.wikipedia.org/wiki/Enterobacter,
24/11/2013).
Hwangbo et al. (2003) đã phân lập được loài Enterobacter intermedium từ vùng
rễ của một số cây cỏ ở Triều Tiên, chúng có khả năng hòa tan các phosphate khó tan
để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng cách sản xuất hợp chất 2-ketogluconic
acid.
2.3.2.5 Vi khuẩn Burkholderia
Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn cố định đạm, Gram âm, dạng hình que ngắn,
đường kính khoảng 1 m, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu (Caballero
- Mellado et al., 2004). Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc
hiếu khí, trong môi trường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất. Trong môi trường nuôi
cấy, chúng tạo thành các khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng 2-4
cm, tròn, phẳng hoặc lài (Caballero - Mellado et al., 2004; 2007). Vi khuẩn này có khả
năng cố định đạm và tạo nốt sần trong những cây họ đậu nhiệt đới (Mounlin et al.,
2001). Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định
đạm, kích thích sự tăng trưởng của cây, hiện diện trong vùng rễ và rễ của nhiều loại
cây như: bắp, mía, cà phê, lúa (Scarpella et al., 2003). Hiện nay người ta tìm được
khoảng hơn 40 loài Burkholderia (Martinez - Aguilar et al., 2008) bao gồm vi khuẩn
cố định đạm trong đất, rễ cây, đẩy mạnh các giai đoạn phát triển của cây (Coenye và
Vandamme, 2003; Osullivan và Mahenthiralingam, 2005).
Chuyên ngành Vi sinh vật học
15
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
2.3.2.6 Vi khuẩn Pseudomonas
Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự biến dưỡng
dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường
khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Trong số những loài
Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh
học.
Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di
động nhờ roi ở đầu và không có bào tử. Các đặc điểm sinh lý là dị dưỡng, không lên
men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen (http://vi.wiki
pedia.org/wiki/Pseudomonas, 24/11/2013).
Một số chủng Pseudomonas có ảnh hưởng quan trọng trong sự sinh trưởng và
phát triển thực vật như tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như: auxin,
cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng hấp thu chất
dinh dưỡng trong đất ở một số loài như: Pseudomonas putida, Pseudomonas
fluorescens, Pseudomonas syringae (Glickmann et al., 1998). Khả năng phân giải
phosphat. Trong rác ủ, phospho tồn tại ở nhiều dạng hợp chất khác nhau. Phospho
được tích luỹ trong rác khi động thực vật chết đi, những hợp chất phospho hữu cơ này
được vi sinh vật phân giải tạo thành các hợp chất phospho vô cơ khó tan. Do đó
phospho tồn tại ở hai dạng: phospho hữu cơ và phospho vô cơ. Vi sinh vật hòa tan lân
hữu cơ chủ yếu thuộc hai chi: Bacillus và Pseudomonas. Các loài có khả năng phân
giải mạnh là B. megatherium, B. mycoides và Pseudomonas sp.
Trong số các loài Pseudomonas spp., P.fluorescens là được chú ý nghiên cứu
hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại mầm bệnh phát sinh từ đất, nó còn
có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng (Nguyễn Trọng Thể, 2004).
* Pseudomonas fluorescens:
Pseudomonas fluorescens là vi khuẩn hình que, Gram âm, sống trong đất, thực
vật và cả trên mặt nước. Nhiệt độ phát triển tối ưu từ 25 - 30oC. Chủng Pf-5 trong vùng
rễ của cây trồng và sản xuất nhiều loại chất chuyển hóa thứ cấp bao gồm thuốc kháng
sinh chống lại đất chịu tác nhân gây bệnh (Paulsen et al., 2005). Chủng Pseudomonas
fluorescens SBW25 phát triển trên lá cây và rễ nơi chúng có thể đóng góp vào sự tăng
trưởng thực vật. Tầm quan trọng của những sinh vật này đã tăng lên vì khả năng phân
huỷ các chất ô nhiễm khác nhau và sử dụng chúng như kiểm soát sinh học chống lại
Chuyên ngành Vi sinh vật học
16
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
tác nhân gây bệnh. Pseudomonas fluorescens là một loài vi khuẩn thú vị và quan trọng
để nghiên cứu vì nó tạo ra một kháng sinh đặc biệt (mupirocin) đã được chứng minh
có hiệu quả trong điều trị một số loại da, tai, và các rối loạn mắt (http://microbewiki.
kenyon.edu/index.php/Pseudomonas fluorescens, 24/11/2013).
2.3.2.7 Vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Bacillus có dạng hình que, Gram dương, di động bằng roi, có kích
thước 2-3 x 0,7-0,8µm, nội bào tử ở trung tâm có kích thước 1,5-1,8 x 0,8 µm. Vi
khuẩn B. subtilis cũng được tìm thấy có khả năng tiết ra một số hợp chất diệt khuẩn và
diệt nấm. Sản phẩm các kháng sinh được tiết ra là difficidin, oxydifficidin, bacitracin,
bacillin, bacilomycin B có khả năng kháng các loài vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí (Claus
và Berkeley, 1986). Bên cạnh đó, Wei Sheng Wu Xue Bao (1998) đã phân lập và nhận
diện được một số dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis, B. subtilis, B. azotoformans, B.
cereus, B. pumilus, B. brevis, B. megaterium, B. firmu có khả năng cố định đạm ở
vùng rễ cây gạo.
Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử
dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,… một vài loài
có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; một vài loài như Bacillus
megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid
amin, vitamin B. Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 45oC, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65oC (Rosovitz et al.,
1998) .
Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 - 10 như
Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 - 6 như Bacillus acidocaldrius
(Cao Thị Hạnh, 2007).
Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…),
do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong xử lý môi trường,..
Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên:
Chuyên ngành Vi sinh vật học
17
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
*Bacillus subtilis
Bacillus subtilis, còn được gọi là trực khuẩn cỏ khô hoặc trực khuẩn cỏ, là một
loại vi khuẩn Gram dương , catalase dương tính, thuộc chi Bacillus , Bacillus subtilis
là trực khuẩn hình que, có khả năng tạo bào tử, có khả năng chịu đựng các điều kiện
môi trường khắc nghiệt. Mặc dù loài này thường được tìm thấy trong đất, tuy nhiên
nhiều bằng chứng cho thấy B. subtilis cũng tồn tại trong ruột người, động vật
(http://menvisinh.org/content/Bacillus-subtilis, 24/11/2013).
B. subtilis có thể phân chia đối xứng để tạo thành hai tế bào con (nhị phân phân
hạch), hoặc không đối xứng, tạo bào tử trong điều kiện môi trường bất lợi như hạn
hán, độ mặn, bức xạ cực cao, pH và dung môi, môi trường nghèo dinh dưỡng. Trong
môi trường sống khắc nghiệt, trước giai đoạn hình thành bào tử, các tế bào vi khuẩn có
thể tự tạo ra các chất đề kháng (kháng sinh), hoặc giết chết đồng loại để tìm kiếm dinh
dưỡng (http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis, 24/11/2013).
B.subtilis có khả năng sinh tổng hợp một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế
sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn Gram (-),
Gram (+) và nấm gây bệnh. Các sản phẩm kháng sinh được tiết ra là difficidin,
oxydifficidin, bacitracin, bacillin, bacilomycin B có khả năng kháng các loài vi khuẩn
hiếu khí và kỵ khí (Claus and Berkeley, 1986). Nghiên cứu của Stein (2005) cho thấy
tiềm năng sản sinh chất kháng sinh của B. subtilis đã được ghi nhận hơn 50 năm qua.
Theo nghiên cứu của Fernando et al. (2005), Bacillus megaterium và B. subtilis được
phát hiện là vi khuẩn nội sinh trong cây cà phê. Ngoài ra, B. subtilis cũng đã được báo
cáo là vi khuẩn nội sinh trong cây dẻ, giúp cây chống lại bệnh cháy lá do nấm
Cryphonectria parasitica gây ra (Wilhelm et al, 1998).
* Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus amyloliquefaciens là một trực khuẩn gram dương có liên quan chặt chẽ
với các loài Bacillus subtilis. Hai loài này có nhiều gen tương đồng và xuất hiện tương
tự nhau không thể phân biệt được chúng một cách trực quan (Friest et al., 1987).
Bacillus amyloliquefaciens là trực khuẩn Gram dương, hình que, di động, kích
thước 0,7 - 0,9 x1,8 - 3m, nội bào tử (0,6 - 0,8 x 1 - 1,4m), là vi khuẩn hiếu khí hay
kỵ khí, phát triển tối ưu ở pH = 7, NaCl không cần thiết cho sự tăng trưởng. Nhiệt độ
giới hạn 15 - 50o C, nhiệt độ tối ưu 30 - 40oC (http://www.tgw1916.net/Bacillus/
Chuyên ngành Vi sinh vật học
18
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
amyloliquefaciens.html, ngày 26/11/2013). Nó cũng tổng hợp protein barnase là một
loại kháng sinh tự nhiên (http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_amyloliquefaciens,
ngày 26/11/2013).
B. amyloliquefaciens FZB42 được coi là PGPR do kiểm soát sinh học và sản xuất
auxin thúc đẩy tăng trưởng thực vật (Chen et al., 2007). Bacillus amyloliquefaciens
được tìm thấy để sản xuất hỗn hợp của acid lactic, isovaleric, isobutyric, acid acetic và
cũng được báo cáo là có khả năng hòa tan lân (Idriss et al., 2002). Sushil et al. (2013)
cho rằng dòng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sks_bnj_1 thúc đẩy sự tăng trưởng
thực vật và ảnh hưởng trên đất vùng rễ của đậu tương. Mẫu phân lập được xác định
dựa vào trình tự gen 16S - rRNA cho thấy 98,7% tương đồng với dòng vi khuẩn
Bacillus amyloliquefaciens sks_bnj_1 (AY 932.823) chúng có khả năng thúc đẩy sự
tăng trưởng ở cây đậu tương như: sản xuất siderophore, indole -3- acetic acid,
deaminase ACC, phosphatases, phytase, HCN, cellulase, hòa tan kẽm và đối kháng với
các mầm bệnh trong đất gây ra. Nghiên cứu này cho thấy rằng dòng vi khuẩn B.
amyloliquefacienssks_bnj_1 cải thiện hầu hết các thuộc tính vùng rễ, cây tăng trưởng,
đồng hóa các chất dinh dưỡng và năng suất của đậu tương.
* Bacillus cereus
Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides,
Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí…
Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm
cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh
(http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus, ngày 24/11/2013).
Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 - 1,5) x (3 - 5)µm, có khi dài hơn,
chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 - 1,5)µm
nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào (Lương Đức Phẩm, 2007).
Khuẩn lạc của chúng phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm
(Nguyễn Lân Dũng, 1983).
Theo nghiên cứu của Swetha và Valli (2012) trên cây bứa mủ vàng (Garcinia
xanthochymus), Bacillus cereus sống nội sinh có khả năng diệt các chủng vi khuẩn E.
coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi và Klebsiella
pneumonia.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
19
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
* Bacillus polymyxa
Bacillus polymyxa là vi khuẩn Gram dương, có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc
lồi, trơn, nhày, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy. Tế bào của Bacillus
polymyxa có kích thước (0,6 - 1) x (2 - 7) µm, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi
ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh (Nguyễn Lân
Dũng, 1983). Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao.
Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng 1,7 - 2,6 µm, nằm giữa tế bào. Loại
vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccharide trong cây. Chúng còn có khả năng cố
định đạm. Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy
người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và những môi trường
có tính acid yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh
polymyxin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công
nghiệp dược (http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus, ngày 24/11/2013).
2.3.3 Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào bên trong cơ thể (mô) thực vật có thể sống sót
và phát triển bên ngoài môi trường và có thể có nguồn gốc từ những hạt giống và cây
con khi chúng ta phân phối hạt giống hạt cây con giống từ vùng này sang vùng khác.
Chúng nhanh chóng phát triển trong đất vùng rễ hay bề mặt rễ (Hallmann, 2001), từ
đây chúng nhân mật số và di chuyển vào trong mô thực vật bằng nhiều con đường.
Trước hết, VKNS xuất phát từ nguồn nhất định.
2.3.3.1 Nguồn gốc
Qua những kết quả thu được từ thân, lá hạt, rễ, Mano và Morisaki (2008) cho
rằng nguồn của VKNS là đất vùng rễ. Kết hợp nhiều kết quả phân lập VKNS từ rễ cây
lúa mì, bông vải, bắp ngọt, bắp đá và cải canola đều kết luận VKNS xuất phát từ đất.
Vai trò của hạt như là một nguồn của VKNS vẫn là một điều còn tranh cãi (Hallmann
et al., 1997).
2.3.3.2 Di chuyển
Theo Hallmann (2001), thường VKNS được thu hút hay di chuyển từ môi trường
bên ngoài đến cây chủ bằng cơ chế hóa hướng động hay ngẫu nhiên hoặc cả hai cơ
chế.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
20
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Rễ cây tiết ra bên ngoài một số hợp chất như là dưỡng chất để VKNS tìm đến và
quần tụ trên bề mặt rễ, ví dụ: vi khuẩn có ích Pseudomonas fluorescens và
Azospirillum brasilense hướng đến rễ lúa mì do rễ lúa mì tổng hợp và phóng thích chất
kích thích tổng hợp (Bashan, 1986). Ngoài ra, sự tiếp xúc ngẫu nhiên với rễ cây do rễ
phát triển để tìm nguồn nước hay dưỡng chất cũng là cơ hội quan trọng để vi khuẩn có
thể tiếp xúc với lông hút của rễ non.
2.3.3.3 Tiếp cận
Một hợp chất trung gian để gắn chặt VKNS vào bề mặt rễ là lectins. Đây là hợp
chất rất đặc biệt thường gặp trong các trường hợp vi khuẩn cộng sinh và giả thiết này
cũng được các nhà khoa học đề cập đến VKNS vì Duijff et al. (1997) đã chứng minh
vi khuẩn Pseudomonas fluorescens dòng WCS417r đến bề mặt rễ do một hợp chất lipo
- polysaccharide.
2.3.3.4 Xâm nhập hay xuyên thấu
Theo Hallmann (2001), có nhiều con đường chính để VKNS xâm nhập vào bên
trong mô thực vật như:
-
Các lỗ tự nhiên như thủy khổng (Hydathodes), lỗ khí khổng (stomata), lỗ rễ
(bì khổng = lenticels).
-
Lỗ từ sự ma sát với đất hay vết bệnh, vị trí hình thành rễ ngang (lateral
roots).
-
Vi lỗ (micropores).
-
Vết thương do tác động vật lý (wounds).
Tuy nhiên con đường quan trọng và có khả năng nhất là VKNS xâm nhập vào
bên trong mô thực vật là vết thương và vi lỗ hiện diện khi bắt đầu sự hình thành lông
hút, chính đây là lớp tế bào non rất dễ xâm nhập. Thêm vào đó, vết bệnh cũng có thể là
cửa ngỏ cho vi khuẩn xâm nhập vào bên trong ví dụ như trường hợp vết bệnh từ tuyến
trùng (Hallmann et al., 1997) và vết nấm bệnh do Rhizotonia solani (Mahaffee và
Kloepper, 1997).
Ngoài ra vi khuẩn có thể tiết ra enzyme cellulase để phá hủy lớp tế bào biểu bì
của rễ non để xâm nhập vào bên trong thực vật như trường hợp vi khuẩn
Gluconacetobacter diazotrophicus. Vi khuẩn xâm nhập vào thẳng bên trong nhu mô rễ
non và chúng vào thẳng những tế bào rễ.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
21
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Vi khuẩn có thể xâm nhập vào rễ lúa bằng các rãnh trong các rễ ngang của giống
Sprice, chúng tập trung vào bên ngoài và bên trong vùng nhu mô rễ và các mạch gỗ rồi
từ đây chúng khuếch tán vào thân lúa, chúng được tìm thấy trong các tế bào nhu mô lá.
2.3.3.5 Sinh sản
Mặc dù VKNS tập trung hay tiếp cận các địa điểm mà chúng có khả năng xâm
nhập vào bên trong mô thực vật nhưng mật số tương đối thấp chỉ từ 1.000 đến
1.000.000 tế bào/g mô thực vật (Hallmann, 2001), và chúng bắt buộc phải sinh sản một
số lượng tương đối lớn trước khi xâm nhập vào bên trong mô thực vật. Hurek et al.
(1994) cho rằng sự phân cắt hay sinh sản vi khuẩn Azoarcus sp. được tìm thấy bên
ngoài và cả bên trong nhu mô rễ lúa và cỏ Kallar.
2.3.3.6 Xâm nhập
Hallmann (2001) tóm tắt sự xâm nhập của VKNS vào bên trong mô thực vật
bằng 7 con đường như sau:
-
Vi khuẩn nội sinh tập trung và xâm nhập ngẫu nhiên trên bề mặt rễ non của
-
Chúng cũng có thể tập trung và xâm nhập bên dưới lớp biểu bì rễ.
-
Chúng có thể tập trung và xâm nhập ngay vết thương ở rễ do sự ma sát.
-
Vi khuẩn nội sinh có thể tập trung và xâm nhập ngay lỗ mọc các lông hút.
-
Chúng tiếp cận đầu lông hút của rễ non để di chuyển vào trong.
-
Chúng len lỏi khoảng hở giữa các tế bào rễ.
-
Chúng có thể đi theo trong quá trình hấp thu chất dinh dưỡng vào rễ qua con
cây.
đường các mạch gỗ.
Nhìn chung, VKNS có khả năng tập trung ở những vị trí đã trình bày ở phần trên
là do rễ cây tiết ra những chất dinh dưỡng cần thiết cho vi khuẩn sinh sản. Beatle và
Lindow (1995) [trích từ Hallmann, 2001] cho rằng VKNS có thể xâm nhập vào bên
trong mô lá nhờ các khẩu của lục lap, qua con đường này vi khuẩn có đủ khoảng
không thích hợp có đủ oxi cần thiết cho sự sinh trưởng trong điều kiện vi hiếu khí như
khoảng trống chứa khí ở nhu mô rễ lúa mà Rheinold et al. (1987) đã phát hiện các
VKNS sống tốt.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
22
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
2.3.3.7 Định cư
Sau khi xâm nhập vào trong nhu mô thực vật, VKNS di chuyển đến các bó mạch
gỗ để theo nước từ rễ lên các phần khác trên không của cây. Vi khuẩn nội sinh cũng có
thể tập trung sinh sống và phát triển trong các tế bào nhu mô lá, tế bào diệp lục. Ở đây
chúng có thể phát triển lâu dài hay có thể tiếp tục sinh sản và di chuyển đến các bộ
phận khác của cây.
2.3.4 Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh lên hình thái và chức năng bộ rễ
cây
Một trong những hiệu quả nổi bật của VKNS đến hình thái rễ như gia tăng số
lượng và độ dày của rễ tơ, làm tăng chiều dài của rễ trưởng thành, làm ngắn khoảng
cách giữa chóp rễ và vùng mà ở đó rễ bắt đầu kéo dài. Nguyên nhân chính của việc
kích thích hình thành rễ này là do vi khuẩn tiết các phytohormones và vì những thay
đổi hình thái của rễ. Việc kích thích sự phát triển của rễ, đặc biệt là độ dày ở vùng rễ
hoạt động nhằm làm tăng khả năng hút dinh dưỡng và hút nước của cây, tăng hô hấp
của rễ và enzyme hô hấp, làm cho rễ ăn vào đất tốt hơn và cải thiện sự phát triển của
cây, hình thành rễ, làm tăng nốt rễ, tạo những chất kích thích tăng trưởng (auxins,
cytokinins, gibberellins) (Fulchieri et al., 1993).
2.3.5 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh
Trong đất, vi khuẩn thường tập trung xung quanh rễ cây. Rễ cây tác động đến sự
phát triển của vi khuẩn, ngược lại vi khuẩn vùng rễ cũng tác động đến hoạt động thực
vật. Kết quả phân tích cho thấy dịch rễ cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn đất,
kích thích sự gia tăng của một số vi khuẩn vùng rễ, dịch rễ có tỉ lệ C/N cao, làm tăng
dồi dào vi khuẩn cố định đạm vùng rễ, còn những loại vi khuẩn này có khả năng cố
định đạm cho cây hấp thụ, thúc đẩy sự kéo dài của rễ, giải phóng chất khoáng qua việc
tiết acid, làm tăng hòa tan của lân và những nguyên tố dinh dưỡng khác cho cây hấp
thụ, có vai trò quan trọng trong phân hủy sinh học (Kloepper, 1994).
Vi khuẩn bám vào mặt rễ, xâm nhập vào bên trong rễ, phát triển trên hệ thống rễ
và nhân mật số do sự điều khiển của gen chuyên biệt. Khi mật số vi khuẩn có ích đưa
vào đủ lớn, chúng sẽ phát huy hiệu quả tích cực như cung cấp dinh dưỡng cho cây,
quan trọng nhất là đạm (Kloepper, 1994). Việc xâm nhập vào rễ là yếu tố quyết định
sự thành công trong mối quan hệ giữa thực vật và vi khuẩn, mật số của vi khuẩn phụ
thuộc vào nhiều yếu tố, nhất là môi trường vùng rễ (Elmerich và New, 2007).
Chuyên ngành Vi sinh vật học
23
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
2.3.5.1 Khả năng cố định đạm của vi khuẩn nội sinh
a. Vai trò của vi khuẩn trong chu trình nitơ
Nitơ là nguyên tố dinh dưỡng rất quan trọng đối với sinh vật bậc cao và cả vi
sinh vật. Trong không khí nitơ chiếm khoảng 78,16% thể tích của không khí, với số
lượng lớn như vậy nhưng cây trồng không thể đồng hóa được. Tuy nhiên, nhờ có hệ vi
sinh vật nên cây trồng có thể hấp thu nitơ ở dạng này. Vì vậy, chu trình nitơ là một
trong các quá trình hóa học quan trọng nhất trong đất, gồm các quá trình cơ bản sau:
- Quá trình amon hóa: Quá trình phân hủy chuyển hóa các hợp chất hữu cơ dưới
tác dụng của vi sinh vật để hình thành các hợp chất hữu cơ giản đơn là NH4+ hoặc NH3
được gọi là quá trình amon hóa.
- Quá trình nitrate hóa: NH4+ được hình thành từ quá trình amon hóa hoặc NH4+
có ở các loại phân hóa học sẽ được tiếp tục chuyển hóa thành nitrite (NO 2-) và sau đó
thành nitrate (NO3-) dưới tác dụng hệ vi khuẩn nitrite (Nitrosomonas, Nitrocystis,
Nitrosobobus, Nitrosopira) và vi khuẩn nitrate hóa (Nitrobacter, Nitrospira,
Nitrococcus).
NH4+ + 3/2 O2 → NO2- + H2O + 2H + năng lượng
NO2- + ½ O2
→ NO3- + năng lượng
- Quá trình phản nitrate hóa: Trong điều kiện có rất ít hoặc không có oxy, các
dạng nitơ hợp chất (NO3- , NO2- ) bị chuyển hóa thành nitơ phân tử dưới tác dụng vi
khuẩn khử nitrate (Pseudomonas denitrificans, Ps.acruginosa, Ps.stutzeri,…) (Nguyễn
Như Thanh, 2004).
b. Cấu tạo enzyme nitrogenase và cơ chế cố định nitơ
Những tổn thất về nitơ do quá trình phản nitrate hóa gây nên, được bù đắp lại nhờ
một quá trình sinh học đặc biệt được gọi là quá trình cố định nitơ. Nhóm vi sinh vật có
khả năng thực hiện quá trình này được gọi là các vi sinh vật cố định nitơ, chúng có khả
năng chuyển hóa nitơ phân tử trong không khí thành các hợp chất chứa nitơ và làm
giàu thêm nguồn dự trữ thức ăn chứa nitơ trong đất (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007).
Nitrogenase là một phức hợp gồm hai thành phần là protein: Protein nhỏ chứa sắt (Fe Pro), protein lớn chứa Fe và Mo (MoFe - Pro) (Trần Cẩm Vân, 2004).
Chuyên ngành Vi sinh vật học
24
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
- MoFe - Pro (thành phần I), gồm có bốn đơn vị phụ với khối lượng phân tử tổng
cộng khoảng 180.000 - 235.000 Da. Có hai nguyên tử Mo cho mỗi phân tử trong hai
cụm Mo - Fe - S và có một cụm Fe - S thay đổi.
- Fe - Pro (thành phần thứ II), gồm hai tiểu phần đồng nhất có khối lượng phân tử
khoảng 30.000 - 70.000 Da. Nó chứa một cụm sắt - sulfure (4Fe - 4S) tham gia các
phản ứng oxy hóa khử bao hàm sự biến đổi nitơ sang NH3.
Cả thành phần I và II đều mẫn cảm với oxy. Vì vậy việc chiết xuất và phân tích
Nitrogenase đều phải tiến hành trong điều kiện kỵ khí (Nguyễn Như Thành, 1990).
Phản ứng cố định đạm sinh học xảy ra được ở một số vi sinh vật là nhờ sự xúc
tác riêng biệt enzyme nitrogenase. Enzyme nitrogenase xúc tác biến đổi đạm ở thể khí
(N2) thành NH3. Đầu tiên, các loài vi khuẩn cố định đạm phá vỡ dần liên kết cộng hóa
trị bậc III của nitơ (dạng rất bền) bằng cách gắn thêm dần dần những proton [H+] vào
chúng (David et al., 2003).
Phản ứng khử nitơ dưới tác dụng của enzyme nitrogenase có thể biểu thị qua
phương trình.
N2 + 8e- + 8H+ + 16ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP +16P
Phương trình khử này gồm nhiều phương trình phản ứng kế tiếp nhau:
2[H+]
N2
2[H+]
HN=NH
ATP
ATP
2[H+]
H2N-NH2
ATP
2NH3
NH3 sẽ kết hợp với acid hữu cơ tạo thành protein
NH3 + acid hữu cơ → amino acid → protein
2.3.5.2 Khả năng hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh
Lân là nguyên tố dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây
trồng, là thành phần cấu trúc nên các phân tử đa lượng, hiện diện nhiều trong các bộ
phận non của cây và trong hạt giống. Phân lân giúp cây phân chia tế bào nhanh hơn,
cung cấp nguồn năng lượng cho cây sử dụng. Rất cần thiết ở giai đoạn đầu, lân giúp bộ
rễ phát triển mạnh, cây đâm cành mạnh, mau ra hoa, dễ đậu trái. Lân còn giúp cải thiện
phẩm chất trái làm cho thịt trái chắc hơn. Thiếu lân bộ rễ của cây sẽ kém phát triển, tốc
độ sinh trưởng của cây giảm, cây cho nhánh ít, lá mỏng, năng suất trái giảm. Cây trồng
Chuyên ngành Vi sinh vật học
25
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
chỉ có thể sử dụng được lân từ đất dưới dạng hòa tan trong dung dịch đất. Vì vậy, cây
trồng chỉ có thể hút được lân ở dạng dễ tiêu trong đất.
Hầu hết đất nông nghiệp chứa lượng lớn lân, một phần đáng kể trong đó được
tích tụ là kết quả của việc bón phân lân thường xuyên. Tuy nhiên, một lượng lớn
phosphate vô cơ hòa tan cung cấp cho đất dưới dạng phân bón hóa học thì nhanh
chóng bị cố định và trở thành dạng khó sử dụng đối với cây.
Nhiều loài vi khuẩn có khả năng chuyển hóa dạng lân khó tan trong đất như
calcium monohydrogen phosphate (CaHPO4)2, calcium monohydrogen dihydrate
phosphate (CaHPO4.2H2O), calcium orthophosphate (Ca3(PO4)2) thành dạng lân dễ tan
để cây trồng sử dụng. Đặng Thị Huỳnh Mai và Cao Ngọc Điệp (2002) đã phân lập
được vi khuẩn và nấm có khả năng chuyển hóa lân dạng khó tan trong các loại đất ở
đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Kucey et al. (1989), Rasid et al. (2004) giải thích
sự hòa tan lân dạng khó tan trong đất là do sự bài tiết các acid hữu cơ và xác định tác
nhân này làm giảm pH đất, điều này rất quan trọng trong cơ chế hòa tan lân dạng khó
tan trong đất. Sự có mặt của các acid hữu cơ như: acid lactic, acid citric, acid gluconic,
acid succinic, acid fumaric, acid acetic, acid oxalic…trong đất cao cũng là nguyên
nhân làm giảm pH đất.
Sự khoáng hóa của những hợp chất này được thực hiện bới hoạt động của nhiều
phosphatase (còn được gọi là phosphohydrolase). Những phản ứng khử phosphoryl
này liên quan đến sự thủy phân cầu nối phosphoanhydride. Phosphohydrolase acid,
không giống phosphatase kiềm, hoạt động xúc tác tối ưu ở giá trị pH từ acid đến trung
tính. Hơn thế nữa, chúng còn được phân nhóm thành phosphatase acid đặc hiệu hoặc
không đặc hiệu, liên quan đến tính đặc hiệu cơ chất của chúng. Phosphohydrolase đặc
hiệu với những hoạt tính khác nhau bao gồm 3’- nucleotidase, 5’- nucleotidase, hexose
phosphate và phytase. Một nhóm đặc hiệu của enzyme giải phóng P có thể cắt cầu nối
C-P từ phosphonate hữu cơ (Rossosilini et al., 1998).
2.3.5.3 Khả năng tổng hợp indole - 3 - acetic acid (IAA) của vi khuẩn nội
sinh.
Indole -3- acetic acid (IAA) hay còn gọi là auxin, là chất điều hòa chủ yếu của sự
sinh trưởng thực vật. IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, phân hóa
sinh mô, phát triển trái và hạt, chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
26
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật như việc cố định đạm VKNS. Ngoài ra,
vi khuẩn còn sản sinh tổng hợp auxin, cytokinin tác động đến quá trình tổng hợp
ethylene của cây, có vai trò trung tâm trong sự tăng trưởng thực vật, chất điều hòa quá
trình sinh học từ phân chia tế bào, kéo dài, phân hóa sinh mô, phát triển trái và hạt.
Nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng tổng hợp IAA (Glick, 1995).
IAA kích thích mạnh mẽ quá trình tăng trưởng và các hoạt động sinh lý trong
cây, đặc trưng nhất là quá trình sinh trưởng của cây thông qua sự tăng trưởng của các
loại tế bào. Tác động của auxin phụ thuộc vào dạng tế bào, ở các nồng độ khác nhau
như IAA kích thích đồng thời sự giãn dài trục lá mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ
chính, kích thích sự khởi đầu của rễ bên và thành lập lông rễ (Theologis và Ray, 1982;
Gray et al., 2001).
Trong tự nhiên, IAA có hai dạng: IAA liên kết (CH2-COO-R) và IAA tự do (RCH2COOH). Chỉ có IAA tự do điều khiển các hoạt động sinh lý của thực vật, đặc
trưng là sự tăng trưởng của cây qua sự tăng trưởng của tế bào (Suzuki et al., 2003).
Xét cơ chế tổng hợp IAA của vi khuẩn Pseudomonas cho thấy L-Tryptophan
đóng vai trò quan trọng, được xem là tiền chất trong lộ trình tổng hợp IAA của các
thực vật lẫn vi sinh vật. Có 3 lộ trình tiêu biểu nhất cho sự biến đổi của L- tryptophan
thành IAA đã được Koga et al., (1991) mô tả chi tiết như sau:
Lộ trình indole -3- pyruvic acid
Tryptophan indole -3- pyruvic acid indole -3- acetaldehyde IAA
Lộ trình tryptamine
Tryptophan tryptamine indole -3- acetaldehyde IAA
Lộ trình indole -3- acetamide
Tryptophan indole -3- acetamine IAA
2.3.5.4 Khả năng đối kháng sinh học của vi khuẩn nội sinh với một số vi
sinh vật gây bệnh
a. Khả năng đối kháng sinh học (biocontrol)
Vi khuẩn nội sinh có thể có khả năng làm yếu đi hay ngăn cản tác hại của các vi
sinh vật gây hại. Một trong những sự đóng góp của vi khuẩn nội sinh từ thực vật là
một vài vi khuẩn nội sinh từ những thực vật khác nhau đã cho thấy hoạt tính sinh học
tiềm năng như hoạt động kháng khuẩn (Ravikumar et al., 2010), kháng nấm (Cho et
Chuyên ngành Vi sinh vật học
27
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
al., 2007) và chống ung thư (Taechowisan et al., 2007). Một Vi khuẩn nội sinh tổng
hợp các chất hóa học có trong thực vật, nhiều loài có khả năng tổng hợp các hợp chất
có hoạt tính sinh học từ thực vật để bảo vệ chống lại các tác nhân gây bệnh và một số
các hợp chất này đã được chứng minh bằng việc khám phá ra các loại thuốc kháng
sinh hữu ích. Sự đa dạng của các hợp chất được tạo ra bởi các vi khuẩn nội sinh đã
được chứng minh để chống lại tác nhân gây bệnh và thậm chí cả bệnh ung thư ở động
vật bao gồm cả con người. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh vai trò của vi khuẩn nội
sinh trong việc ngăn chặn sự tác hại của nấm Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum
trên bông vải (Chen et el., 1995); nấm Fusarium oxysporum f. sp. pisi trên đậu pea
(Benhamou et al., 1996), Verticillium albo-atrum và Rhizoctonia solani trên khoai tây
(Nowak et al., 1995), Rhizoctonia solani trên khoai tây (Pleban et al., 1995) và lúa
(Krishnamurthy và Gnanamanickam, 1997)…Một nghiên cứu gần đây của Swetha
Sunkar et al. (2013), một loại vi khuẩn nội sinh đã được xác định là vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa được phân lập từ có khả năng chống lại một số vi khuẩn
gây bệnh như Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli và
Salmonella typhi.
Nhiều giống VKNS như Pseudomonas, Burkholderia và Bacillus (Lodewyckx et
al., 2002) được biết là những loài trong những giống vi khuẩn tổng hợp ra nhiều sản
phẩm thứ cấp bao gồm các kháng sinh, chất kháng ung thư, hợp chất hữu cơ thơm,
kháng nấm, kháng virus, kháng sâu... và những sản phẩm thứ cấp này được trích ly từ
sự lên men của những loài vi khuẩn này (Ryan et al., 2008).
b. Một số vi khuẩn gây bệnh phổ biến
* Escheriachia coli (E. coli)
Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) thuộc họ Enterobacteriaceae, họ vi khuẩn
thường trực ở trong ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí vừa là vi khuẩn cộng
sinh thường trực đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh ở đường ruột và ở
các cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997). Theo Nguyễn Như Thanh et al. (1997), E. coli
là một trực khuẩn ngắn 2 đầu tròn, kích thước 2 - 3 µm. Trong cơ thể có hình cầu trực
khuẩn đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Trong môi trường nuôi cấy, có khi
quan sát thấy những trực khuẩn dài 4 - 8 µm. Phần lớn vi khuẩn E. coli có khả năng di
động do có tiên mao ở xung quanh thân, nhưng cũng có một số chủng không có khả
năng di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
28
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Trong điều kiện bình thường E. coli khu trú thường xuyên ở phần sau của ruột, ít
khi có ở dạ dày hay đoạn đầu ruột non của động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi,
chúng phát triển nhanh về số lượng, độc lực, gây loạn khuẩn, bội nhiễm đường tiêu
hóa và trở thành nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978).
Hình 5: Vi khuẩn Escherichia coli
(*Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/File:EscherichiaColi_NIAID.jpg, ngày 17/11/2013)
*Aeromonas hydrophila
Trước đây, Aeromonas thuộc họ Vibrionaceae do chúng có một vài đặc điểm
tương tự Vibrio. Nhưng đến giữa thập niên 80 Aeromonas được tách ra một họ riêng là
Aeromonadaceae (Honerman và Moris, 2007), bởi có các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa
khác biệt như không mẫn cảm với phản ứng O/129 (150µg) ngoại trừ A. caviae (Trích
dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008).
Theo Barrow và Feltham (1993), Aeromonas chia thành 2 nhóm dựa trên khả
năng di động và ngưỡng nhiệt độ phát triển của chúng. Nhóm thứ nhất gồm: A.
hydrophila, A. sobria và A. caviae có các đặc điểm là có khả năng di động, hai đầu
hơi tròn, Gram âm, hình que ngắn, hiếu khí không bắt buộc, phát triển được ở 37oC…
nhóm thứ hai là A. salmonicida (có ba loài phụ gồm: A. salmonicada, A.
achromogenes và A. nova) có đặc điểm tương tự nhưng chúng chỉ phát triển tốt nhất ở
22oC hoặc thấp hơn và không có tiêm mao cũng như chúng không có khả năng di động
(Trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008).
Shotts và Rimler (1973), Aeromonas hydrophila có những đặc trưng sau: Gram
âm, que thẳng, kích thước khoảng 0,5x1,4 - 4,0 µm, có roi ở 2 cực cơ thể, kỵ khí, lên
men carbonate hình thành acid hoặc khí gas, oxydase dương tính, khử nitrate.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
29
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Aeromonas hydrophila khi phát triển trên môi trường đặc trưng SA sẽ cho các
khuẩn lạc có dạng tròn, hơi lồi, nhẵn và có màu vàng nhạt (Nguyễn Thị Thu Hằng,
2005).
B. Austin và D. Austin (1986), cho rằng A. hydrophila là nguyên nhân của một
vài tình trạng bệnh khác nhau như thối vây, bệnh đốm đỏ và thường liên kết với mầm
bệnh khác như A. salmonicida. Theo Lewis và Plumb (1979) cho rằng trong các chủng
vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophila được xem là chủng gây bệnh cho
cá nước ngọt quan trọng nhất, gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết ở những loài cá
nuôi và cá tự nhiên, theo Angka (1990), A. hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại
Java-Indonesia và gây tỷ lệ chết từ 80-90%. Bên cạnh đó, trong báo cáo của Saitanu et
al. (1982) đã tìm thấy vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết do bệnh nhiễm
trùng máu trên cá chép.
Hình 6: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila
(*Nguồn:http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%ADptin:Aeromonas_hydrophila.jpg, ngày
17/11/2013)
2.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật cố định đạm trên thế giới và trong
nước
2.4.1 Trên thế giới
Hiện nay người ta đã tìm
được nhiều giống VKNS như:
Azoarcus,
Enterobacter, Agrobacterium, Pseudomonas, Clavibacter, Bacillus, Brudyrhizobium,
Azospirillum, Cellulomonas, Pantoea, Klebsiella, Gluconacetobacter, Burkholderia,
Corynebacterium, Rhizobium, Herbaspirillum… ở các cây lương thực, cây hoa màu,
cây họ đậu và cây cỏ… Berg et al. (1980) nghiên cứu đặc tính sinh học của
Azospirillum cộng sinh ở cây mía giúp tăng cường hoạt tính của enzyme nitrogenase từ
đó làm tăng tỉ lệ tổng hợp đạm của cây.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
30
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Ở Thụy Điển, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy ở vùng rễ của các loài ngũ cốc và
cỏ chăn nuôi các vi khuẩn Enterobacter và Bacillus (Lindberg và Granhall, 1984).
Ở Nhật, các nhà nghiên cứu đã xác định được các VKNS Herbaspirillum có khả
năng cố định đạm ở các loài lúa hoang (Elbelatagy et al., 2001). Người ta cũng đã tiến
hành thí nghiệm chủng vi khuẩn Herbaspirillum seropedicae và giống Burkholderia
vào cây lúa, kết quả các vi khuẩn có thể cố định đạm khoảng 19% tổng số đạm cần
thiết cho cây (Verma et al., 2001).
Ở Mỹ, mất hơn 6 năm nghiên cứu ở 4 loại cây trồng (bắp, lúa miến, đậu tương và
lúa mì) và 27 loại cỏ tự nhiên khác nhau người ta đã xác định được 15 giống VKNS:
Agrobacterium, Bacillus, Bradyrhizobium, Erwinia, Cellulomonas, Clavibacter,
Corynebacterium,
Enterobacterium,
Escherichia,
Klebsiella,
Microbacterium,
Micrococcus, Pseudomonas, Rothia và Xanthomonas (Zinniel et al., 2002). Trong đó
số vi khuẩn Gram dương xấp xỉ bằng số vi khuẩn Gram âm.
Ở Ấn Độ, khi nghiên cứu ở 4 loài lúa trồng khác nhau người ta đã xác định được
VKNS Gluconacetobacter diazotrophicus có khả năng cố định đạm nhờ vào gen nif
(Muthukumarasamy et al., 2002).
Trong những năm gần đây, do sự đa dạng rất lớn và tiềm năng chưa được khai
thác của VKNS, chúng xuất hiện như một nguồn thay thế các sản phẩm có hoạt tính
sinh học tự nhiên với các ứng dụng tiềm năng trong ngành công nghiệp dược phẩm.
Do đó, VKNS đã gây sự chú ý trong ngành công nghiệp dược phẩm. Hiện nay trên thế
giới đang tập trung nghiên cứu ra các chủng VKNS từ cây thảo dược có khả năng
kháng sinh nhằm phục vụ cho ngành dược.
Hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất từ rễ, thân, lá cây cúc mui (Tridax
procumbens) đã được nghiên cứu chống lại vi khuẩn Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae và Proteus vulgaris (Gram âm), Bacillus subtilis và Staphylococcus
aureus (Gram dương) theo nghiên cứu của Aniel Kumar O. và L. Mutyala Naidu
(2011). Chu-long Zhang et al. (2009) đã phân lập được chủng VKNS từ cây thảo dược
dâm dương hoắc (Epimedium brevicornu Maxim) có khả năng ức chế mạnh các loài
Alternaria alternata, Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium dahliae, Botrytis cinerea
và Botrytis fabae, và sau khi phân tích trình tự gen 16S và thử nghiệm các đặc tính vật
lý và hóa học đã xác định được chủng Phyllobacterium. Sudipta Roy và Debdulal
Banerjee (2010) đã phân lập được các chủng VKNS từ cây dược liệu dừa cạn (Vinca
Chuyên ngành Vi sinh vật học
31
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
rosea) có khả năng tạo kháng sinh và sau khi thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn với
các vi khuẩn gây bệnh như Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Vibrio cholerae,
Escherichiae coli và Candida albicans, kết quả cho thấy chủng Vrb 46 (được cho là
tương tự như chủng Bacillus coagulans) có khả năng đối kháng với tất cả các loài vi
khuẩn gây bệnh trên.
Bacillus polymyxa nội sinh trên cây Arabidopsis thaliana có khả năng tổng hợp
kháng sinh polymyxin kháng lại cả nấm và vi khuẩn (Salme Ticmusk et al., 2005).
Theo nghiên cứu của Artidtaya et al. (2012) trên cây Phyllodium pulchellum, vi
khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sống nội sinh có khả năng diệt E.coli, Pseudomonas
aeruginosa.
Theo nghiên cứu của Sheng Qin et al. (2009) đã phân lập được một số dòng
VKNS như: Streptomyces Specialis trong rễ cây Sedum sp, Pseudomonas alni trong lá
cây Hoa môi (Callicarpa longifolia) cũng có khả năng kháng khuẩn.
2.4.2 Trong nước
Ở nước ta, việc nghiên cứu các VKNS có khả năng cố định đạm, hòa tan lân,
tổng hợp kích thích tố IAA ở các cây nông nghiệp đã được tiến hành khá nhiều trong
những năm gần đây. Tại Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học - Đại học
Cần Thơ, Nguyễn Hữu Hiệp et al. (2005) đã phân lập và nhận diện các dòng
Azospirillum bằng kỹ thuật PCR từ rễ và thân lúa hoang, lúa trồng và một số loại cỏ ở
ruộng lúa; Cao Ngọc Điệp (2005) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn nốt rễ
(Sinorhizobium fredii) và vi khuẩn Pseudomonas spp. trên cây đậu nành đã làm gia
tăng số trái và giảm số trái lép trên cây. Gần đây, Nguyễn Hữu Hiệp et al. (2008) phân
lập được một số dòng vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus nội sinh ở rễ, thân
và lá của các giống mía trồng tại huyện Cù Lao Dung và huyện Mỹ Tú, Tỉnh Sóc
Trăng.
Đến nay, Việt nam đã có nhiều công trình nghiên cứu cây dược liệu nhưng phần
lớn các nghiên cứu này chỉ tập trung khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cây dược liệu
thông qua các nghiên cứu điều trị lâm sàng. Tuy nhiên, việc nghiên cứu tập đoàn vi
sinh vật nội sinh hoặc sống ở vùng rễ cây dược liệu có khả kích thích cây phát tiển tốt
thông qua khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp hormone tăng trưởng kích
thích cây dược liệu phát triển, góp phần giảm các loại bệnh, giảm chi phí sản xuất và
đặc biệt là khả năng tổng hợp các hoạt chất kháng khuẩn của chúng khi sống nội sinh
Chuyên ngành Vi sinh vật học
32
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
với cây chưa được quan tâm nhiều. Vì vậy, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật hữu
ích này để phát triển cây dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả hơn, nhằm thay
thế các loại kháng sinh tổng hợp giúp giảm tỷ lệ kháng thuốc ở một số mầm bệnh nguy
hiểm sẽ mang nhiều ý nghĩa quan trọng trong giai đoạn hiện nay.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
33
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian nghiên cứu
- Từ tháng 06 đến tháng 07 năm 2013 tìm tài liệu và viết đề cương luận văn.
- Từ tháng 08 đến tháng 11 năm 2013 chuẩn bị vật liệu, vật dụng và thực hiện đề
tài.
- Cuối tháng 11 đến đầu tháng 12 năm 2013 hoàn thành và báo cáo luận văn tốt
nghiệp.
3.1.2 Địa điểm thực hiện
- Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, phòng Sinh hóa, Viện Nghiên cứu và Phát triển
Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
3.1.3 Vật liệu thí nghiệm
- Mẫu cây cúc mui (Tridax procumbens) gồm toàn bộ rễ, thân, lá và đất mọc
hoang ở khuôn viên trường Đại học Cần Thơ.
3.1.4 Dụng cụ và thiết bị
Sử dụng dụng cụ và thiết bị của phòng thí nghiệm Vi sinh vật có tại Viện nghiên
cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ:
- Micropipet
- Đĩa petri, ống nghiệm
- Ống trữ mẫu
- Ống đong 10ml, 100ml
- Cốc thủy tinh 10ml, 100ml, 200ml
- Kẹp, kim cấy, que trải mẫu, đèn cồn
- Lame, Lacmelle
- Máy Vortex
- Tủ cấy vi sinh vật Airstream Biosafe II - ESCO (Pháp)
- Tủ ủ vi sinh vật Binder (Đức)
- Kính hiển vi Olympus CH - 2 (Nhật)
- Máy lắc mẫu
Chuyên ngành Vi sinh vật học
34
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
- Máy PCR
- Bộ điện di
- Cân điện tử.
- Nồi khử trùng nhiệt ướt
- Máy ly tâm
- Sổ tay ghi chép số và một số dụng cụ cần thiết khác.
3.1.5 Hóa chất
- Hóa chất dùng khử mẫu: nước cất vô trùng, cồn 70o, dung dịch H2O2 3%.
- Môi trường agar PDA.
- Hóa chất dùng nhuộm Gram vi khuẩn: Iod, Fushin, Crystal violet, cồn 70o,
nước cất vô trùng.
- Hóa chất để đo IAA: FeCl3, H2SO4, K2HPO4, KH2PO4, IAA thương mại.
- Hóa chất để đo lượng đạm vi khuẩn cố định được: KCl 2M, (NH4)2SO4, phenol
nitroprusside, sodium hypochloride.
- Hóa chất dùng để trích DNA vi khuẩn đã phân lập: TE pH (8), SDS 10%,
isopropanol, ethanol (cồn) 70%, CTAB 10%/NaCl 0,7M, Proteinase K (20 mg/ml),
nước cất hai lần vô trùng, Chloroform: isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1). Dung dịch TE gồm
các thành phần sau: 1% Triton X - 100, 1M Tris HCl - 8,5, 0,5 M EDTA - 8,0, nước
cất vô trùng.
- Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng PCR nhận diện vi khuẩn đã phân lập :
PCR buffer, Taq polymerase, DNA vi khuẩn đã phân lập, nước cất hai lần vô trùng,
dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng điện di gel
chứa sản phẩm phản ứng PCR: Agarose 1,2%, TBE buffer 1X, loading buffer, thang
chuẩn PstI, ethidium bromide (EtBr).
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui
* Thu mẫu: mẫu cây cúc mui gồm rễ, thân, lá được lấy từ thành phố Cần Thơ.
Trước khi thực hiện đề tài cần lấy mẫu đất đem về phòng thí nghiệm Vi sinh vật
để đo độ pH đất.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
35
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
* Khử trùng bề mặt và phân lập mẫu:
- Rửa thật sạch bùn đất bám ở rễ, thân, lá dưới vòi nước chảy mạnh, để ráo
tự nhiên. Dùng kéo cắt rời rễ, thân, lá thành để riêng từng bộ phận trong bọc nylon
sạch, buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh (- 5oC) nếu chưa phân lập ngay.
- Khử trùng nước cất, bình tam giác (để đựng mẫu khử), eppendorf, đầu col
xanh, col vàng, môi trường PDA, cối, chày. Việc khử trùng mẫu được thực hiện trong
điều kiện vô trùng.
- Cắt các bộ phận thành những khúc nhỏ 2 - 3cm (để riêng từng bộ phận). Sau đó
cho từng bộ phận mẫu vào các cốc thủy tinh riêng biệt để tiến hành khử trùng bề mặt
mẫu: cho ethanol 70o vào cốc cho vừa ngập mẫu, lắc nhẹ (để mẫu không bị dập)
khoảng 30 giây, rửa sạch bằng nước cất, tiếp tục cho dung dịch H2O2 3% vào cốc và
ngâm trong khoảng từ 3 - 5 phút, sau đó rửa thật sạch bằng nước cất vô trùng (4 lần)
để tẩy rửa hóa chất còn thừa.
- Hút 50µl nước rửa mẫu lần cuối cùng trải trên môi trường PDA đặc (Bảng 1) và
ủ ở 30oC. Sau 2-3 ngày kiểm tra xem có vi sinh vật nào phát triển không. Nếu không
có vi sinh vật nào phát triển, chứng tỏ mẫu đã được khử trùng bề mặt sạch và những vi
khuẩn phân lập được sau này là VKNS trong cây.
- Gắp khoảng 2g mẫu rễ (hoặc thân, hoặc lá) cho vào cối vô trùng giã nhuyễn rồi
thêm 0,5 - 2ml nước cất vô trùng vào cối, để yên 10 phút, trộn và hút lấy phần dịch
trích cho vào tube eppendorf 1,5 ml, để yên 10 phút cho dịch mẫu lắng xuống và hút
100µl phần trong cho vào 900µl nước cất ; có nghĩa là đã pha loãng 10 lần, tiến hành
pha loãng 100, 10-1,10-2. Sau đó, hút 100µl dịch mẫu đã pha loãng cho vào môi trường
Nfb bán đặc (Bảng 2) trong ống nghiệm, đậy nắp lại cho vào tủ ủ, ủ ở 30oC. Sau 2 - 4
ngày, ta thấy xuất hiện vòng màu sáng (vòng pellicle), cách bề mặt môi trường 2 - 5cm
(Tran Van Van et al., 1997), đó là chứng tỏ có sự hiện diện của VKNS.
- Chuyển vi khuẩn từ môi trường bán đặc sang môi trường đặc: hút 50 µl từ lớp
màng mỏng để lấy vi khuẩn trải lên bề mặt đĩa chứa môi trường PDA đặc, trải đều và
đậy nắp lại cho vào tủ ủ, ủ ở 30oC. Sau 2 - 3 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, nhỏ, tròn
và phải nằm trên đường cấy cấy chuyển sang những đĩa khác cho tới khi quan sát dưới
kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng, chuyển mẫu đã ròng vào ống nghiệm chứa môi
trường đặc trữ ở - 5oC và được xem là một dòng vi khuẩn.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
36
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Bảng 1. Thành phần môi trường PDA
Hóa chất
Liều lượng (g/l)
Khoai tây
200
Dextrose
20
Nước cất
1000 ml
Kháng sinh
1 ml
5,6 0,2
pH
(*Ghi chú: Môi trường đặc thêm 20g agar/ l môi trường; môi trường bán đặc thêm 2g agar/ l môi
trường).
Bảng 2. Thành phần môi trường Nfb (Kireg và Dobereiner, 1984)
Hóa chất
Liều lượng (g/l)
Malic acid
5
K2HPO4
5
MgSO4.7H2
0,2
CaCl2
0,02
NaCl
0,1
KOH
4,5
FeEDTA (1,64%)
Dung dịch nguyên tố vi lượng
4 ml/l
(a)
2 ml/l
Dung dịch vitamin (b)
1 ml/l
Bromothymol blue 0,5% trong KOH 0,2N
2 ml/l
pH
5,5
(*Ghi chú: Môi trường đặc thêm 20g agar/ l môi trường; môi trường bán đặc thêm 2g agar/ l môi
trường).
3.2.2 Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn.
3.2.2.1 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc
Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập ta đồng thời tiến hành đo
kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc,
hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Tuy nhiên, đối với những
khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
37
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
3.2.2.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự
chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ
phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002).
Quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học: nhỏ 20µl nước cất vô trùng lên
kính mang vật, dùng kim cấy đã được hơ nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội
lấy một ít mẫu vi khuẩn từ khuẩn lạc trải đều lên giọt nước, đậy kính đậy vật lại và
quan sát ở độ phóng đại 400 lần, ghi nhận sự chuyển động của vi khuẩn (nếu có), quan
sát và ghi nhận hình dạng.
3.2.2.3 Nhuộm Gram
Khi mẫu đã ròng, nhuộm Gram mẫu theo các bước sau:
- Lấy 10 µl nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải
mỏng vi sinh vật trên kính mang vật.
- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính
mang vật.
- Nhỏ từ một đến hai giọt Crytal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật
đã cố định, trải đều Crystal violet bằng que cấy và để 2 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước.
- Nhỏ từ 1 - 2 giọt dung dịch Iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong một phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Rửa lại bằng cồn 70o thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sao
cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô.
- Nhỏ từ 1 - 2 giọt Fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của
Fushin.
- Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước.
- Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận
Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là mẫu
Chuyên ngành Vi sinh vật học
38
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Gram dương, có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm và tiến hành đo kích thước
tế bào vi khuẩn.
3.2.2.4 Đo kích thước vi khuẩn
Phương pháp đo kích thước vi khuẩn: đặt thước trắc vi vật kính (miếng kính đặc
biệt dài 2 cm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng 10 µm) vào bàn kính, chỉnh
cho thấy rõ ảnh của thước. Dịch chuyển thước trắc vi vật kính và thước trắc vi thị kính
(miếng kính tròn có khắc 100 vạch đặt giữa hai thấu kính của thị kính) sao cho 2 thước
song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho 1 vạch của
thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và một vạch thứ 2
nào đó của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch khác của thước trắc vi thị kính.
Đếm số khoảng của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính. Trị số mỗi
khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thức sau: x= 10µm*N/n.
Trong đó: N là số khoảng của thước trắc vi vật kính, N= 6
n là số khoảng của thước trắc vi thị kính, n= 35
x là trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính. Ta có: x = 1,7143 µm.
Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh để thấy rõ ảnh của vi mẫu.
Di chuyển mẫu vật để một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi
thị kính, tìm vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo. Đếm số khoảng thước trắc vi
nằm trong khoảng giữa 2 vạch này. Suy ra kích thước vi mẫu bằng trị số một khoảng
của thước trắc vi thị kính nhân với số khoảng đếm được.
3.2.3 Khảo sát khả năng cố định đạm của một số dòng vi khuẩn đã phân
lập.
Nguyên tắc: xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng giữa phenol và NH3 với sự
hiện diện của tác nhân oxy hoá là hypochlorite hình thành phức có màu xanh, dưới pH
kiềm. Sự hiện diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3
phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982).
Hóa chất:
- Chuẩn bị dung dịch KCl 2M :Hòa tan 15g KCl trong 100ml nước cất.
- Stock (NH4+): hoà tan 0,4717g (NH4)2S04 vào 1lít nước. Trữ dung dịch ở tủ
lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 40ml stock NH4+ để được 200ml, sau cùng được
dung dịch chứa 2µg/ml.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
39
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
- Thuốc thử phenol nitroprusside: Hoà tan 5g phenol và 0.025g nitroprusside
trong nước được 0,5 l.
- Hypocloride buffer: Hoà tan 15ml NaOCl +5g NaOH vào nước được 0,5 l.
- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường Nfb lỏng (không N).
Cho 15 ml môi trường NFb vào các ống nghiệm nắp đen khử trùng nhiệt ướt 120oC
trong 20 phút. Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại 3 lần. Nuôi các dòng trên
máy lắc 200 vòng/phút. Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 0, 2, 4, 6
(sau khi chủng).
Phương pháp định lượng:
Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g
nitroprusside hoà tan và nửa lít nước cất.
Pha buffer: Cho 15ml NaOCl có nồng độ thường (5 - 5,25%) và 5g NaOH vào
0,5 lit nước cất.
Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm.
Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 5ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 0 ml NH4+
Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 4ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 1 ml NH4+
Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 3ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 2 ml NH4+
Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 2ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 3 ml NH4+
Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 1ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 4ml NH4+
Đường chuẩn 5 ppm gồm có: 0ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 5 ml NH4+
Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn:
- Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào các eppendorf.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
Hút 1 ml dịch vi khuẩn đã ly tâm và 4ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử. Tiến
hành đo phổ OD.
Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+, đo phổ OD ở
bước sóng 636nm, sau đó vẽ trên đồ thị Excel có thể tính ra được nồng độ NH4+ trong
dịch vi khuẩn.
Các số liệu thu thập được được xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphics plus
4.0.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
40
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Hình 7: Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ NH4+
(*Ghi chú: Từ trái qua phải của hình là 0, 1, 2, 3, 4 và 5 ppm).
3.2.4 Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn đã
phân lập.
Dùng micropipette hút lần lượt 5µl dd VKNS từ mỗi ống nghiệm môi trường
tăng sinh PDA lỏng có bổ sung yeast extract 1% nhỏ lên đĩa môi trường chứa lân khó
tan (NBRIP) đặc (Bảng 3), mỗi đĩa 1 dòng, 3 lần lặp lại. Sau đó ủ ở 30oC, theo dõi sự
phát triển của chúng từ 1 - 2 ngày, dòng nào phát triển được trên môi trường NBRIP
thì có khả năng hòa tan lân khó tan. Quan sát và đo đường kính vòng halo, khuẩn lạc
mỗi ngày.
Độ hữu hiệu của các dòng vi khuẩn hòa tan lân khó tan
Hiệu quả hòa tan lân E được tính theo công thức:
Đường kính halo
E=
x 100
(C. NGUYEN và ctv, 1992)
Đường kính khuẩn lạc
Chuyên ngành Vi sinh vật học
41
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Bảng 3. Công thức môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999)
Hóa chất
Liều lượng (g/l)
Glucose
10
Ca3(PO4)2
5
MgCl2.6H2O
5
MgSO4.7H2O
0,25
KCl
0,2
Bromo
3 ml
(NH4)2SO4
0,1
pH
7,0
(*Ghi chú: Môi trường đặc thêm 20g agar/ l môi trường; môi trường bán đặc thêm 2g agar/ l môi
trường).
3.2.5 Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn đã phân
lập được.
- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb lỏng (không
Tryptophan).
- Cho 15 ml môi trường NFb vào các ống nghiệm nắp đen khử trùng nhiệt ước
121o C trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại 3 lần.
- Nuôi các dòng trên máy lắc 200 vòng/phút, trùm kín các ống nghiệm trong bọc
nylon đen để tránh IAA sinh ra bị phân hủy bởi ánh sáng.
Định lượng IAA trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng).
- Chuẩn bị thuốc thử Salkowski R2: 4,5 g FeCl3 trong 1lít H2SO4 10,8 M.
- Chuẩn bị phosphat buffer 200ml:
A: KH2PO4 0,136g/100ml nước cất
B: K2HPO4 0,174g/100ml nước cất
- Lấy 39 ml A, 61 ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, chỉnh pH 7.
- Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm nắp đen cho vào eppendorf.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
42
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút cẩn thận 1ml phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào các ống Durham.
- Thêm 2ml thuốc thử Salkowski R2 vào các ống Durham trên.
- Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn sau đó đo quang
phổ OD ở bước sóng 530 nm.
- Chuẩn bị đường chuẩn IAA: cân 0,0016g IAA tổng hợp hòa tan với 10 ml
phosphat buffer được nồng độ là 160 µg/l. Sau đó pha loãng ra các nồng độ 0; 2,5; 5;
10; 20; 30; 40; 80 µg/ml.
Hình 8: Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ IAA
(*Ghi chú: Từ trái qua phải của hình là 0, 2,5, 5, 10, 20, 30, 40 và 80 µg/ml)
- Kết quả đo phổ OD được vẽ thành đồ thị đường chuẩn IAA trên excel với trục
tung là phổ OD có giá trị từ 0 đến 3, trục hoành là nồng độ IAA có giá trị từ 0 đến 80
µg/ml.
- Kết quả đo OD của các dòng phân lập được thay vào phương trình đồ thị đường
chuẩn, từ đó suy ra được nồng độ IAA đã được vi khuẩn tổng hợp.
- Các số liệu thu thập được được xử lý bằng Excel và phần mềm thống kê
Statgraphics plus 4.0.
3.2.6 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn
-
Chuẩn bị môi trường Luria Bertani (LB) agar (Bảng 4).
-
Trải vi khuẩn gây bệnh E.coli và Aeromonas hidrophylla lên bề mặt đĩa môi
trường.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
43
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
-
Trường ĐHCT
Dùng giấy thấm đường kính 0,5 cm nhúng vào vi khuẩn nuôi đạt mật số 108 tế
bào/ml trong vài phút và đặt giấy thấm lên bề mặt môi trường đã trải vi khuẩn
E.coli.
-
Ủ 35oC
-
Quan sát khả năng tạo vòng kháng khuẩn sau 12 - 24 và 48 giờ.
-
Các số liệu thu thập được được xử lý bằng Excel và phần mềm thống kê
Statgraphics plus 4.0.
Vòng vô khuẩn được xác định bằng cách:
Vòng vô khuẩn (cm) = Đường kính vòng sáng - Đường kính khuẩn lạc
Bảng 4. Thành phần môi trường LB agar
Hóa chất
Liều lượng (g/l)
Bacto tryptone
10
Bacto yeast extract
5
NaCl
10
Cycloheximide (thuốc chống nấm)
0,01
Agar
20
pH
7
3.2.7 Nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh tiêu biểu
Sau khi kiểm tra khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn
đã phân lập được, chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và tổng hợp
IAA cao nhất để thực hiện phản ứng PCR với mồi 16S - rRNA và so sánh với dữ liệu
trên ngân hàng gene NCBI để định danh vi khuẩn.
Quy trình trích DNA nhanh theo phương pháp của (Barberio et al., 1998).
Cấy vi khuẩn từ ống trữ ròng lên đĩa Petri chứa môi trường PDA. Ủ 1 - 2 ngày
trong tủ ủ ở 30o C. Khi khuẩn lạc vi khuẩn hình thành, dùng que cấy chọn 1 - 2 khuẩn
lạc rời và đều nhau cho vào tuýp Eppendorf có chứa 20 μl nước cất hai lần.
Đun cách thủy các tuýp ở 95oC trong 10 phút. Sau đó làm lạnh các tuýp trong
nước đá xay nhuyễn thời gian 10 phút để phá vỡ tế bào vi khuẩn.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
44
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Ly tâm nhẹ hai lần, thu được dịch trích DNA của vi khuẩn.
Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ
gồm có ba bước:
Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự
sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là
94oC - 95oC trong 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation).
Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi
(primers) bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng
40oC - 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây
là giai đoạn bắt cặp (annealing).
Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase sử dụng
vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc vào độ
dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là
giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation).
Sau khi ly trích DNA từ các dòng VKNS trong cây cúc mui, phản ứng PCR gen
16S-rDNA (Lane, 1985) sử dụng đoạn mồi:
27F
5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’
1492R
5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’
Sau khi trích DNA các dòng vi khuẩn, sẽ tiến hành phản ứng PCR bằng máy
PCR Bio-Rad DNA Engine.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
45
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Bảng 5. Thành phần các chất trong phản ứng PCR
Thành phần
Thể tích (μl)
Nước cất hai lần
11,75
Buffer 10X
2,5
MgCl2
2,0
dNTP
4,0
DMSO
2,0
Primer F
0,25
Primer R
0,25
Taq
0,25
DNA vi khuẩn
2
Tổng thể tích
25
Bảng 6. Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen của vi khuẩn nội sinh
Bước phản
Tên
Số lượng
ứng
bước
chu kỳ
1
Biến tính
2
3
Nhiệt độ (oC)
Thời gian
95
5 phút
Biến tính
35
95
30 giây
Gắn mồi
35
55
30 giây
Kéo dài
35
72
1 phút
72
10 phút
Kéo dài
Chuẩn bị gel agarose 1% với thể tích 40 ml. Cân 0,4 g agarose cho vào chai nắp
xanh. Đong 40 ml dung dịch TE 1X cho vào chai và lắc nhẹ cho agarose tan đều. Đặt
chai vào lò vi sóng, đun khoảng 5 phút để cho agarose tan hoàn toàn và tạo thành dung
dịch trong suốt. Lấy chai ra để nguội khoảng 55o - 60oC rồi bổ sung 0,8 μl Ethium
bromide, lắc nhẹ đều. Rót dung dịch vào góc dưới của khuôn gel đã được chuẩn bị,
tránh tạo bọt khí. Để khoảng 45 phút cho gel nguội và đặc lại rồi lấy lược ra khỏi
khuôn.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
46
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Hình 9: Gel trước khi chụp hình DNA
Đặt khuôn gel vào bể điện di dung dịch TE buffer 1X cho ngập gel. Load các
mẫu sản phẩm PCR vào mỗi giếng với thể tích 10 μl bao gồm 8 μl mẫu trộn với 2 μl
loading buffer. Sau cùng, load 4 μl DNA thang chuẩn 100 bp vào giếng. Mở nguồn
điện, cài đặt cho thiết bị ở 95 Vol trong 80 - 90 phút. Quan sát thấy chất chỉ thị màu
xanh di chuyển gần cuối gel, tắt nguồn điện, lấy khuôn gel ra để chụp hình. Chụp hình
gel đã điện di sản phẩm PCR.
Sau khi điện di, chụp hình DNA bằng hệ thống máy Bio-Rad Universal Hood II
(Mỹ). Nếu các dòng vi khuẩn có band ở vị trí trùng với kích thước và vị trí của đối
chứng dương thì đó là dòng vi khuẩn cùng loài với đối chứng dương. Chọn 3 dòng
triển vọng nhất để giải trình tự và định danh tại Công ty Macrogen, Korea.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
47
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn
Từ rễ, thân và lá của cây cúc mui mọc hoang ở khuôn viên trường Đại học Cần
Thơ đã phân lập được 17 dòng vi khuẩn trên môi trường PDA (Độ pH đất = 5,5). Hầu
hết các dòng vi khuẩn này đều phân bố ở cả rễ, thân và lá của cây cúc mui. Vi khuẩn
phân lập được tập trung nhiều nhất ở lá là 7 dòng chiếm tỉ lệ 41,18%; kế đến ở rễ là 6
dòng chiếm tỉ lệ 35,29%; và ở thân là 4 dòng chiếm tỉ lệ 23,53%. Khi được chủng vào
môi trường NFb bán đặc và ủ trong vòng 6 ngày, các dòng vi khuẩn tạo thành vòng
pellicle màu trắng đục cách mặt môi trường khoảng 0,5cm (Hình 10), đồng thời chúng
phát triển và làm thay đổi màu môi trường NFb ban đầu. Chứng tỏ các dòng vi khuẩn
này đều có đặc tính là sinh trưởng và phát triển trong điểu kiện vi hiếu khí.
Vòng pellicle
(a)
(b)
Hình 10: Môi trường NFb bán đặc (a) và vòng pellicle xuất hiện sau khi
chủng vi khuẩn (b)
Các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA từ rễ, thân, lá của cây cúc
mui được ký hiệu lần lượt gồm các chữ cái R, T, L kèm theo thứ tự các dòng (Bảng 7).
Chuyên ngành Vi sinh vật học
48
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Bảng 7. Vị trí và địa điểm thu mẫu của các dòng vi khuẩn được phân lập từ
cây cúc mui trên môi trường PDA
STT
Dòng vi khuẩn
Vị trí phân lập
Địa điểm thu mẫu
1
R1
Rễ
Trường Đại học Cần Thơ
2
R2
Rễ
Trường Đại học Cần Thơ
3
R5
Rễ
Trường Đại học Cần Thơ
4
R6
Rễ
Trường Đại học Cần Thơ
5
R7
Rễ
Trường Đại học Cần Thơ
6
R8
Rễ
Trường Đại học Cần Thơ
7
T1
Thân
Trường Đại học Cần Thơ
8
T2
Thân
Trường Đại học Cần Thơ
9
T3
Thân
Trường Đại học Cần Thơ
10
T4
Thân
Trường Đại học Cần Thơ
11
L1
Lá
Trường Đại học Cần Thơ
12
L2
Lá
Trường Đại học Cần Thơ
13
L3
Lá
Trường Đại học Cần Thơ
14
L4
Lá
Trường Đại học Cần Thơ
15
L5
Lá
Trường Đại học Cần Thơ
16
L6
Lá
Trường Đại học Cần Thơ
17
L7
Lá
Trường Đại học Cần Thơ
4.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc
Quan sát và mô tả đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn trên môi trường
PDA đặc sau khi nuôi cấy và đã chọn được các dòng thuần cho thấy: hầu hết các dòng
vi khuẩn đều phát triển rất nhanh, thời gian để các dòng vi khuẩn phát triển thành
khuẩn lạc là 12 giờ, chậm nhất là 24 giờ; phần lớn các vi khuẩn phân lập được đều có
khuẩn lạc dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, màu trắng đục và có tính nhầy, một số ít
khuẩn lạc có dạng không đều, bìa răng cưa, độ nổi lài và có màu vàng hay hồng. Đặc
điểm màu sắc, hình dạng khuẩn lạc được thể hiện ở ( Hình 11, Bảng 8):
Chuyên ngành Vi sinh vật học
49
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Màu sắc khuẩn lạc: Phần lớn các khuẩn lạc của vi khuẩn có màu trắng đục 10/17
dòng chiểm tỉ lệ 58,81%; 2/17 dòng có màu trắng trong; 2/17 dòng có màu hồng nhạt;
2/17 dòng có màu vàng nhạt đều chiếm 11,77% và 1/17 dòng có màu vàng đậm chiếm
5,88%.
Hình dạng khuẩn lạc: Phần lớn các khuẩn lạc có dạng tròn, 13/17 dòng chiếm tỉ
lệ 76,5%; 4/17 dòng có dạng không đều chiếm 23,5%.
Độ nổi khuẩn lạc: Đa số khuẩn lạc có độ nổi mô 11/17 dòng chiếm tỉ lệ 64,7%;
các dòng còn lại có độ nổi lài 6/17 chiếm tỉ lệ 35,3%.
Dạng bìa khuẩn lạc: Các khuẩn lạc có dạng bìa nguyên gồm 12/17 dòng chiếm
70,6%; 5/17 dòng có dạng bìa răng cưa chiếm 29,4%.
Kích thước khuẩn lạc: Đường kính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập
được có kích thước dao động từ 2 - 8 cm sau khi cấy trên môi trường PDA và ủ ở 30oC
khoảng từ 12 - 36h.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
50
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Dòng T3
Dòng
L4 L4
Dòng R8
Dòng L3
Dòng T1
Dòng L1
Hình 11: Một số khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên môi trường
PDA Agar
(Dòng L4) Khuẩn lạc có màu vàng nhạt, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô
(Dòng T3) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô
(Dòng L3) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, nhăn, độ nổi lài
(Dòng R8) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô
(Dòng L1) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi hơi mô
(Dòng T1) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa răng cưa, độ nổi hơi lài
Chuyên ngành Vi sinh vật học
51
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Bảng 8. Đặc tính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi
trường PDA
STT
Dòng vi
khuẩn
Màu sắc
khuẩn lạc
Hình dạng khuẩn lạc
Đường kính
khuẩn lạc (cm)
1
R1
Trắng đục
Không đều, bìa nguyên, mô
4x5
2
R2
Trắng trong
Tròn, bìa nguyên, lài
5
3
R5
Hồng nhạt
Không đều, bìa răng cưa, mô
4
4
R6
Trắng đục
Tròn, bìa nguyên, lài
5
5
R7
Trắng đục
Tròn, bìa nguyên, mô
3
6
R8
Trắng đục
Tròn, bìa nguyên, mô
3
7
T1
Trắng đục
Tròn, bìa răng cưa, lài
3
8
T2
Trắng trong
Không đều, bìa nguyên, lài
4x5
9
T3
Trắng đục
Tròn, bìa nguyên, mô
3
10
T4
Vàng đậm
Tròn, bìa nguyên, mô
2
11
L1
Trắng đục
Tròn, bìa nguyên, mô
3
12
L2
Trắng đục
Tròn, bìa răng cưa, mô
4
13
L3
Trắng đục
Tròn, bìa nguyên, lài
8
14
L4
Vàng nhạt
Tròn, bìa nguyên, mô
2
15
L5
Hồng nhạt
Không đều, bìa răng cưa, lài
2x3
16
L6
Vàng nhạt
Tròn, bìa răng cưa, mô
3
17
L7
Trắng đục
Tròn, bìa nguyên, mô
4
4.1.2 Đặc điểm tế bào vi khuẩn
Quan sát hình thái và sự chuyển động của vi khuẩn được kiểm tra bằng phương
pháp giọt ép, dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần cho thấy các dòng
vi khuẩn có đặc điểm như sau:
- Đa số các vi khuẩn đều có khả năng chuyển động do có chiên mao ở đỉnh gồm
13/17 dòng chiếm 76,5%; và 4/17 dòng còn lại không có khả năng chuyển động chiếm
tỉ lệ rất ít 23,5%.
- Phần lớn các dòng vi khuẩn đều có dạng hình que ngắn 9/17 dòng chiếm
52,94% dạng que dài là 7/17 dòng chiếm 41,18%, chỉ có duy nhất 1/17 dòng có dạng
cầu đôi chiếm tỉ lệ rất ít 5,88% .
Chuyên ngành Vi sinh vật học
52
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Dòng L1
Dòng T4
Hình 12: Vi khuẩn Gram âm (dòng T4) và vi khuẩn Gram dương (dòng L1)
được chụp dưới kính hiển vi ở độ phóng đại vật kính X100.
Bảng 9. Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi
trường PDA
STT
Dòng
vi
khuẩn
Gram
*
Hình dạng
Chuyển
động
**
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
R1
R2
R5
R6
R7
R8
T1
T2
T3
T4
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
+
+
+
+
+
+
-
Que ngắn
Que dài
Que dài
Que dài
Que ngắn
Que ngắn
Que ngắn
Que ngắn
Que dài
Que ngắn
Que dài
Que ngắn- chuỗi đôi
Que ngắn- chuỗi đôi
Que dài
Que dài
Que ngắn
Cầu đôi
+++
++
++
+
+
+++
+
++
+
+
+++
++
+
Kích thước vi khuẩn
(µm)
Chiều
Chiều
dài
rộng
1,04
5,22
3,48
2,61
1,92
0,52
1,04
1,74
3,13
0,52
3,48
2,61
2,09
2,61
2,61
1,74
1,92
0,87
1,74
1,74
1,74
0,87
0,34
0,34
0,87
0,87
0,87
1,39
1,57
1,74
1,74
1,22
0.87
0,87
(Ghi chú: *: - Gram âm, + Gram dương; **: - không chuyển động, + có chuyển động; + chuyển động chậm, ++
chuyển động vừa, +++ chuyển động nhanh.)
Chuyên ngành Vi sinh vật học
53
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
4.2 Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã được phân
lập dựa trên lượng NH4+ (ammonium) tổng hợp được.
Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được sau khi chủng vào môi trường Nfb lỏng
(không N, không Yeast extract). Sau khi khảo sát khả năng cố định đạm dựa vào lượng
NH4+ (ammonium) do vi khuẩn sinh ra (phương pháp so màu Indophenol Blue), kết
quả cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn khảo sát đều có khả năng cố định đạm sinh học
được chia làm 2 nhóm phân bố đều ở rễ, thân và lá. Nhìn chung, các dòng vi khuẩn bắt
đầu tạo ra lượng NH4+ (ammonium) ở ngày đối chứng (1 giờ sau khi chủng), tuy nhiên
với hàm lượng rất thấp. Lượng ammonium bắt đầu tăng lên ở ngày thứ 2 nhưng vẫn
còn thấp và đạt mức cực đại ở ngày thứ 4, sau đó bắt đầu giảm mạnh ở ngày thứ 6 sau
khi chủng. Đây là xu hướng chung của hầu hết các dòng vi khuẩn vì do ngày đầu sau
khi chủng, các dòng vi khuẩn chưa kịp thích ứng với môi trường nên khả năng hoạt
động thấp tạo nên hàm lượng đạm thấp, đến ngày thứ 2 và ngày thứ 4 sau khi chủng,
khi đã bắt đầu quen với môi trường, chúng sinh trưởng và phát triển mạnh nên khả
năng tổng hợp đạm cao hơn. Đến ngày thứ 6 sau khi chủng, khi đã phát triển ở mức tối
đa, mật số vi khuẩn ngày càng tăng nhưng chất dinh dưỡng trong môi trường để chúng
sử dụng có giới hạn nên chúng có xu hướng sử dụng lượng đạm mà chúng đã tổng hợp
được nên hàm lượng đạm giảm đi đáng kể.
4.2.1 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân
lập ở rễ và thân cây cúc mui (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4)
Ở 1 giờ sau khi chủng, cả 10 dòng vi khuẩn (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4) ở nhóm
1 được phân lập ở rễ và thân đều đã tổng hợp được lượng ammonium nhưng nhìn
chung đều rất thấp. Thấp nhất là lượng ammonium trung bình do dòng R1 tạo ra gần
như bằng 0 (0,002 µg/ml). Tuy nhiên, các dòng R6, R8, T3, T4 lại tổng hợp lượng
ammonium trung bình khá cao tương đương nhau (khác biệt không có ý nghĩa thống
kê với nhau) nhưng lại khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại chỉ sau 1 giờ chủng
(hàm lượng ammonium trung bình dao động từ 0,052 µg/ml - 0,06 µg/ml). Hàm lượng
đạm trung bình cao nhất (0,06 µg/ml) do dòng T4 tổng hợp được.
Đến ngày thứ 2 sau khi chủng, hàm lượng ammonium trung bình do tất cả các
dòng vi khuẩn nhóm 1 tạo ra đều tăng lên. Tuy nhiên, do đặc tính của mỗi dòng vi
khuẩn khác nhau nên khả năng tổng hợp đạm ở mỗi dòng vi khuẩn cũng rất khác nhau.
Bên cạnh một số dòng vi khuẩn tổng hợp lượng đạm trung bình tăng rất mạnh còn có
Chuyên ngành Vi sinh vật học
54
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
một số dòng vi khuẩn tăng chậm ở ngày thứ 2 sau khi chủng. Dòng R6 và T3 vẫn tổng
hợp hàm lượng đạm cao nhất và tương đương nhau (hàm lượng đạm trung bình ở 2
dòng đều là 0,129 µg/ml ), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng khác ở ngày
thứ 2 sau khi chủng. Ngoài ra, dòng R1 tuy tổng hợp lượng đạm trung bình thấp nhất
(0,002 µg/ml) sau 1 giờ chủng, nhưng đến ngày thứ 2 sau khi chủng, lượng đạm trung
bình do dòng vi khuẩn này tạo ra lại khá cao và khác biệt không có ý nghĩa thống kê so
với dòng R6 và T3, chứng tỏ rằng dòng R1 phát triển rất nhanh và tổng hợp lượng đạm
rất mạnh chỉ sau 2 ngày chủng. Ngược lại, dòng T4 tuy tổng hợp lượng đạm trung bình
cao nhất sau 1 giờ chủng (hàm lượng đạm trung bình là 0,06 µg/ml) nhưng đến ngày
thứ 2 sau khi chủng, hàm lượng đạm trung bình (0,086 µg/ml) lại rất thấp hơn so với
các dòng còn lại ở nhóm 1 ngoại trừ dòng R2 (0,084 µg/ml), tuy nhiên 2 dòng vi
khuẩn này khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê.
Hàm lượng đạm trung bình do các dòng vi khuẩn nhóm 1 tổng hợp được lại tiếp
tục tăng cao ở ngày thứ 4 sau khi chủng, cao nhất vẫn là hàm lượng đạm do dòng R6
và T3 tổng hợp được (0,216 µg/ml và 0,221 µg/ml) khác biệt có ý nghĩa thống kê so
với các dòng còn lại, 2 dòng này vẫn tạo ra lượng đạm trung bình tương đương nhau.
Điều này chứng tỏ khả năng tổng hợp ammonium ở dòng R6 và T3 tương đương nhau
và có triển vọng tạo ra hàm lượng đạm cao nhất so với các dòng vi khuẩn được phân
lập ở rễ và thân. Thấp nhất là hàm lượng đạm trung bình do các dòng R1, R2, R5 và
T4 tạo ra (hàm lượng đạm trung bình dao động từ (0,148 µg/ml – 0,153 µg/ml)
Đến ngày thứ 6 sau khi chủng, hàm lượng đạm trung bình đều giảm xuống đáng
kể ở hầu hết các dòng vi khuẩn nhóm 1. Tuy nhiên, hàm lượng đạm trung bình do
dòng T3 và R1 tổng hợp giảm đi rất ít nên hàm lượng đạm trung bình vẫn còn cao và
khác biệt không có ý nghĩa, cao nhất là lượng đạm do dòng T3 tổng hợp được (0,144
µg/ml) ở mức khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại trong nhóm 1. Dòng R2 và
T4 tổng hợp lượng đạm thấp nhất (0,031 µg/ml và 0,034 µg/ml).
Một cách tổng quát, 10 dòng vi khuẩn được phân lập ở rễ và thân đều có khả
năng tổng hợp được lượng ammonium nhất định chỉ sau 1 giờ chủng nhưng rất thấp là
do khi vừa chủng, các dòng vi khuẩn vẫn chưa đủ thời gian phát triển để tổng hợp ra
ammonium nên hàm lượng ammonium tạo ra rất thấp (hàm lượng đạm trung bình dao
động từ 0,002 µg/ml - 0,06 µg/ml) xấp xỉ bằng 0. Dòng T4 tuy tạo ra hàm lượng đạm
trung bình sau 1 giờ chủng cao nhất nhưng đến ngày 2, ngày 4, ngày 6 sau khi chủng
Chuyên ngành Vi sinh vật học
55
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
hàm lượng đạm trung bình lại thấp nhất so với các dòng còn lại ở nhóm 1, có thể là do
dòng T4 thích ứng nhanh với môi trường nên tổng hợp lượng đạm cao ở ngày đối
chứng nhưng khả năng tổng hợp ammonium lại thấp hơn các dòng khác nên mặc dù
hàm lượng đạm trung bình do dòng T4 tạo ra ở ngày 2, ngày 4 sau khi chủng có tăng
lên nhưng tăng rất ít. Đáng kể nhất là khả năng tổng hợp ammonium ở dòng R6 và T3,
hàm lượng đạm trung bình từ ngày đầu đến ngày thứ 6 sau khi chủng đều cao nhất và
tương đương nhau, khác biệt rất có ý nghĩa so với các dòng khác, chứng tỏ dòng R6 và
T3 là 2 dòng triển vọng nhất trong tất cả các dòng vi khuẩn được phân lập từ rễ và thân
(Bảng 10).
Bảng 10. Lượng ammonium do các dòng vi khuẩn nhóm 1 (R1, R2, R5 - R8
và T1-T4) tổng hợp được theo thời gian (µg/ml)
Đạm ngày 0
Đạm ngày 2
Đạm ngày 4
Đạm ngày 6
R1
0,002e
0,118ab
0,15e
0,125ab
R2
0,024bc
0,084e
0,148e
0,031e
R5
0,008de
0,094de
0,155e
0,043de
R6
0,052a
0,129a
0,216a
0,119b
R7
0,03bc
0,089e
0,168d
0,061d
R8
0,056a
0,105cd
0,195b
0,061d
T1
0,034b
0,089e
0,201b
0,095c
T2
0,019cd
0,108bc
0,183c
0,113bc
T3
0,052a
0,129a
0,221a
0,144a
T4
0,06a
0,086e
0,153e
0,034e
21,61
7,22
4,14
13,54
Dòng vi
khuẩn
CV (%)
(*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).
4.2.2 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân
lập từ lá của cây cúc mui (L1 - L7)
Kết quả cho thấy 7 dòng vi khuẩn ở nhóm 2 được phân lập từ lá cây cúc mui đều
có khả năng tổng hợp được lượng ammonium. Cũng tương tự như nhóm 1 (R1, R2, R5
- R8 và T1-T4), các dòng vi khuẩn ở nhóm 2 (L1 - L7) đều tạo được hàm lượng NH4+
Chuyên ngành Vi sinh vật học
56
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
nhất định sau 1 giờ chủng và lượng NH4+ này tăng cao nhất vào ngày thứ tư rồi giảm
dần vào ngày thứ 6 sau khi chủng.
Hàm lượng ammonium trung bình do các dòng vi khuẩn ở nhóm 2 tạo ra sau 1
giờ chủng rất thấp, nhưng nhìn chung cao hơn so với nhóm 1. Dòng L6 tạo ra hàm
lượng đạm trung bình cao nhất (0,077 µg/ml) ở mức khác biệt có ý nghĩa thống kê so
với các dòng khác trong nhóm 2, thấp nhất là hàm lượng đạm trung bình do dòng L5
tạo ra (0,009 µg/ml) nhưng vẫn cao hơn hàm lượng đạm trung bình do dòng R2 tạo ra
(0,002 µg/ml) ở nhóm 1.
Hình 13: Lượng NH4+ (µg/ml) do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (L1- L7) tạo ra
(*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).
Đến ngày thứ 2 sau khi chủng, lượng ammonium trung bình do tất cả các dòng vi
khuẩn ở lá tổng hợp được đều tăng lên đáng kể, nhưng lượng đạm ở ngày 2 vẫn thấp
hơn so với ngày 4 sau khi chủng. Dòng L6 vẫn tổng hợp được lượng đạm cao nhất
(0,134 µg/l) so với các dòng còn lại. Tuy nhiên, ở ngày thứ 2 sau khi chủng, lượng
ammonium trung bình ở cả 7 dòng trong nhóm 2 đều khác biệt không có ý nghĩa về
mặt thống kê (hàm lượng đạm trung bình dao động từ 0,113 µg/l - 0,134 µg/l).
Đến ngày thứ 4 sau khi chủng, hàm lượng đạm trung bình vẫn tiếp tục tăng cao
và đạt đỉnh điểm ở cả 7 dòng, các dòng L3 - L7 tổng hợp lượng ammonium trung bình
rất cao (dao động từ 0,208 µg/l - 0,221 µg/l) khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống
kê. Tuy nhiên, cao nhất là hàm lượng đạm ở 3 dòng L4, L5, L6 (0,216 µg/l; 0,213
Chuyên ngành Vi sinh vật học
57
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
µg/l; 0,221 µg/l). Dòng L4 và L7 khác biệt không có ý nghĩa so với dòng L2, dòng L2
lại khác biệt không ý nghĩa so với dòng L1. Dòng L1 tổng hợp lượng đạm trung bình
thấp nhất (0,185 µg/l) so với các dòng khác ở nhóm 2 nhưng lại cao hơn hàm lượng
đạm trung bình do một số dòng ở nhóm 1 tạo ra.
Đến ngày thứ 6 sau khi chủng, lượng đạm ở tất cả các dòng đều giảm, lượng đạm
trung bình do dòng L4 tạo ra vẫn còn cao (0,159 µg/l) khác biệt có ý nghĩa so với các
dòng khác ở nhóm 2. Giảm đáng kể là hàm lượng đạm ở các dòng L1, L2, L3 và L7
(hàm lượng đạm trung bình dao động từ 0,185 µg/l – 0,208 µg/l ở ngày thứ 4 sau khi
chủng đến ngày thứ 6 sau khi chủng giảm xuống còn 0,08 µg/l – 0,092 µg/l).
Một cách tổng quát hàm lượng ammonium tăng dần từ ngày đầu đến ngày 4 và
giảm xuống ở ngày 6 sau khi chủng, lượng ammonium cao nhất ở ngày thứ 4 sau
chủng. Một số dòng vi khuẩn có triển vọng tổng hợp được hàm lượng đạm cao nhất so
với các dòng vi khuẩn ở nhóm 2 được phân lập từ lá cây cúc mui là dòng L4, L5, L6.
4.2.3 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn triển vọng ở cả
nhóm 1 và nhóm 2 được phân lập ở rễ, thân và lá của cây cúc mui
Khi so sánh khả năng tổng hợp ammonium ở các dòng vi khuẩn triển vọng ở cả
rễ, thân và lá cây cúc mui, kết quả là ở ngày đầu tuy hàm lượng đạm trung bình do 5
dòng triển vọng tạo ra có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê, hàm lượng đạm trung
bình cao nhất do dòng L6 tổng hợp được (0,077 µg/ml), thấp nhất là hàm lượng đạm
do dòng L4 và L5 tổng hợp được (0,021 µg/ml và 0,009 µg/ml).
Nhưng đến ngày thứ 2 và ngày thứ 4 sau khi chủng, hàm lượng đạm trung bình ở
các dòng tăng lên đáng kể nhưng hầu hết sự khác biệt không ý nghĩa thống kê giữa tất
cả các dòng. Điều này cho thấy khả năng tổng hợp đạm khác biệt rất lớn giữa các
dòng, dòng L4 và L5 tổng hợp đạm tăng nhanh sau 2 và 4 ngày chủng, dòng L6 tăng
chậm nhất. Tuy nhiên cao nhất vẫn là lượng đạm do dòng L6 tổng hợp được (hàm
lượng đạm trung bình là 0,134 µg/ml ở ngày thứ 2 sau khi chủng và 0,221 µg/ml ở
ngày thứ 4 sau khi chủng).
Đến ngày thứ 6 sau khi chủng, hàm lượng đạm trung bình vẫn giảm xuống
nhưng không đáng kể ở cả 3 dòng T3, L4, L5 (hàm lượng đạm trung bình dao động từ
0,131 µg/ml - 0,159 µg/ml). Hàm lượng đạm trung bình giảm đáng kể nhất là dòng R6
và L6 (hàm lượng đạm tương ứng 0,216 µg/ml và 0,221 µg/ml ở ngày 4 sau khi chủng
giảm xuống còn 0,119 µg/ml và 0,122 µg/ml ở ngày 6 sau khi chủng).
Chuyên ngành Vi sinh vật học
58
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Hình 14: Lượng NH4+ (µg/ml) do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra
(*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).
Tổng quát, cả 17 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp NH4+, trong đó các
dòng R6, T3, L4, L5, L6 là triển vọng nhất. Các dòng vi khuẩn triển vọng này đã tạo
lượng NH4+ cao nhất so với 17 dòng vi khuẩn đã được phân lập từ rễ, thân và lá của
cây cúc mui. Những dòng triển vọng này có xu hướng bắt đầu tổng hợp NH 4+ ở ngày 2
tăng mạnh ở ngày 4 và giảm dầm ở ngày 6. Tuy hàm lượng đạm trung bình do các
dòng R6, T3, L4, L5 và L6 tổng hợp được có khác biệt ở ngày đầu sau khi chủng
nhưng đến ngày 2 và ngày 4 sau khi chủng, cả 5 dòng vi khuẩn triển vọng đều tổng
hợp lượng đạm rất cao và tương đương nhau (khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống
kê). Điều này cho thấy khả năng tổng hợp đạm tuy chênh lệch giữa các dòng vi khuẩn
triển vọng nhưng lượng đạm cao nhất mà chúng tổng hợp tương đương nhau chứng tỏ
cả 5 dòng này đều có triển vọng như nhau (dao động từ 0,213 µl/ml - 0,221 µl/ml).
Tuy nhiên, lượng ammonium do các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây cúc mui có
khả năng tổng hợp ammonium rất thấp. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị
Phương Tâm (2011), các dòng vi khuẩn nội sinh MA 48, MA 41, MA 40 và MA 49
được phân lập từ cây mía có khả năng tổng hợp đạm rất cao (dao động từ 8,93 µl/ml 9,92 µl/ml) ở ngày thứ 4 sau khi chủng. Hai dòng vi khuẩn E 3704 và E 1631 nội sinh
trong lá hẹ và rễ ngò gai, phân lập được trên môi trường NFb bởi Trần Mỹ Xuyên
(2010), tổng hợp được lượng ammonium cao nhất ở ngày thứ 4 sau chủng lần lượt là
3,52 µl/ml và 3,55 µl/ml.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
59
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
4.3. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân ở các dòng vi khuẩn phân lập được
trên môi trường PDA.
Trong số 17 dòng vi khuẩn phân lập được sau khi khảo sát khả năng hòa tan lân
trong môi trường NBRIP đặc , kết quả chỉ có 11 dòng vi khuẩn có khả năng tạo được
vòng halo chứng tỏ các dòng vi khuẩn này có khả năng hòa tan lân khó tan.
Hình 15: Vòng halo do dòng vi khuẩn L5 tạo ra khi chủng vào trong môi
trường NBRIP.
Nhìn chung, hiệu quả hòa tan lân tăng dần từ ngày 1 đến ngày 5 sau khi chủng. Ở
ngày thứ nhất sau khi chủng, hầu hết hiệu quả hòa tan lân ở các dòng đều như nhau
(khác biệt không có ý nghĩa thống kê), tuy nhiên, dòng L5 và L6 cho hiệu quả hòa tan
lân cao nhất ( hiệu quả hòa tan lân lần lượt là 132,2 E và 132,7 E) khác biệt có ý nghĩa
so với dòng L1 cho hiệu quả hòa tan lân hấp nhất là dòng L1 (113,3 E), 2 dòng này có
hiệu suất hòa tan lân tương đương nhau, tuy nhiên lại khác biệt không có ý nghĩa so
với các dòng còn lại. Đến ngày 3 và ngày 5 sau khi chủng, hiệu quả hòa tan lân tăng
lên ở cả 11 dòng vi khuẩn, dòng L5 vẫn cho hiệu quả hòa tan lân cao nhất (hiệu quả
hòa tan lân ở ngày 5 sau khi chủng là 220,8 E) khác biệt có ý nghĩa so với các dòng
còn lại. Một nghiên cứu khác về vi khuẩn nội sinh ở cây dưa hấu của Nguyễn Thanh
Bình (2013) cho thấy dòng NDH15 cho khả năng hòa tan lân cao nhất với hiệu quả
hòa tan lân là 246 E ở ngày thứ 5 sau khi chủng.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
60
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Bảng 11. Hiệu quả hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được trên
môi trường NBRIP đặc
Thời gian ủ
Dòng vi
khuẩn
1 ngày
3 ngày
5 ngày
Đ.K halo/
Đ.K khuẩn
lạc (cm)
Hiệu quả
hòa tan
lân (E)
Đ.K halo/
Đ.K
khuẩn lạc
(cm)
Hiệu quả
hòa tan
lân (E)
Đ.K halo/
Đ.K
khuẩn lạc
(cm)
Hiệu quả
hòa tan
lân (E)
R5
1,167
116,7ab
1,192
119,2b
1,255
125,5c
R6
1,178
117,8ab
1,189
118,9b
1,211
121,1c
R7
1,194
119,4ab
1,231
123,1b
1,382
138,2c
R8
1,188
118,8ab
1,261
126,1ab
1,298
129,8c
T4
1,268
126,8ab
1,282
128,2ab
1,794
179,4b
L1
1,133
113,3b
1,217
121,7b
1,278
127,8c
L2
1,21
121ab
1,239
123,9b
1,261
126,1c
L3
1,197
119,7ab
1,324
132,4ab
1,402
140,2c
L5
1,322
132,2a
1,478
147,8a
2,208
220,8a
L6
1,327
132,7a
1,338
133,8ab
1,408
140,8c
L7
1,194
119,4ab
1,252
125,2ab
1,334
133,4c
CV (%)
7,24
10,78
12,7
(*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).
4.4. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) ở các dòng vi
khuẩn được nuôi trong môi trường Nfb lỏng không bổ sung Tryptophan
Sau khi xác định khả năng cố định đạm và hòa tan lân khó tan của 17 dòng vi
khuẩn đã phân lập được, tiếp tục nuôi cấy các dòng vi khuẩn này trong môi trường Nfb
lỏng (không bổ sung Tryptophan, không N, không Yeast extract) , theo dõi và đo hàm
lượng IAA được tạo ra.
Kết quả cho thấy tất cả 17 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp indol-3aceteic acid (IAA) mà không cần bổ sung Tryptophan (tiền chất tổng hợp indol-3aceteic acid) vào môi trường nuôi. Tương tự như khả năng tổng hợp đạm, nhìn chung,
các dòng vi khuẩn này đều tổng hợp lượng IAA thấp ở ngày thứ 2, đến ngày thứ 4
lượng IAA được tổng hợp cao nhất và sau đó lượng IAA giảm rõ rệt ở ngày thứ 6 sau
Chuyên ngành Vi sinh vật học
61
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
khi chủng. Tuy nhiên, một số dòng vi khuẩn tạo ra lượng IAA tiếp tục tăng cao ở ngày
thứ 6 sau khi chủng. Các dòng này có khả năng tổng hợp được hàm lượng IAA rất cao.
Lượng IAA do các dòng vi khuẩn tổng hợp được chia làm 2 nhóm qua các ngày cụ thể
như sau:
4.4.1 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân lập ở rễ
và thân cây cúc mui (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4)
Ở ngày thứ 2 sau khi chủng, tất cả các dòng vi khuẩn ở nhóm 1 (R1, R2, R5 - R8
và T1-T4) được phân lập từ rễ và thân cây cúc mui đều tổng hợp được lượng IAA nhất
định. Tuy nhiên, dòng R5 có khả năng tổng hợp lượng IAA trung bình cao nhất (12,42
µg/ml) và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng vi khuẩn còn lại, các dòng R2, R8, T1,
và T2 tổng hợp lượng IAA trung bình cũng khá cao và tương đương nhau (khác biệt
không có ý nghĩa), các dòng vi khuẩn còn lại chỉ tổng hợp lượng IAA ở mức trung
bình và tổng hợp lượng IAA trung bình thấp nhất là dòng R6 và T4 (6,33 µg/ml và
5,33 µg/ml).
Đến ngày thứ 4 sau khi chủng, lượng IAA trung bình do các dòng vi khuẩn tổng
hợp được nhìn chung cao hơn so với ngày thứ 2. Tuy nhiên, về khả năng tổng hợp IAA
ở các dòng vi khuẩn có sự thay đổi, dòng R1 tổng hợp được lượng IAA trung bình cao
nhất (14,5 µg/ml) khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với dòng R5 (14 µg/ml),
nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng khác trong nhóm 1, chứng tỏ
dòng R1 và R5 là 2 dòng triển vọng nhất về khả năng tổng hợp IAA trong số 10 dòng
ở nhóm 1 được phân lập từ rễ cây cúc mui. Dòng R2, R6, T2 cũng có khả năng tổng
hợp lượng IAA cao ở ngày thứ 4 sau chủng (hàm lượng IAA trung bình dao động từ
(13,05 µg/ml - 13,67 µg/ml). Thấp nhất là lượng IAA do dòng T3 tạo ra (11,78 µg/ml),
nhưng nhìn chung cao hơn nhiều so với lượng IAA do tất cả các dòng vi khuẩn ở
nhóm 1 tạo ra nhưng lại thấp hơn hàm lượng IAA trung bình do dòng R5 tạo ra (14,42
µg/ml) ở ngày 2 sau khi chủng.
Hàm lượng IAA do các dòng vi khuẩn tổng hợp được giảm đáng kể ở ngày thứ 6
sau khi chủng, ngoại trừ dòng R5 và R7 hàm lượng IAA trung bình tăng lên so với
lượng IAA trung bình ở ngày thứ 4 sau khi chủng (lượng IAA trung bình lần lượt là
16,67 µg/ml và 13,22 µg/ml). Dòng R5 tổng hợp lượng IAA trung bình cao nhất ở
ngày thứ 6 (16,67 µg/ml) sau khi chủng, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng
còn lại. Hàm lượng IAA do dòng T4 tạo ra giảm mạnh nhất ở ngày thứ 6 sau khi
Chuyên ngành Vi sinh vật học
62
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
chủng (hàm lượng IAA trung bình ở ngày thứ 4 là 12,33 µg/ml giảm xuống còn 2,89
µg/ml).
Bảng 12. Lượng IAA trung bình do các dòng vi khuẩn nhóm 1 (R1, R2, R5 R8 và T1 - T4) tổng hợp được theo thời gian (µg/ml)
Dòng vi khuẩn
IAA ngày 2
IAA ngày 4
IAA ngày 6
R1
8,42c
14,5a
11,33c
R2
9,17b
13,67bc
10,67c
R5
12,42a
14ab
16,67a
R6
6,33e
13,5bc
4,78e
R7
7,08d
12,78de
13,22b
R8
9,58b
12,61de
9d
T1
9,17b
12,17ef
3,89ef
T2
9,67b
13,05cd
8,78d
T3
7,5d
11,78f
5,22e
T4
5,83e
12,33ef
2,89f
CV (%)
4,25
3,18
9,52
(*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).
Tổng quát, các dòng vi khuẩn đều tạo được lượng IAA nhất định và có xu hướng
tăng từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 4 sau khi chủng, đến ngày thứ 6 thì hàm lượng IAA
trung bình do tất cả các dòng tổng hợp được giảm đáng kể ngoại trừ dòng R5 và R7
vẫn tiếp tục tăng. Dòng R5 tổng hợp lượng IAA trung bình cao nhất ở ngày thứ 2 sau
khi chủng (12,42 µg/ml) nhưng đến ngày thứ 4 và thứ 6 sau khi chủng mặc dù có tăng
nhưng không đáng kể (hàm lượng IAA trung bình ở ngày thứ 4 và thứ 6 lần lượt là 14
µg/ml và 16,67 µg/ml) nhưng nhìn chung hàm lượng IAA trung bình của dòng R5 ở cả
3 ngày đều cao hơn các dòng khác trong nhóm 1. Điều này chứng tỏ dòng R5 có khả
năng tổng hợp hàm lượng IAA rất cao nhưng khá chậm. Dòng có triển vọng nhất ở
nhóm 1 là dòng R1và R5 với hàm lượng IAA trung bình lần lượt là 14,5 µg/ml ở ngày
4 sau khi chủng và 16,67 µg/ml ở ngày 6 sau khi chủng.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
63
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
4.4.2 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân lập từ lá
của cây cúc mui (L1- L7)
Tất cả 7 dòng vi khuẩn ở nhóm 2 (L1- L7) được phân lập từ lá của cây cúc mui
đều có khả năng tổng hợp IAA cũng theo quá trình tương tự như ở nhóm 1(R1, R2, R5
- R8 và T1 - T4), lượng IAA tăng dần từ ngày 2 đến ngày 4 sau khi chủng và đến ngày
thứ 6 đều giảm.
Hình 16: Lượng IAA do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (L1 - L7) tạo ra
được phân lập từ lá của cây cúc mui
(*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).
Ở ngày thứ 2 sau khi chủng, lượng IAA trung bình do dòng L2, L3 và L5 khác
biệt không có ý nghĩa thống kê, nhưng dòng L5 tạo ra lượng IAA trung bình cao nhất
(7,42 µg/ml). Dòng L6 tuy tổng hợp được lượng IAA trung bình thấp nhất (3,92
µg/ml) ở ngày 2 nhưng đến ngày thứ 4 sau khi chủng lại tổng hợp lượng IAA trung
bình cao nhất (14,89 µg/ml). Bên cạnh đó, dòng L3 và L7 cũng có khả năng tổng hợp
lượng IAA trung bình cao (hàm lượng IAA trung bình tương ứng là 13,83 µg/ml và
13,94 µg/ml) và khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê. Các dòng L1, L2, L4, và
L5 cũng tổng hợp lượng IAA tăng ở ngày thứ 4 sau khi chủng nhưng hàm lượng IAA
trung bình (dao động từ 9,22 µg/ml - 12,78 µg/ml) thấp hơn nhiều so với lượng IAA
Chuyên ngành Vi sinh vật học
64
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
do dòng L6, L7, và L3 tổng hợp. Điều này cho thấy dòng L6, L7, và L3 là các dòng
triển vọng nhất trong số 7 dòng vi khuẩn ở nhóm 2 được phân lập từ lá.
Các dòng vi khuẩn đều tạo lượng IAA trung bình giảm mạnh ở ngày thứ 6 sau
khi chủng ngoại trừ dòng L6 và L7 giảm không đáng kể nên hàm lượng IAA ở 2 dòng
này cao nhất và tương đương nhau, khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại ở
nhóm 2 ở ngày thứ 6 sau khi chủng (lượng IAA trung bình đều là 12,11 µg/ml).
4.4.3 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng ở cả nhóm 1 và
nhóm 2 được phân lập ở rễ, thân và lá của cây cúc mui
Khi so sánh khả năng tổng hợp IAA giữa các dòng triển vọng trong số 17 dòng vi
khuẩn phân lập được ở cả rễ, thân và lá của cây cúc mui. Kết quả là đa số các dòng vi
khuẩn đều tổng hợp lượng IAA tăng từ ngày 2 đến ngày 4 và giảm xuống ở ngày 6 sau
khi chủng. Riêng chỉ có hàm lượng IAA trung bình do dòng R5 tổng hợp được có xu
hướng tăng dần từ ngày 2 đến ngày 6 sau khi chủng (lượng IAA trung bình từ 12,42
µg/ml - 16,67 µg/ml). Dòng L6 tuy tổng hợp lượng IAA trung bình ở ngày 4 cao nhất
(14,89 µg/ml) khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng triển vọng
khác, nhưng đến ngày 6 sau khi chủng lượng IAA trung bình lại giảm và thấp hơn
lượng IAA trung bình do dòng R5 tổng hợp được (16,67 µg/ml) . Vì vậy dòng R5 là
dòng triển vọng nhất về khả năng tổng hợp IAA. Theo kết quả nghiên cứu của Lata et
al. (2006) trong môi trường có bổ sung Tryptophan, vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
được phân lập từ cây cúc dại (Echinacae) có khả năng tổng hợp lượng IAA là 18,8
µg/ml. Trong khi đó, chủng Bacillus thuringiensis chỉ có khả năng tổng hợp lượng
IAA từ 1,53 - 9,71 µg/ml (Raddadi et al., 2008). Năm 2010, Ngô Minh Toàn phân lập
được dòng vi khuẩn nội sinh trên cây chuối có khả năng tạo được 9,273 µg/ml IAA
vào ngày thứ 4 sau khi chủng. Từ các nghiên cứu trên cho thấy các chủng vi khuẩn
phân lập được từ cây cúc mui có khả năng tổng hợp IAA rất cao, lên đến 16,67 µg/ml
khi trong môi trường không bổ sung Tryptophan. Đây là một trong những tiềm năng
giúp cho cây phát triển tốt.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
65
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Hình 17: Lượng IAA do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra được phân lập
từ rễ, thân và lá của cây cúc mui
(*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).
4.5 Kết quả khả năng kháng khuẩn ở các dòng vi khuẩn
Khi thử nghiệm khả năng kháng khuẩn với 2 loài vi khuẩn gây bệnh (E. coli và
Aeromonas hydrophila), kết quả là 3 trong số 17 dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi
khuẩn gây bệnh đường ruột (E. coli) và 4 trong số 17 dòng vi khuẩn có khả năng
kháng lại vi khuẩn gây bệnh ở cá (Aeromonas hydrophila). Trong đó có 2 dòng có khả
năng kháng khuẩn với cả 2 loài vi khuẩn gây bệnh nhưng rất yếu.
4.5.1 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh ở đường ruột (E. coli)
Khi khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng VKNS phân lập được với vi
khuẩn E. coli gây bệnh đường ruột, dòng R2, T2, T4 có khả năng tạo vòng sáng. Điều
này chứng tỏ các dòng R2, T2, T4 có khả năng kháng lại vi khuẩn E. coli gây bệnh.
Nhìn chung ở ngày đầu sau khi ủ, dòng T4 cho thấy khả năng kháng khuẩn cao
nhất (vòng vô khuẩn là 2,5 mm), tuy nhiên sự khác biệt ở cả 3 dòng này không có ý
nghĩa về mặt thống kê.
Đến ngày thứ 2 sau khi ủ, vòng vô khuẩn tăng lên nhưng không đáng kể, ở dòng
T4 vẫn cho hiệu số cao nhất và khác biệt không ý nghĩa thống kê so với dòng T2. Điều
này chứng tỏ dòng T4 có khả năng kháng lại E. coli mạnh nhất.
Đến ngày thứ 3 sau khi ủ, khả năng kháng khuẩn ở cả 3 dòng đều tăng nhưng rất
ít, hiệu quả kháng khuẩn cao nhất vẫn là dòng T4 (3,3 mm), khác biệt có ý nghĩa so
Chuyên ngành Vi sinh vật học
66
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
với 2 dòng còn lại. Tuy nhiên, khả năng đối kháng của cả 3 dòng R2, T2 và T4 đối với
vi khuẩn E. coli nhìn chung đều rất yếu.
Ngày 1
Ngày 3
Hình 18: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn T4 với vi khuẩn E. coli
theo thời gian
Bảng 13. Khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi
khuẩn E. coli
Thời gian ủ
Dòng
1 ngày
2 ngày
3 ngày
vi khuẩn
Vòng vô khuẩn
Vòng vô khuẩn
Vòng vô khuẩn
(D-d, mm)
(D-d, mm)
(D-d, mm)
R2
0,75a
1b
1,5b
T2
1,4a
1,9ab
2b
T4
2,5a
3,15a
3,3a
CV (%)
36,2
29,54
7,2
(*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).
4.5.2 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh Aeromonas hydrophila
Khi khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng VKNS phân lập được với vi
khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh ở cá. Kết quả là 5 dòng R2, T2, L2, L3, L5 có
khả năng tạo vòng sáng quanh khuẩn lạc chỉ sau 1 ngày sau khi ủ, chứng tỏ 5 dòng này
đều có khả năng kháng lại vi khuẩn Aeromonas hydrophila. Dòng L2 cho thấy vòng vô
khuẩn cao nhất, chứng tỏ dòng L2 có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất khác biệt có ý
nghĩa thống kê so với các dòng còn lại ở ngày 1 và ngày 2 sau khi ủ (hiệu số trung
bình lần lượt là 4,5 mm và 4,5 mm). Tuy nhiên, vòng vô khuẩn từ ngày 1 đến ngày 2
Chuyên ngành Vi sinh vật học
67
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
sau khi ủ vẫn không đổi ở cả 5 dòng, ngoại trừ dòng L3 có tăng lên nhưng không đáng
kể.
Đến ngày thứ 3 sau khi ủ, vòng vô khuẩn ở tất cả các dòng đều tăng nhưng rất ít
ngoại trừ dòng R2 vẫn không đổi. Vòng vô khuẩn cao nhất vẫn là dòng L2 (4,75 mm).
Dòng L3 cũng cho khả năng kháng lại vi khuẩn Aeromonas hydrophila cao (vòng vô
khuẩn là 4 mm) và khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê so với dòng L2 nhưng
khác biệt có ý nghĩa so với 3 dòng còn lại, thấp nhất vẫn là dòng R2 (1,25 mm) (Bảng
14).
Bảng 14. Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với
vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Thời gian ủ
Dòng vi
1 ngày
2 ngày
3 ngày
khuẩn
Vòng vô khuẩn
Vòng vô khuẩn
Vòng vô khuẩn
(D-d, mm)
(D-d, mm)
(D-d, mm)
R2
1,25b
1,25c
1,25b
T2
1,75b
1,75c
2b
L2
4,5a
4,5a
4,75a
L3
2,5b
3b
4a
L5
1,75b
1,75c
2,5b
CV (%)
22,3
17,07
17,24
(*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).
Dòng L2
Dòng L3
Hình 19: Khả năng đối kháng của dòng vi khuẩn L2 và L3 với vi khuẩn
Aeromonas hydrophila gây bệnh ở cá
Chuyên ngành Vi sinh vật học
68
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Tổng quát, trong số 17 dòng phân lập được từ rễ, thân và lá của cây cúc mui đem
khảo sát thì thấy có 6 dòng R2, T2, T4, L2, L3 và L5 đều có khả năng kháng lại vi
khuẩn gây bệnh, cả 6 dòng này đều phân lập được ở rễ, thân và lá cây cúc mui. Trong
đó, dòng R2 và dòng T2 vừa có khả năng kháng lại 2 loại vi khuẩn gây bệnh E.coli và
Aeromonas hydrophila, tuy nhiên khả năng kháng khuẩn rất yếu so các dòng còn lại.
Dòng T4 cho khả năng đối kháng cao nhất đối với vi khuẩn E. coli nhưng lại không
thể kháng lại vi khuẩn Aeromonas hydrophila. Ngược lại, 3 dòng L2, L3, L5 kháng vi
khuẩn Aeromonas hydrophila mạnh nhất nhưng lại không kháng E. coli. Bên cạnh đó,
hiệu quả kháng khuẩn với Aeromonas hydrophila ở hầu hết các dòng vi khuẩn trên cao
hơn nhiều so với E. coli (bề rộng vòng vô khuẩn lớn nhất của dòng T4 với E. coli là
3,3 mm của dòng L2 đối với Aeromonas hydrophila là 4,75 mm). Điều này cho thấy
các dòng vi khuẩn này có tiềm năng kháng lại vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây
bệnh trên cá hiệu quả hơn so với vi khuẩn E. coli.
Nhìn chung, hoạt động kháng khuẩn ở các loài vi khuẩn nội sinh đã và đang là
vấn đề đáng được quan tâm trên toàn thế giới. Theo nghiên cứu của Vachees et al.
(1997), các chủng Pseudomonas có khả năng ức chế sự phát triển của Staphylococcus,
Escherichia coli và Aeromonas hydrophila lên đến 96,7%. Một nghiên cứu mới đây
cho thấy chủng vi khuẩn nội sinh Pseudomonas aeruginosa được phân lập từ cải bắp
dại (Brassica oleracea) đã được báo cáo về hoạt động kháng khuẩn chống lại các vi
khuẩn gây bệnh như Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Salmonella typhi (vòng vô khuẩn dao động từ 12 mm - 25 mm) (Swetha sunkar, 2013).
Arundhati và Paul (2013) cũng đã phân lập được các dòng vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân
và lá của cây đình lịch (Hygrophila spinosa) có khả năng kháng lại một số vi khuẩn
gây bệnh, trong đó khả năng kháng lại vi khuẩn E. coli là cao nhất (vòng vô khuẩn lên
đến 20 mm).
4.6 Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR
Sau khi kiểm tra các đặc tính sinh hóa của 17 dòng vi khuẩn phân lập được trên
môi trường PDA. Chọn 3 dòng vi khuẩn triển vọng nhất đó là dòng R2, dòng T2 và
dòng L5 thực hiện phương pháp PCR với đoạn mồi 16S-rDNA (Hình 20).
Chuyên ngành Vi sinh vật học
69
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
1
2
Trường ĐHCT
3
4
5
6
7
1500 bp
Hình 20: Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S-rDNA
(*Ghi chú: Giếng 7: Thang chuẩn 100bp. Giếng 3 - 5: Các mẫu thí nghiệm. Kích thước mẫu là 1.500bp.)
Sau khi đã khuếch đại DNA của các dòng vi khuẩn, chọn 3 dòng vi khuẩn R2,
T2, L5 gửi giải trình tự và định danh tại Công ty Macrogen, Korea.
Sử dụng công cụ Blast của NCBI để so sánh trình tự tương đồng với các trính tự
trên ngân hàng gen kết quả đã cho thấy trình tự của dòng R2 có mức đồng hình 99%
với 16s-rRNA của dòng vi khuẩn Bacillus subtilis, dòng T2 có mức đồng hình 95%
với 16s-rRNA của dòng vi khuẩn Bacillus subtilis, dòng L5 có mức đồng hình 99%
với 16s-rRNA của dòng vi khuẩn Bacillus subtilis.
4.6.1 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng R2:
TAGGCGAGGCGGACAGCCAAGACTGCAAGTTCGAGCGGACAGATGG
GAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAA
CCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGAT
GGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACT
TACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC
AAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGAC
TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGC
AATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTC
GGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGG
CGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAG
CAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGT
AAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAA
CCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGT
Chuyên ngành Vi sinh vật học
70
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
GGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAG
TGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGT
GGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA
GTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTA
AGCACTCCGCCTGGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATT
GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACG
CGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGAC
GTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT
GTCGTGAGATGTTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTA
GTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAACCCGA
GAAAAGTTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGGTAC
ACACTGGTTCAATGGACAGAAAAAAGGGGGCGAAACCCCCAGGTTAACCA
ATCCCACAAACTGTTTCCCTTTCGGA
Hình 21: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng R2
Đoạn DNA của dòng R2 dài 1195 bp có tỉ lệ đồng hình 99% với trình tự DNA
của KC443084.1 Bacillus subtilis dòng BAB - 244.
4.6.2 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng T2:
GGGAGACGGGTGCCAACATAGTATGAGAGTCGCGCGGATTTATAGG
GAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAA
CCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGAT
GGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACT
TACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC
AAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGAC
Chuyên ngành Vi sinh vật học
71
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGC
AATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTC
GGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGG
CGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAG
CAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGT
AAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAA
CCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGT
GGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAG
TGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAAGAACCAAAGCGT
GGGGAACCGAACAGGATTAGATACCCTGGGTAGTCCACCGCCGTAAAACG
ATGAATTGCTAAGTTGTTAGGGGGGTTTCCCCCCCCTTTAGTGCTGCAAGC
TAACGCATTAAACCACTCCGCCCTGGGGAATTACGGTCCCAAAAACTGAA
AACTCAAAGGGAATTTGACGGGGGGCCCCCCACAAGCGGGTGGAAGCATT
GTGGTTTTAATTTCGAAACCAACCGCGAAAAAACCTTTACCAGGGTCTTGA
ACTTCCTTCTGAACAATCCTAAAAAATAGGAACGTTCCCCTTTCCGGGGGC
CAAAATTAACAAGGTGGGTGCAATGGTTTGTCCCTCCAGCTCCTGTTCCTT
GGAAATTGTTTGGGTTTAAGTTCCCGGAAACCGAAGCCCCAACCCTTTGGA
TCTTTAGGTTGGCCAGCCATTTCCAGTTGGGGGCCCCTTCCAAGGGTGGAC
CTGGCCGGGTTGCCAAAACCGGGAAGGAAAGGGGTGGGGGGATTAACGCC
TCCAAATTTTCACTT
Hình 22: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng T2
Chuyên ngành Vi sinh vật học
72
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Đoạn DNA của dòng T2 dài 1029 bp có tỉ lệ đồng hình 95% với trình tự DNA
của KC465726.1 Bacillus subtilis dòng 14.
4.6.3 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng L5:
GGAGGCCCGGTGCCGACAAAGAATTGCATGTCGCGCGGACTGATGG
GAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAA
CCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGAT
GGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACT
TACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC
AAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGAC
TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGC
AATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTC
GGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGG
CGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAG
CAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGT
AAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAA
CCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGT
GGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAG
TGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGT
GGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA
GTGCTAAGTGTTAGGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATT
AAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATT
GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACG
CGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGAC
GTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT
GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAG
TTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGA
AGAAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTAT
Chuyên ngành Vi sinh vật học
73
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Hình 23: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng L5
Đoạn DNA của dòng L5 dài 1168 bp có tỉ lệ đồng hình 99% với trình tự DNA
của KC182058.1 Bacillus subtilis dòng M1.
Nhìn chung, kết quả giải trình tự cho thấy rằng cả 3 dòng vi khuẩn R2, T2 và
L5 được tuyển chọn đều có trình tự DNA tương đồng với chủng Bacillus subtilis với
tỉ lệ đồng hình lần lượt là 99%. Trong đó, tỉ lệ đồng hình của dòng T2 với chủng
Bacillus subtilis chỉ có 95%, điều này chứng tỏ dòng T2 có thể là một chủng mới có
quan hệ gần gũi với chủng Bacillus subtilis. Cả 3 dòng này đều có khả năng tổng hợp
đạm, IAA và tạo vòng kháng khuẩn.
Khi so sánh kết quả nghiên cứu về một số đặc tính tiềm năng của chủng
Bacillus subtilis, Satapute và Kaliwal (2012) đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus
subtilis AS-4 từ đất nông nghiệp và dòng vi khuẩn này sống tự do có khả năng cố định
đạm trong đất và thân thiện với môi trường. Bên cạnh đó, Maheswar và Sathiyavani
(2012) đã phân lập dòng vi khuẩn Bacillus SPS từ rễ cây lạc (Arachishypogaea L) và
dòng vi khuẩn này có khả năng hòa tan lân. Các vi sinh vật hòa tan lân được phân lập
từ đất vùng rễ cây lạc được xác định là vi khuẩn Bacillus subtilis và Bacillus cereus.
Về khả năng đối kháng, trong báo cáo của Wang et al (2009) dòng Bacillus
subtilis EB-28 một vi khuẩn nội sinh được phân lập từ Speranskia tuberculata có tác
dụng kháng nấm Botrytis cinerea Pers, gây sự thối rữa một cách mạnh mẽ, đạt hiệu
quả đến 71,1% trong điều kiện in vitro và 52,4% trong thí nghiệm ngoài đồng. Bacillus
subtilis được phân lập từ cây nho, có tác dụng ức chế bệnh Pierce (Kirkpatrick và
Wilhelm, 2007). Hoạt động kháng khuẩn của hai chủng Bacillus được phân lập từ
đường ruột tôm càng xanh có khả năng chống lại Aeromonas hydrophila đã được xác
Chuyên ngành Vi sinh vật học
74
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
định là Bacillus subtilis P32 và P72 (Mongkol Thirabunyanon và Ananthaya Sansawat,
2009). Bên cạnh đó, theo kết quả nghiên cứu của Hadi Zokaeifar et al (2012), 2 chủng
B. subtilis L10 và G1 đều cho kết quả chống lại Virio haveyi và Virio
parahaemoliticus (hai loài vi khuẩn gây bệnh trên tôm). Một nghiên cứu khác của
Rengpipat et al., (2000) trên đối tượng tôm sú cũng cho rằng sử dụng Bacillus sp.
(S11) giúp vật nuôi ít nhiễm bệnh do vi khuẩn Bacillus đã tiết ra các chất làm tăng đáp
ứng cả miễn dịch tế bào lẫn miễn dịch dịch thể. Balcázar (2003) chứng
minh Bacillus làm tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng của tôm thẻ do khống chế V.
harveyi và virus đốm trắng. Một nghiên cứu khác của Hadi et al. (2009) trộn B.
subtilis vào thức ăn tôm thẻ chân trắng làm tôm tăng trưởng nhanh và tỉ lệ sống cao
hơn so với đối chứng, mặt khác mật độ B. subtilis cũng tăng nhanh trong hệ tiêu hóa
của tôm và mật độ Vibrio giảm. Ngoài ra, Bacillus subtilis B20.1 cũng có khả năng ức
chế vi khuẩn Ewardseilla ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra một cách hiệu quả
(Hồ Thị Trường Thy et al., 2011).
Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các chủng Bacillus subtilis có phổ
hoạt động rất rộng, ngoài khả năng được biết đến như một loại probiotic - là vi sinh vật
sống, khi được sử dụng với lượng thích hợp sẽ mang lại lợi ích cho sức khỏe của vật
chủ (Araya et al., 2002), B. subtilis vừa có khả năng tổng hợp đạm, IAA, hòa tan lân
và đặc biệt là khả năng kháng khuẩn đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh trên cá. Điều
này chứng tỏ B. subtilis là một ứng cử viên sáng giá trong ngành công nghiệp dược,
hứa hẹn sẽ trở thành một loại kháng sinh vi sinh vật tiềm năng, có thể thay thế một số
loại thuốc kháng sinh tổng hợp trong việc chống lại các tác nhân gây bệnh, đặc biệt là
các mầm bệnh trong nuôi trồng thủy sản.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
75
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Mười bảy dòng vi khuẩn đã được phân lập từ rễ, thân và lá của cây cúc mui.
Tất cả 17 dòng vi khuẩn này đều có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, chỉ có
11 dòng vi khuẩn là tạo được vòng halo, trong đó 4 dòng được phân lập từ rễ, 1 dòng
được phân lập từ thân và 6 dòng được phân lập từ lá thể hiện hiệu quả hòa tan lân và 6
dòng có khả năng tạo vòng kháng khuẩn đều phân lập được từ rễ thân, lá. Ba dòng vi
khuẩn triển vọng nhất ở cả rễ, thân và lá là dòng L5 (tổng hợp NH4+, tổng hợp IAA,
hòa tan lân và tạo vòng kháng khuẩn), dòng R2 (tổng hợp NH4+, tổng hợp IAA, tạo
vòng kháng khuẩn) và dòng T2 (tổng hợp NH4+, tổng hợp IAA, và tạo vòng kháng
khuẩn).
Kết quả giải trình tự gen 16S-rDNA và so sánh với dữ liệu của ngân hàng gene
NCBI. Dòng R2, T2 và R5 được nhận diện là Bacillus sp, Bacillus subtilis, Bacillus
subtilis với tỉ lệ đồng hình là 99%, 95%, 99%.
5.2 Kiến nghị
Khảo sát thêm những đặc tính kháng khuẩn và nghiên cứu cơ chế tạo kháng sinh
của những dòng vi khuẩn phân lập với những dòng vi khuẩn hoặc nấm gây bệnh khác.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
76
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Ái Chi. 2009. Phân lập và đặc tính vi khuẩn nội sinh trong
cây khóm (Ananas comosus L.) trồng trên đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long
An. Tuyển tập hội nghị Công nghệ sinh học phía Nam năm 2009, tại thành phố
Hồ Chí Minh từ ngày 23-24 tháng 10, năm 2009.
Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002. Bài giảng thực tập Vi sinh vật đại cương.
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh Học. Trường Đại học Cần Thơ.
Cao Ngọc Điệp và Phan Thị Nhã. 2011. Phân lập và xác định đặc tính vi khuẩn nội
sinh trong cây khóm (Ananas comosus [L.]) trồng trên đất phèn thị xã Vị Thanh,
Tỉnh Hậu Giang. Tạp chí Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ 9(2):
243-250.
Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Hữu Hiệp, 2011. Giáo trình Vi sinh vật học đại cương. Nhà
xuất bản Đại học Cần Thơ, trang 1; 149 - 151.
Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Hữu Hiệp, 2012. Giáo trình Vi sinh vật học môi trường. Nhà
xuất bản Đại học Cần Thơ, trang 12 - 24.
Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Thanh Tùng, Võ Văn Phước Quệ và Nguyễn Vân Anh, 2011.
Hiệu quả của vi khuẩn cố định đạm Gluconacetobacter diazotrophicus và vi
khuẩn hòa tan lân Pseudomonas stutzeri trên cây mía đường (Saccharum
officinalis L.) trồng trên đất phèn tỉnh Long An. Tạp chí khoa học, Trường Đại
học Cần Thơ 18b: 29-35.
Cao Ngọc Điệp. 2011. Vi khuẩn nội sinh thực vật. Nxb. Trường Đại học Cần Thơ,
trang 1 - 32.
Đỗ Tất Lợi. 2006. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học.
Hồ Thị Trường Thy, Nguyễn Nữ Trang Thùy và Võ Minh Sơn. 2011. Khảo sát một số
đặc tính chủng Bacillus subtilis B20.1 làm cơ sở cho việc sản xuất probiotic
phòng bệnh gan thận mủ do Edwardseilla ictaluti trên cá tra (Pangasius
hypophthamus) nuôi thâm canh. Hội nghị Khoa học Thủy sản Toàn quốc lần thứ
IV, 225-233.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
77
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Huỳnh Kim Diệu và Lê Thị Loan Em, 2011. Sự thuần chủng và hoạt tính kháng khuẩn
của cây sống đời (Kalanchoe pinnata) và cây rau mương (Ludwigia hyssopifolia)
ở đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí khoa học, Trường Đại học Cần Thơ 17b:
289-296.
Huỳnh Kim Diệu, 2010. Hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh trên cá của một số cây
thuốc nam ở đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí khoa học, Trường Đại học Cần
Thơ 15b: 222-229.
Lăng Ngọc Dậu, Nguyễn Thị Xuân Mỵ và Cao Ngọc Điệp. 2007. Khả năng cố định
đạm , hòa tan lân và sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn Azospirillum lipoferum.
Tuyển tập báo cáo Khoa học Hội nghị toàn Quốc 2007 Nghiên cứu cơ bản trong
khoa học sự sống, Quy Nhơn 10-08-2007, NXB KH-KT, trang 445-448.
Lê Thị Thanh Ren, 2010. Phân lập và định danh một số dòng vi khuẩn nội sinh trên
cây mía trồng tại huyện Bình Đại - Tỉnh Bến Tre. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ
chuyên ngành Sinh Thái học. Trường Đại học Cần Thơ.
Lương Đức Phẩm. 2007. Chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy
sản. NXB Nông nghiệp.
Lương Mỹ Thuận. 2009. Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas
hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthamus). Luận văn tốt
nghiệp Đại học chuyên ngành Bệnh học Thủy sản. Trường Đại học Cần Thơ.
Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp. 2011. Phân lập và nhận diện vi khuẩn nội
sinh trong cây cúc xuyên chi (Wedelia trilobata (L.) Hitche.). Tạp chí Khoa học,
Trường Đại học Cần Thơ 18a: 168-176.
Ngô Minh Toàn. 2010. Phân lập và định danh một số dòng vi khuẩn nội sinh trên cây
chuối trồng tại Vĩnh Long. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ chuyên ngành Sinh Thái
học, Trường Đại học Cần Thơ.
Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Thị Yến Ly và Huỳnh Xuân Phong, 2011. Phân lập và
tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn. Tạp chí khoa học,
Trường Đại học Cần Thơ 19a: 176 - 184.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
78
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Nguyễn Hữu Hiệp, Phạm Thị Khánh Vân, Trần Văn Chiêu, Đào Thanh Hoàng và
Nguyễn Khắc Minh Loan, 2005. Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn
Azospirillum bằng kỹ thuật PCR. Tạp chí nghiên cứu khoa học, Trường Đại học
Cần Thơ 4: 119-126.
Nguyễn Hữu Hiệp. 2007. Giáo trình Cố Định Đạm Sinh Học. Viện Nghiên Cứu và
Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Lân Dũng (dịch). 1983. Thực hành vi sinh vật học. NXB Đại học và Trung
học chuyên nghiệp, Hà Nội.
Nguyễn Lân Dũng và Bùi Thị Việt Hà. 2009. Vi sinh vật học. Nxb. Giáo Dục, trang
50-65.
Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến và Phạm Văn Ty. 2007. Vi sinh vật học. Nxb.
Giáo Dục, trang 8 - 9, 320 - 345.
Nguyễn Như Thành. 1990. Vi sinh học công nghiệp. Nxb. Giáo Dục.
Nguyễn Như Thanh. 2004. Vi sinh vật học đại cương. Nxb. Nông nghiệp, trang 93-98.
Nguyễn Quỳnh Nam. 2006. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và thử
đối kháng với E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo. Luận văn Kỹ sư chuyên ngành
Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Nông Lâm.
Nguyễn Thanh Bình. 2013. Phân lập, tuyển chọn và nhận diện dòng vi khuẩn nội sinh
ở cây dưa hấu trồng tại huyện Vũng Liêm – Tỉnh Vĩnh Long. Luận văn tốt
nghiệp Thạc sĩ, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Thành Dũng, 2009. Phân lập những dòng vi khuẩn nội sinh trong cây khóm
trồng ở huyện Vĩnh Thuận tỉnh Kiên Giang. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ chuyên
ngành Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Thị Phương Tâm. 2006. Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn
Azospirillum lipoferum trên cây bắp. Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành
Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Thị Thu Hà, Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp. 2009. Phân lập và đặc tính
của những dòng vi khuẩn nội sinh trong một số cây cỏ chăn nuôi. Tạp chí Công
nghệ Sinh học, 7 (2): 241-250.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
79
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Nguyễn Trọng Thể. 2004. Chọn lọc và sử dụng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas
fluorescens để phòng trừ bệnh do nấm Rhizoctonia solani và Sclerotium rolfsii
gây hại trên cây bông vải và cây cà chua. Luận văn thạc sĩ Khoa học Nông
nghiệp, Đại học Nông lâm, TP. Hồ Chí Minh.
Trần Cẩm Vân. 2004. Giáo trình vi sinh vật học môi trường. Nxb. Đại học Quốc gia
Hà Nội.
Trần Mỹ Xuyên. 2010. Phân lập và Nhận diện một số dòng vi khuẩn có khả năng cố
định đạm có trong rễ, thân, lá hẹ và cây ngò gai trồng tại Vĩnh Long và Cần Thơ.
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ chuyên ngành Sinh Thái học. Đại học Cần Thơ.
Trương Thị Mỹ Duyên. 2009. Nghiên cứu kiểu plasmid và tính kháng thuốc của vi
khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon
hypophthamus). Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Bệnh học Thủy sản.
Trường Đại học Cần Thơ.
Tiếng Anh
Ahmad F, Ahmad I and Khan MS. 2005. Indole acetic acid production by the
indigenous isolates of Azotobacter and florescent Pseudomonas in the presence
and absence of tryptophan. Turk J Bio 29:29-34.
Ali M.S and Jahangir MA. 2002. Bis-bithiophene from Tridax procumbens L.
(Asteraceae). Nat Prod Lett. 16(4):217-221.
Ali M.S, Jahangir M, Hussain S and Choudhary M. 2002. Inhibition of a-glucosidase
by oleanolic acid and its synthetic derivatives. Phytochemistry 60:295-299.
Andrews JH. 1992. Biologycal control in the phyllosphere. Ann. Rev. Phytopathol.
30:603-635.
Aniel Kumar O. and L. Mutyala Naidu. 2011. Antibacterial potential of Tridax
procumbens agaisnt human pathogens. International Journal of Pharmaceutical
Sciences 2:21-30.
Arash Rafat, Koshy Philip and Sekaran Muniandy, 2011. A novel source of bioactive
compounds: Endophytic bacteria isolated from Centella asiatica. Journal of Pure
and Applied Microbiology 6: 1-9.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
80
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Aravind.R.A, Kumar.S.J, Eapen and K.V. Ramana, 2009. Endophytic bacterial flora in
root and stem tissues of black pepper (Piper nigrum L.) genotype isolation
identification and evaluation against Phytophthora capsici. Letters in Applied
Microbiology 48: 58-64.
Artidtaya Bhoonobtong, Sasiphimol Sawadsitang, Sirirath Sodngam and Wiyada
Mongkolthanaruk. 2012. Characterization of Endophytic Bacteria, Bacillus
amiloliquefaciens
for
antimicrobial
Agents
Production.
International
Proceedings of Chemical, Biological and Environmenta 40:6-11.
Bashan Y. 1986. Significance of timing and level of inoculation with rhizosphere
bacteria on wheat plants. Soil Biol Biochem 18:297-301.
Becking JH. 1963. Fixation of molecular nitrogen by an aerobic Vibrio or Spirillum.
Antonie Van Leeuwenhoek 29:326.
Benhamou N, Kloepper JW and Quadi-Hallman A. 1996. Induction of defence ralated
ultrastructural modifications in pea root tissues inoculated with endophytic
bacteria. Plant Physiol 112:919-929.
Berg G, Elbert L and Hartmann A. 2005. The rhizosphere as a resevoir for oppturnistic
human pathogenic bacteria. Environ Microbiol 7:1673-1685.
Berg.Howard R..Max E. Tyler. Norman J.Novick. Vimla Vasil. and Indra K. Vasil,
1980.
Biology
of
Azospirillum-sugarcane
association:
enhancement
of
nitrogenase Activity. Appl Environ Microbiol, 39: 642-649.
Biswas.J.C..J. K. Ladha. and F.B. Dazzo, 2000. Rhizobia inoculation improves
nutrient uptake and growth of lowland rice. Soil Science Society of America
Journal 64: 1644-1650.
Boddey RM, Oliveira OCD, Urquiaga S, Reis VM, Olivares FL, Baldani VLD and
Dobereiner J. 1995. Biological nitrogen fixation associated with sugar cane and
rice: Contributions and prospects for improvement. Plant and Soil 174:17091713.
Broek.A.Vande and Vanderleyden J., 1995. Genetics of the Azospirillum –plant root
association. Critical Reviews in Plant Sciences 14: 445-466.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
81
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Brown ME. 1976. Role of Azotobacter paspali in association with Paspalum notatum.
J Appl Bacteriol 40:341-348.
Caballero-Mellado J, Martinez-Aguilar L, Paredes-Valdez G and Estrada PDLS. 2004.
Burkholderia unamae sp. nov., an N2-fixing rhizospheric and endophytic. Int J
Syst Evol Microbiol 54:1165-1172.
Caballero-Mellado MJ, Lemus JO, Santos PE and Aguilar LM. 2007. The tomato
rhizosphere, an enviroment rich in nitrogen-fixing Burkholderia species with
capabilities of interest for agriculture and bioremediation. Appl Environ
Microbiol 73:5308-5319.
Chaintreuil C, Giraud E, Prin Y, Lorquin J, Bâ A, Gillis M, de Lajudie P and Dreyfus
B. 2000. Photosynthetic bradyrhizobia are natural endophytes of the African wild
rice Oryza breviligulata. Appl Environ Microbiol 66:5437-5447.
Chauhan B S and Germination D E. 2008. Ecology of Two Troublesome Asteraceae
Spieces of Rainfed Rice: Siam Weed (Chromolaena odorata) and Coat Buttons
(Tridax procumbens). Johnson Weed Science 56:567-573.
Chen C, Bauske EM, Musson G, Rodriguezkabana R and Kloepper JW. 1995.
Biological control of Fusarium Wilt on cotton by use of endophytic bacteria.
Bio. Control 5:83-91.
Chen, Wen-Hao, Ma, Xing-Ming, Wu, Quan-Xiang, Shi and Yan-Ping. 2008.
Chemical constituent diversity of Tridax procumbens. Canadian Journal of
Chemistry 86(9):892-898 (7).
Cleidson Valgas, Simone Machado de Souza, Elza FA Smânia and Artur Smânia Jr.
2007. Screening methods to determine antibacterial activity of natural products.
Brazillian Journal of Microbiology 38:369-380.
Coenye T and Vandamme P. 2003. Diversity and significance of Burkholderia species
occupying diverse ecological niches. Environ Microbiol 5:719-129.
Cui L, Sun Z, Sun F, Yuan J, Tian H, Wang L and Xu H. 2003. Isolation of endophytic
bacteria from potato and selection of antagonistic bacteria to potato ring rot
disease. Acta Phytopathol. Sinica 33:353-358.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
82
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Döbereiner J and Day J.M. 1976. Associative symbiosis in tropical grasses:
characterization of Microorganisms and dinitrogen fixing sites. In: Proceedings
of the First International Symposium on Nitrogen Fixation. Edited by W.E
Newton and C.J Nyman. Washington State University Press, Pullman, Wash.
pp:518-538.
Döbereiner J. 1974. History and new perspectives of diazotrophs in association with
non-leguminous plants. Symbosis 13:1-13.
Dowler WM and Weaver DJ. 1974. Isolation and characterization of flourescent
Pseudomonas from apparently healthy peach trees. Phytopathology 65:233-236.
Duijff BJ, Gianinazzi-Pearsonad V and Lemanceau P. 1997. Involvement of the outer
membrane lipopolysaccharides in the endophytic colonization of tomato roots by
biocontrol Pseudomonas fluorescens strain WC417r. New Phytol 135:325-334.
Elbeltagy, A., Nishioka, K., Sato, T., Suzuki, H., Ye, B., Hamada, T., Isawa, T. and
Mitsui, H., 2001. Endophytic Colonization and In Planta Nitrogen Fixation by
Herbaspirillum sp. Isolated from Wild Rice Species. Applied and Environmental
Microbiology 67 (11):5285-5293.
Elberltagy A, Nishioka K, Sato T, Suzuki H, Ye B, Hamada T, Isawa T, Mitsui H and
Minamisawa K. 2001. Endophytic colonization and in planta nitrogen fixation by
a Herbaspirillum sp. isolation from wide rice species. Appl Environ Microbiol
38:5285-5293.
Elmerich C. 2007. Historical perspective: From bacterization to endophytes. In
Associative and
Endophytic Nitrogen-fixing Bacteria and Cyanobacterial
Associations, 1-20.
G.M Nazeruddin, Shirish S. Pingale and Samir S. Shaikh. 2011. Pharmacologycal
review of Tridax procumbens L. Der Pharmacia Sinica 2(4):172-175.
Ganju Kuldeep and Pathak A.K. 2013. Pharmacognostic and Phytochemical
Evaluation of Tridax procumbens Linn. Journal of Pharmacognosy and
Phytochemistry 1(5):42-46.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
83
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Glickmann E, Gardan L, Jacquet S, Hussain S, Elasri M, Petit A and Desseaux Y.
1998. Auxin Production is a common feature of most pathovars of Pseudomonas
syringae. Molecular Plant-Microbe Interactions 11:156-162.
Hallmann J, Quadt- Hallmann A, Mahaffee WF, Kloepper JW. 1997. Bacterial
endophytes in agricultural crops. Can J Microbiol 43:895-914.
Hallmann J. 2001. Plant Interactions with Endophytic bacteria, In: Biotic Interaction in
Plant Pathogen, Jerger, Spence, pp. 80-120.
Harari A, Kigel J and Okon Y. 1988. Involvement of IAA in the interaction between
Azospirillum brasilense and Panicum miliaceum roots. Plant and Soil 110:275282.
Hardoim, PR., van Overbeek, LS., van Elsas, JD. 2008. Properties of bacterial
endophytes and their proposed role in plant growth. Trends Microbiol 16:463471.
Harris GH, Hesterman OB, Paul EA, Peters SE and Jahnke RR. 1994. Fate of Legume
and Fertilizer Nitrogen-15 in a Long-Term Cropping Systems Experiment.
Agron. J. 86:910-915.
Hill S, Drozd JW and Postgate JR. 1972. Enviromental effects on the growth of
nitrogen-fixing bacteria. J App Chem Biotechnol 22:54-58.
Hira Muzzamal, Rabbia Sarwar, Imran Sajid and Shahida Hasnain, 2012. Isolation,
Identification and Screening of Endophytic Bacteria Antagonistic to Biofilm
Formers. Deparment of Microbiology and Molecular Genetics 44 (1):249 -257.
Hung PQ and Annapurna K. 2004. Isolation and characterization of endophytic
bacteria in soybean (Glycine sp.). Omonrice 12:92-101.
Hurek T, Burgagraf S, Woese CR and Reinhold-Hurek B. 1993. 16S rRNA-targeted
polymerase chain reaction and oligonucleotide hybridization to screen for
Azoarcus spp., grass-associated diazotrophs. Appl Environ Microbiol 59:38163824.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
84
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Hurek T, Reinhold-Hurek B, Montagu MV and Kellenberger E. 1994. Root
colonization and systemic spreding of Azoarcus sp. BH72 in grasses. J of
Bacteriol 176:1913-1923.
Hwangbo H, Park RD, Kim YW, Rim YS, Park KH, Kim TH, Suh JS and Kim KY.
2003. 2-ketogluconic acid production and phosphate solubilization by
Enterobacter intermedium. Cur Microbiol 47:87-92.
I.E. Luis- Villaseñor, A. L. Campa- Córdova and F.J. Ascencio-Valle. 2012. Probiotic
in Larvae and Juvenile Whiteleg Shrimp Litopenaeus vannamei. Centro de
Investigaciones Biológicas del Noroeste S.C 27: 601-622.
Jain Ankita and Amita Jain. 2012. Tridax procumbens (L.): A weed with icmense
medicinal importance: A review. International Journal of Pharma and Bio
Sciences 3(1):544-552.
Jha PN and Kumar A. 2007. Endophytic colonization of Typha australis by a plant
growth-promoting bacterium Klebsiella oxytoca strain GR-3’’. JI of Appl
Microbiol 25:1364-5072.
Jude C. lkeuwunchi, Catherine C. lkeuwunchi and Ngozi gboh M. I. 2009. Chemical
profile of Tridax procumbens Linn. Pakistan Journal of Nutrition 8(5):548-550.
Khalil S and Mandurah HM. 1989. Growth and metabolic changes of cowpea plants as
effected by water deficiency and indole acetic acid. Agro Crop Sci 163:160-166.
Kloepper JW and Beauchamp CJ. 1992. A review of issues related to measuring
colonization of plant roots by bacteria. Can J Microbiol 38: 1219-1232.
Kloepper JW, Schippers B and Bakker PAM. 1992. Proposed elimination of the term
endozhizosphere. Phytophathology 82:726-727.
Kobayashi DY and Palumbo JD. 2000. Bacterial endophytes and their effects on plants
and uses in agriculture. Microbial Endophytes 3:199-213.
Koga J, Adachi T and Hidaka H. 1991. Molecular cloning of the gene for
indolepyruvate decarboxylase from Enterobacteria cloacae. Mol Gen Genet
226:10-16.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
85
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Kuiper I, Lagendijk EL, Bloemberg GV and Lutenberg BJ. 2004. Rhizoremediation: a
beneficial plant-microbe interaction. Mol Plant Microbe Interact 17:6-15.
Lata H, Lil XC and Siva B. 2006. Identification of IAA - producing endophytic
bacteria from micropropagated Echinacea plants using 16S rRNA sequencing.
Tissue and Organ Culture 85:353-9.
Lindow SE and Brandt MT. 2003. Microbiology of phyllosphere. Appl Environ
Microbiol 69:1875-1883.
Lodewyckx C, Vangronsveld I, Porteous F, Moore ERB, Taghavi S, Mazgeay M, and
van der Lelie D. 2002. Endophytic bacteria and their potential application. Crit
Rev Plant Sci 21:583-606.
Lü ZX and Song W. 2011. Research of indole-3-acetic acid biosynthetic pathway of
Klebsialla oxytoca SG-11 by HPLC and GC-MS. Se Pu 18(4):328.
M. K. Oladunmoye. 2006. Immunodulatory effects of ethanolic extract of Tridax
procumbens on swiss Albino rats orogastrically dosed with Pseudomonas
aeruginosa (NCBI 950). International Journal of Tropical Medicine 1(4):152155.
Mahafee WF and Kloepper JW. 1997. Bacterial communication of the rhizosphere and
endorhiza associated with field-grown cucumber plants inoculated with a plant
growth-promoting rhizobacterium of its genetically modified derivative. Can J
Microbiol 43:344-353.
Mahato R.B. and Chaudhary R.P. 2005. Ethnomedicinal study and antibacterial
activities of selected plants of Palpa district, Nepal. Scientific World 3(3):26-31.
Mano H and Morisaki H. 2008. Endophytic Bacteria in the Rice Pkant (Minireview).
Microbes Environ 23(2):109-117.
Martinez-Aguilar L, Diaz R, Pena-Cabriales JJ, Estrada PDLS, Dunn MF, CaballeroMellado J. 2008. Multichromosomal genome structure and confirmation of
diazotrophy in novel plant-associated Burkholderia Species. Environ Microbiol
74:4574-4579.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
86
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Mirac Yilmaz, Haluk Soran and Yavuz Beyalti. 2006. Antimicrobial activities of some
Bacillus spp. Strains isolated from the soil. Microbial. Res. 161: 127-131.
Mounlin L, Munive A, Dreyfus B and Biovin-Masson C. 2001. Nodulation of legumes
by members of the β-subclass of proteobacteria. Nature 411:948-950.
Muthukumarasamy RI, Revathi G, Seshadri S and Lakshminarasimhan C. 2002b.
Gluconacetobacter
diazotrophicus
(syn.
Acetobacter
diazotrophicus),
a
promising diazotrophic endophyte in tropics. Current Science 83:137-145.
N. E. Welker and L. Leon Campbell. 1967. Unrelatedness of Bacillus
amyloliquefaciens and Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology 94(4):11241130.
Okon Y and Labandera-Gonzalez CA. 1994. Agonomic applicationstion of
Azospirillum an evaluation of 20 years worldwide field inoculation. Soils Bio
Biochem 26:1591-1601.
Osullivan LA, Mahenthiralingam E. 2005. Biotechnological potential within the genus
Burkholderia. Lett Appl Microbial 41:8-11.
Paulsen IT, Press CM, Ravel J, Kobayashi DY, Myers GS, Mavrodi DV, DeBoy
RT, Seshadri
R, Ren
Q, Madupu
R, Dodson
RJ, Durkin
AS, Brinkac
LM, Daugherty SC, Sullivan SA, Rosovitz MJ, Gwinn ML, Zhou L, Schneider
DJ, Cartinhour SW, Nelson WC, Weidman J, Watkins K, Tran K, Khouri
H, Pierson EA, Pierson LS 3rd, Thomashow LS and Loper JE. 2005. Complete
genome sequence of the plant commensal Pseudomonas fluorescens Pf-5. Nat
Biotechnol 23(7):873-878.
Persello-Cartieaux F, Nusaume L and Robaglia C. 2003. Tales from the underground:
molecular plantrhizobacteria interactions. Plant Cell and Environment 26:189199.
Pillay VK and Norwak J. 1997. Inoculum density, temperature, and gennotype effects
on in vitro growth promotion and epiphytic and endophytic colonization of
tomato (Lycospersicon esculentum L.) seedlings inoculated with a pseudomonad
bacterium. Can J Microbiol 43:354-361.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
87
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Quispel A. 1992. A search of signal in endophytic microorganisms, In: Verma, DPS
(Eds.) Molecular Signals in Plant-Microbe Communication, CRS Press, Boca
Raton, FL, 457-491.
Raddadi N, Cherif A and Boudabous A. 2008. Screening of plant growth promoting
traist of Bacillus thuringensis. Ann Microbiol 58:47-52.
Raju T S and Davidson E A. 1994. Structural feature of water soluble novel
polysaccharide components from leaves of Tridax procumbens Linn 258:243254.
Rangarajan S, Saleena LM, Vasudevan P and Nair S. 2003. Biological suppression of
rice diseases by Azospirillum under saline soil condition. Plant Soil 251:73-82.
Reddy Setharami TVV, Prasanthi S and Naidu Ramarao BVA. 2006. Traditional
phytherapy for jaundice in Herbal Medicine (Ed). PC Trivedi Aavishkar
Publishers, 30-68.
Reinhold B, Hurek T, Fendrik I, Pots B, Gillis M, Kersters M, Thielemans S and
Deley J. 1987. Azospirillum halopraleferens sp. nov., a nitrogen-fixing organism
associated with the roots of Kallar grass (Leptochloa fusca L.Kurth). Int J Syst
Bacteriol 37:43-51.
Reinhold B, Hurek T, Neimann EG and Fendrik K. 1986. Close association of
Azospirillum and diazotrophic rods with different root zones of Kallar grass.
Appl Environ Microbiol 52:520-526.
Reinhold-Hurek B and Hurek T. 1988. Life in grasses: Diazotrophic endophytes.
Trend Microbiol 6:139-144.
Reva O. N., Dixelius C., Meijer J. and Friest F. G. 2004. Taxonomic characterization
and
plant
colonizing
abilities
of
some
bacteria
related
to
Bacillus
amylolyquefaciens and Bacillus subtilis. FEMS Microbio. Eco. 48(2):249-259.
Rong-lin He, Guo-ping Wang, Xiao-Hong Liu, Chu-long Zhang and Fu-cheng Lin.
2009. Antagonistic bioactivity of an endophytic bacterium isolated from
Epimedium brevicornu Maxim. African Journal of Biotechnology 8 (2):191-195.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
88
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Roos LCM and Hattingh MJ, 1983. Scanning electron microscopy of Pseudomonas
syringae Pv. Morspunorum on sweet cherry leaves. Phytopathol Z 108: 18-25.
Roos LMM, Hattingh MJ. 1983. Scanning electron microscopy of Pseudomonas
syringae pv. morsprunorum on sweet cherry leaves. Phytopathol Z 108:18-25.
Rovira A.D, Graham R.D and Ascher J.S. 1983. Reduction in infection of wheat roots
by Gaeumanomyces graminis var. tritici with application of manganese to soil.
In: Parker C.A., Rovira A.D, Moore K.J, Wong P.T.W, Kollmorgen J.F (Eds.),
Ecology and Management of Soilborne Plant Pathogens. APS, Minneapolis,
USA.
Runsheg Xu, Jing Zhang and Ke Yuan. 2010. Two flavones from Tridax procumbens
Linn. Molecules 15:6357-6364.
Ryan, RP, Germaine K, Franks A, Ryan DJ, Dowling DN. 2008. Bacterial endophytes:
recent development and applications. MEMS Microbiol. Lett., 1-9.
Saini A, Wadhwani C, Kaur B and Malik C P. 2008. Tissue cuture studies in Tridax
procumbens. Journal Plant Sciences 24:85-88.
Salme Timmusk, Nina Grantcharova, E. Gerhart and H. Wagner. 2005. Paenibacillus
polymyxa Invades Plant Roots and Forms Biofilms. Applied and Environmental
Microbiology, 71 (11): 7292- 7300.
Scarpella E, Rueb S and Meijer AH. 2003. The Radicleless gene is required for
vascular pattern formation in rice. Development 130:645-658.
Schultz B and Boyle C. 2005. The endophytic continuum, Mycol Res 109:661-686.
Seshadri S, Muthurumarasamy R, Laksminarasimha C and Ignacirunthu S. 2000.
Solubilization of inorganic phosohates by Azospirillum halopraeferans. Current
Science 79:565-567.
Sheng Qin, Jie Li, Hua Hong Chen, Guo Zhen Zhao, Wen Yong Zhu, Cheng Lin
Jiang, Li Hua Xu and Wen Jun Li. 2009. Isolation, Diversity, and Antimicrobial
Activity of Rare Actinobacteria from Medicinal Plants of Tropical Rain Forests
in Xishuangbanna, China. Applied and Environmental Microbiology, 75 (19):
6176- 6186.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
89
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Siciliano SD, Fortin N, Mihoc A, Wisse G, Labelle S, Beaumier D, Oulettette D, Roy
R, Whyte LG, Banks MK, Schwab P, Lee K and Greer CW. 2001. Selection of
specific endophytic bacterial genotypes by plants in response to soil
contamination. Appl Environ Microbiol 67:2469-2475.
Singh K and Ahirwar V. 2010. Acute and chronic toxicity study of Tridax procumbens
on haemoglobin percent and blood sugar level of sprague dawley rats. IJPI’s
Journal of Pharmacology and Toxicology 1(1):1-6.
Sneha Mundada and Ruchi Shivhare. 2010. Pharmacology of Tridax procumbens a
Weed: Review. International Journal of PharmTech Research 2(2):1391-1394.
Somers E, Patcek D, Gysegom P, Srinivasan M and Vanderleyden J. 2005.
Azospirillum brasilense produces the auxin-like phenylacetic acid by using the
key enzyme for indole-3-acetic acid biosynthesis. Appl Environ Microbiol
71:1803-1810.
Sprent JI and James EK. 1995. N2-fixation by endophytic bacteria, Springer-Verlag,
Berlin, 15-30.
Stein T, Heinzmann S, Düsterhus S, Borchert S and Entian K.D. 2005. Expression and
functional analysis of subtilin immunity genes spalFEG in the subtilin-sensitive
host Bacillus subtillis MO1099. J Bacteriol 187:822-828.
Strauch M. A., Bobay B. G., Cavanagh J., Yao F., Wilson A. and Breton Y. L. 2007.
Abh and AbrB Control of Bacillus subtilis antimicrobial gene expression. J.
Bacteriol 189(21):7720-7732.
Strobel G. 2003. Endophytes as source of bioactive products. Microbes and Infection
5: 535-544.
Sturz AV, Christie BR, Nowak J. 2000. Bacterial endophytes: potential role in
developing sustainable systems of crop production. Crit. Rev. Plant. Sci. 19:1-30.
Subramanian SS, Ramakrishnan S and Nair AGR. 1968. Isolation of luteolin and
glucolutyeolin from the flowers of Tridax procumbens. Curr. Sci. 37:465-469.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
90
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Sudipta Roy and Debdulal Banerjee. 2010. Isolation of antimicrobial compound by
endophytic bacteria from Vinca rosea. International Journal of Current Research
5:47-51.
Swetha Sunkar and C Valli Nachiyar. 2012. Biogenesis of antibacterial silver
nanoparticles
using
the
endophytic
bacterium
Bacillus
cereus isolated
from Garcinia xanthochymus. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 2
(12): 953- 959.
Syed Baker and Sreedharamurthy Satish. 2013. Bioprospecting of endophytic bacterial
plethora from medicinal plants, Plants Sciences Feed 3(3): 42 - 45.
Syed Mohd. Danish Rizvi, Mohd. Zeeshan, Salman Khan, Deboshree Biswas, Othman
A. Al-Sagair and Jamal M. Arif. 2011. Evaluation and distribution of
antibacterial potential in the aerial part of wild Tridax procumbens. J. Chem.
Pharm. Res. 3(2): 80-87.
Taddei A and Rosas-Romero AJ. 2000. Bioactivity studies of extracts from Tridax
procumbens. International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology
7(3):235-238.
Tan Z, Hurek T, Reinhold-Hurek B. 2003. Effect of N-fertilizer, plant genotype and
environmental conditions on nifH gene pools in roots of rice. Environ Microbiol
5:1009-1015.
Tarrand JJ, Krieg NR and Dobereiner J. 1978. A taxonomy study of Spirillum
lipoferum group with descriptions of a new genus. Azospirillum lipoferum
(Beijerinck) comb. nov. and Azospirillum brasilense sp. nov. Canadian J
Microbiol 24:967-980.
U. Tiwari, B. Rastogi, P. Singh, D. K. Saraf and S. P. Vyas. 2004. Immunodulatory
effects of aqueous extract of Tridax procumbens in experimental animals.
Journal of Ethnopharmacology 92:113-119.
V. Bharathi, B. Varalakshmi, S. Gomathi, A. Shanmuga Priya and T. Karpagam. 2012.
Antibacteria activity of Tridax procumbens Linn. International Journal of
Pharma Sciences and Research 3(4):364-367.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
91
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
V. Bharathi, B. Varalakshmi, S. Gomathi, A. ShanmugaPriya, T. Karpagam. 2012.
Antibacterial activity of Tridax procumbens Linn. International Journal of
Pharma Sciences and Research 3(4):364-367.
Van, T.V., S. Ngoke, O. Berge, D. Faure, R. Bally, P. Hebbar and T. Heulin. 1997.
Isolation of Azospirilium lipoferum from the rhizosphere of rice by a new,
simple method. Can. J. Microbiol 43: 486-490.
Vande Broek A, Lambrecht M, Eggermont K and Vanderleyden J. 1999. Auxins
upregulate expression of the indole-3-pyruvate decarboxylase gene in
Azospirillum brasilense. J Bacteriol 181:1338-1342.
Vasuvat, Y., B. Fangcham, S. Siripin, D. Fusang and P. Chanaram.1986. Yield
maximization of feed grain by associative N2-fixing bacteria. In: Proceedings of
International Serminar on Yield Maximization of Feed Grains Through Soil and
Fertilizer Management 12-16.
Verma R.k and Gupta M.M. 1998. Lipid constituents of
Tridax procumbens.
Phytochemistry 27(2):459-163.
Vichai Domrongpokkaphan and Penkhae Wanchaitanawong. 2006. In vitro
Antimicrobial Activity of Bacillus spp. Agaisnt Pathogenic Vibrio spp. In Black
Tiger Shrimp (Penaeus monodon). Kasetsart J. (Nat. Sci.) 40(4): 949-957.
Wellington B, Marcela TB. 2004. Delivery methods for introducing endophytic
bacteria into maize. Bio. Control 49:315-322.
Yoga Latha L, Darah I, Sasidharan S and Jain K, 2009. Antimicrobial Activity of
Emilia sonchifolia DC., Tridax procumpens L. and Vernonia cinerea L. of Astera
Familly: Potential as Food Preservatives. Mal J Nutr 15 (2): 223-231.
Zinniel KD, Lambrecht P, Haris NB, Feng Z, Kuczmarski D, Higley P, Ishimaru C,
Arunakumari A, Barletta GR and Vidaver AK. 2002. Isolation and
characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and
prairie plants. Appl Environ Microbiol 59:2198-2208.
Zinniel KD, Lambrecht P, Haris NB, Feng Z, Kuczmarski D, Higley P, Ishimaru C,
Arunakumari A, Barlertta GR, Vidaver AK. 2002. Isolation and characterization
Chuyên ngành Vi sinh vật học
92
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants. Appl
Environ Microbiol 59:2198-2208.
Trang Web
http://duybiotech.wordpress.com/2010/12/22/vi-khu%E1%BA%A9nn%E1%BB%99i-sinh-th%E1%BB%B1c-v%E1%BA%ADt-endophytic-bacteria%E1%BB%A9ng-d%E1%BB%A5ng-va-d%E1%BB%8Bnhh%C6%B0%E1%BB%9Bng-phat-tri%E1%BB%83n-trong-th%E1%BB%9Did%E1%BA%A1i-ngay-nay/ (ngày 9/7/2013)
http://duoclieu.net/caythuocvn2.html (ngày 9/7/2013)
http://sieuphanbon.com/detail.php?id=108&lg=1 (ngày 9/7/2013)
http://vi.wikipedia.org/wiki/C%E1%BA%A7n_Th%C6%A1 (ngày 26/7/2013)
http://125.235.10.97/opacdigital/wpDetail.aspx?Id=3971 (ngày 02/08/2013)
http://www.journalcra.com/?q=node/198 (ngày 03/8/2013)
http://forum.bacsi.com/cay-thuoc-nam/cuc-mui-94144.html (ngày 03/8/2013)
http://www.freshfromflorida.com/pi/weed-of-the-month/0509-tridax-procumbens.html
(ngày 03/8/2013)
https://en.wikipedia.org/wiki/Tridax_procumbens (ngày 03/8/2013)
http://www.sciencedomain.org/abstract.php?iid=234&id=14&aid=1608#.UfIK5IVPTn (ngày 03/8/2013)
http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_amyloliquefaciens (ngày 03/8/2013)
http://en.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli (ngày 03/8/2013)
http://duoclieu.net/caythuocvn2.html (ngày 20/8/2113)
http://cantho.gov.vn (ngày 23/11/2013)
http://danhydatviet.vn/vi/news/Duoc-lieu/Cuc-mui-5441/( ngày 24/11/2013)
http://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas (ngày 24/11/2013)
http://microbewiki. kenyon.edu/index.php/Pseudomonas_fluorescens (ngày
24/11/2013).
http://en.wikipedia.org/wiki/Klebsiella (ngày 24/11/2013)
http://en.wikipedia.org/wiki/Enterobacter (ngày 24/11/2013)
Chuyên ngành Vi sinh vật học
93
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bacillus_amyloliquefaciens (ngày
25/11/2013)
http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=1691 (ngày 25/11/2013)
Chuyên ngành Vi sinh vật học
94
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Kết quả thí nghiệm.
1. Kết quả khảo sát hàm lượng ammonium được tạo ra do các dòng vi khuẩn phân
lập được trên môi trường PDA.
Bảng 15. Giá trị OD và lượng đạm của vi khuẩn trên môi trường NFb sau 1
giờ chủng
Dòng vi khuẩn
R1
R2
R5
R6
R7
R8
T1
T2
T3
T4
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
OD 1
0,021
0,024
0,022
0,029
0,023
0,03
0,025
0,024
0,027
0,029
0,03
0,024
0,03
0,023
0,02
0,032
0,021
Đạm 1 (µg/ml)
0,006
0,026
0,013
0,058
0,019
0,065
0,032
0,026
0,045
0,058
0,065
0,026
0,065
0,019
0
0,077
0,006
OD 2
0,02
0,022
0,021
0,027
0,025
0,028
0,025
0,023
0,027
0,03
0,03
0,026
0,027
0,024
0,022
0,032
0,022
Đạm 2 (µg/ml)
0
0,013
0,006
0,045
0,032
0,052
0,032
0,019
0,045
0,065
0,065
0,039
0,045
0,026
0,013
0,077
0,013
OD 3
0,02
0,025
0,021
0,028
0,026
0,028
0,026
0,022
0,03
0,029
0,03
0,024
0,028
0,023
0,022
0,032
0,022
Đạm 3 (µg/ml)
0
0,032
0,006
0,052
0,039
0,052
0,039
0,013
0,065
0,058
0,065
0,026
0,052
0,019
0,013
0,077
0,013
Bảng 16. Giá trị OD và lượng đạm của vi khuẩn trên môi trường NFb ở
ngày 2 sau khi chủng
Dòng vi khuẩn
R1
R2
R5
R6
R7
R8
T1
T2
T3
T4
L1
L2
L3
L4
L5
OD 1
0,019
0,016
0,018
0,022
0,017
0,02
0,017
0,018
0,021
0,017
0,018
0,02
0,02
0,019
0,019
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Đạm 1(µg/ml)
0,105
0,081
0,097
0,129
0,089
0,113
0,089
0,097
0,121
0,089
0,097
0,113
0,113
0,105
0,105
OD 2
0,022
0,017
0,017
0,021
0,016
0,019
0,017
0,02
0,022
0,017
0,022
0,022
0,022
0,022
0,023
Đạm 2 (µg/ml)
0,129
0,089
0,089
0,121
0,081
0,105
0,089
0,113
0,129
0,089
0,129
0,129
0,129
0,129
0,137
OD 3
0,021
0,016
0,018
0,023
0,018
0,018
0,017
0,02
0,023
0,016
0,02
0,02
0,021
0,019
0,021
Đạm 3 (µg/ml)
0,121
0,081
0,097
0,137
0,097
0,097
0,089
0,113
0,137
0,081
0,113
0,113
0,121
0,105
0,121
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
L6
L7
0,02
0,022
0,113
0,129
Trường ĐHCT
0,024
0,019
0,145
0,105
0,024
0,021
0,145
0,121
Bảng 17. Giá trị OD và lượng đạm của vi khuẩn trên môi trường NFb ở
ngày 4 sau khi chủng
Dòng vi khuẩn
R1
R2
R5
R6
R7
R8
T1
T2
T3
T4
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
OD 1
0,017
0,017
0,018
0,027
0,02
0,024
0,023
0,022
0,027
0,018
0,022
0,023
0,024
0,027
0,027
0,028
0,026
Đạm 1 (µg/ml)
0,143
0,143
0,15
0,218
0,165
0,195
0,188
0,18
0,218
0,15
0,18
0,188
0,195
0,218
0,218
0,226
0,211
OD 2
0,019
0,018
0,02
0,026
0,021
0,023
0,026
0,021
0,028
0,018
0,024
0,024
0,025
0,026
0,026
0,026
0,026
Đạm 2 (µg/ml)
0,158
0,15
0,165
0,211
0,173
0,188
0,211
0,173
0,226
0,15
0,195
0,195
0,203
0,211
0,211
0,211
0,211
OD 3
0,018
0,018
0,018
0,027
0,02
0,025
0,025
0,024
0,027
0,019
0,022
0,025
0,028
0,027
0,026
0,028
0,025
Đạm 3 (µg/ml)
0,15
0,15
0,15
0,218
0,165
0,203
0,203
0,195
0,218
0,158
0,18
0,203
0,226
0,218
0,211
0,226
0,203
Bảng 18. Giá trị OD và lượng đạm của vi khuẩn trên môi trường NFb ở
ngày 6 sau khi chủng
Dòng vi khuẩn
R1
R2
R5
R6
R7
R8
T1
T2
T3
T4
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
OD 1
Đạm 1 (µg/ml)
OD 2
Đạm 2 (µg/ml)
OD 3
Đạm 3 (µg/ml)
0,026
0,015
0,016
0,025
0,018
0,017
0,023
0,025
0,027
0,015
0,02
0,021
0,022
0,028
0,029
0,024
0,021
0,128
0,028
0,037
0,119
0,055
0,046
0,101
0,119
0,138
0,028
0,073
0,083
0,092
0,147
0,156
0,11
0,083
0,025
0,016
0,017
0,024
0,02
0,018
0,023
0,024
0,026
0,015
0,023
0,019
0,019
0,031
0,026
0,026
0,023
0,119
0,037
0,046
0,11
0,073
0,055
0,101
0,11
0,128
0,028
0,101
0,064
0,064
0,174
0,128
0,128
0,101
0,026
0,015
0,017
0,026
0,018
0,021
0,021
0,024
0,03
0,017
0,023
0,022
0,022
0,029
0,024
0,026
0,021
0,128
0,028
0,046
0,128
0,055
0,083
0,083
0,11
0,165
0,046
0,101
0,092
0,092
0,156
0,11
0,128
0,083
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
2. Kết quả khảo sát hàm lượng IAA được tạo ra do các dòng vi khuẩn phân
lập được trên môi trường PDA.
Bảng 19. Giá trị OD và lượng IAA của vi khuẩn trên môi trường NFb khi
không bổ sung Tryptophane ở ngày 2
Dòng vi khuẩn
OD 1
IAA 1 (µg/ml)
OD 2
IAA 2 (µg/ml)
OD 3
IAA 3 (µg/ml)
R1
0,047
8,25
0,049
8,75
0,047
8,25
R2
R5
0,05
0,065
9
12,75
0,05
0,062
9
12
0,052
0,064
9,5
12,5
R6
R7
0,04
0,042
6,5
7
0,038
0,042
6
7
0,04
0,043
6,5
7,25
R8
T1
0,053
0,051
9,75
9,25
0,05
0,052
9
9,5
0,054
0,049
10
8,75
T2
T3
0,052
0,043
9,5
7,25
0,053
0,046
9,75
8
0,053
0,043
9,75
7,25
T4
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
0,039
0,038
0,045
0,038
0,032
0,045
0,029
0,04
6,25
6
7,75
6
4,5
7,75
3,75
6,5
0,035
0,034
0,042
0,041
0,036
0,041
0,03
0,04
5,25
5
7
6,75
5,5
6,75
4
6,5
0,038
0,039
0,041
0,043
0,035
0,045
0,03
0,038
6
6,25
6,75
7,25
5,25
7,75
4
6
Bảng 20. Giá trị OD và lượng IAA của vi khuẩn trên môi trường NFb khi
không bổ sung Tryptophane ở ngày 4
Dòng vi khuẩn
OD 1
IAA 1 (µg/ml)
OD 2
IAA 2 (µg/ml)
OD 3
IAA 3 (µg/ml)
R1
R2
R5
R6
R7
R8
T1
T2
T3
T4
L1
L2
L3
L4
0,09
0,089
0,087
0,085
0,083
0,079
0,078
0,081
0,072
0,076
0,083
0,061
0,083
0,059
14,33
14,17
13,83
13,5
13,17
12,5
12,33
12,83
11,33
12
13,17
9,5
13,17
9,17
0,09
0,085
0,085
0,081
0,08
0,081
0,077
0,081
0,075
0,08
0,08
0,064
0,085
0,061
14,33
13,5
13,5
12,83
12,67
12,83
12,17
12,83
11,83
12,67
12,67
10
13,5
9,5
0,093
0,084
0,092
0,089
0,079
0,079
0,076
0,085
0,077
0,078
0,079
0,061
0,093
0,058
14,83
13,33
14,67
14,17
12,5
12,5
12
13,5
12,17
12,33
12,5
9,5
14,83
9
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
L5
0,08
12,67
0,079
12,5
0,076
12
L6
L7
0,098
0,087
15,67
13,83
0,095
0,086
15,17
13,67
0,087
0,09
13,83
14,33
Bảng 21. Giá trị OD và lượng IAA của vi khuẩn trên môi trường NFb khi
không bổ sung Tryptophane ở ngày 6
Dòng vi khuẩn
OD 1
IAA 1(µg/ml)
OD 2
IAA 2 (µg/ml)
OD 3
IAA 3 (µg/ml)
R1
R2
R5
R6
0,04
0,04
0,052
0,015
12,33
12,33
16,33
4
0,036
0,035
0,053
0,019
11
10,67
16,67
5,33
0,035
0,03
0,054
0,018
10,67
9
17
5
R7
R8
0,04
0,032
12,33
9,67
0,045
0,031
14
9,33
0,043
0,027
13,33
8
T1
T2
T3
T4
L1
L2
L3
L4
0,013
0,031
0,02
0,013
0,029
0,025
0,028
0,03
3,33
9,33
5,67
3,33
8,67
7,33
8,33
9
0,016
0,027
0,018
0,012
0,032
0,023
0,026
0,028
4,33
8
5
3
9,67
6,67
7,67
8,33
0,015
0,03
0,018
0,01
0,031
0,02
0,029
0,026
4
9
5
2,33
9,33
5,67
8,67
7,67
L5
L6
L7
0,022
0,04
0,041
6,33
12,33
12,67
0,024
0,039
0,037
7
12
11,33
0,024
0,039
0,04
7
12
12,33
3. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập
được trên môi trường PDA.
Bảng 22. Đường kính vòng halo, đường kính khuẩn lạc và hiệu quả hòa tan
lân ở ngày 1 sau khi ủ
Dòng
Halo ngày 1 (cm)
Khuẩn lạc ngày 1 (cm)
Hiệu quả ngày 1 (E)
R5
R5
R5
R6
R6
R6
R7
R7
R7
R8
R8
0,6
0,55
0,6
0,7
0,7
0,6
0,6
0,65
0,65
0,7
0,8
0,5
0,5
0,5
0,6
0,6
0,5
0,5
0,6
0,5
0,6
0,65
120
110
120
116,7
116,7
120
120
108,3
130
116,7
123,1
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
R8
T4
T4
T4
L1
L1
L1
L2
L2
L2
L3
L3
L3
L5
L5
L5
L6
L6
L6
L7
L7
L7
Trường ĐHCT
0,7
1
1
0,9
0,6
0,55
0,55
0,7
0,8
0,8
0,6
0,65
0,6
0,9
1
1
0,8
0,8
0,85
0,6
0,65
0,65
0,6
0,7
0,8
0,8
0,5
0,5
0,5
0,6
0,65
0,65
0,5
0,5
0,55
0,7
0,8
0,7
0,6
0,65
0,6
0,5
0,6
0,5
116,7
142,9
125
112,5
120
110
110
116,7
123,1
123,1
120
130
109,1
128,6
125
142,9
133,3
123,1
141,7
120
108,3
130
Bảng 23. Đường kính vòng halo, đường kính khuẩn lạc và hiệu quả hòa tan
lân ở ngày 3 sau khi ủ
Dòng
Halo ngày 3 (cm)
Khuẩn lạc ngày 3 (cm)
Hiệu quả ngày 3 (E)
R5
R5
R5
R6
R6
R6
R7
R7
R7
R8
R8
R8
T4
T4
T4
L1
L1
L1
L2
L2
0,7
0,8
0,7
1,3
1,4
1,3
1
1,2
1
1
1,1
1,1
1,5
1,5
1,6
0,9
0,95
1
1,2
1,3
0,6
0,6
0,65
1,2
1
1,2
0,9
0,9
0,8
0,9
0,7
1
1,2
1,1
1,3
0,7
0,8
0,85
0,95
1,1
116,7
133,3
107,7
108,3
140
108,3
111,1
133,3
125
111,1
157,1
110
125
136,4
123,1
128,6
118,8
117,6
126,3
118,2
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
L2
L3
L3
L3
L5
L5
L5
L6
L6
L6
L7
L7
L7
1,4
1,3
1,35
1,3
1,6
1,8
2
1,2
1,3
1,2
1,2
1,2
1,1
Trường ĐHCT
1,1
1
1,1
0,9
1
1,2
1,5
0,9
1,1
0,8
1
0,9
0,9
127,3
130
122,7
144,4
160
150
133,3
133,3
118,2
150
120
133,3
122,2
Bảng 24. Đường kính vòng halo, đường kính khuẩn lạc và hiệu quả hòa tan
lân ở ngày 5 sau khi ủ.
Dòng
Halo ngày 5 (cm)
Khuẩn lạc ngày 5 (cm)
Hiệu quả ngày 5 (E)
R5
R5
R5
R6
R6
R6
R7
R7
R7
R8
R8
R8
T4
T4
T4
L1
L1
L1
L2
L2
L2
L3
L3
L3
L5
L5
L5
L6
L6
1,1
1,1
1,3
1,8
1,7
1,7
1,5
1,7
1,5
1,8
1,8
1,7
1
1,2
1,4
1,2
1,3
1,2
1,3
1,4
1,2
1,7
1,6
1,6
2,5
2,1
2,1
1,5
1,65
0,9
1
0,9
1,4
1,5
1,4
1,1
1,2
1,1
1,5
1,3
1,3
0,6
0,7
0,7
0,9
1
1
1,1
1
1
1,2
1,1
1,2
1,5
0,9
0,8
1
1,3
122,2
110
144,4
128,6
113,3
121,4
136,4
141,7
136,4
120
138,5
130,8
166,7
171,4
200
133,3
130
120
118,2
140
120
141,7
145,5
133,3
166,7
233,3
262,5
150
126,9
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
L6
L7
L7
L7
1,6
1,4
1,6
1,4
Trường ĐHCT
1,1
1,1
1,1
1.1
145,5
127,3
145,5
127,3
4. Khả năng kháng E. coli của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi
trường PDA.
Bảng 25. Đường kính vòng sáng, đường kính khuẩn lạc và vòng vô khuẩn
của các dòng vi khuẩn phân lập được ở ngày 1 sau khi ủ với E. coli
Dòng
R2
R2
T2
T2
T4
T4
Vòng sáng ngày 1 (mm)
6,5
7
7
8
8
9
Khuẩn lạc ngày 1 (m)
6
6
6
6,2
6
6
Vòng vô khuẩn ngày 1 (mm)
0,5
1
1
1,8
2
3
Bảng 26. Đường kính vòng sáng, đường kính khuẩn lạc và vòng vô khuẩn
của các dòng vi khuẩn phân lập được ở ngày 2 sau khi ủ với E. coli
Dòng
R2
R2
T2
T2
T4
T4
Vòng sáng ngày 2 (mm)
7
7,5
8
8,5
9,5
9
Khuẩn lạc ngày 2 (mm)
6,5
6
6,5
6,2
6
6,2
Vòng vô khuẩn ngày 2 (mm)
0,5
1,5
1,5
2,3
3,5
2,8
Bảng 27. Đường kính vòng sáng, đường kính khuẩn lạc và vòng vô khuẩn
của các dòng vi khuẩn phân lập được ở ngày 3 sau khi ủ với E. coli
Dòng
R2
R2
T2
T2
T4
T4
Vòng sáng ngày 3 (mm)
8
7,5
8,5
8,5
9,5
9,4
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Khuẩn lạc ngày 3 (mm)
6,5
6
6,5
6,5
6
6,3
Vòng vô khuẩn ngày 3 (mm)
1,5
1,5
2
2
3,5
3,1
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
5. Khả năng kháng Aeromonas hydrophila của các dòng vi khuẩn phân lập
được trên môi trường PDA.
Bảng 27. Đường kính vòng sáng, đường kính khuẩn lạc và vòng vô khuẩn
của các dòng vi khuẩn phân lập được ở ngày 1 sau khi ủ với A. hydrophila.
Dòng
R2
R2
T2
T2
L2
L2
L3
L3
L5
L5
Vòng sáng ngày 1 (mm)
7,5
7
7,5
8
11
11
8,5
9,5
7,5
8
Khuẩn lạc ngày 1 (mm)
6
6
6
6
7
6
6,5
6,5
6
6
Vòng vô khuẩn ngày 1 (mm)
1,5
1
1,5
2
4
5
2
3
1,5
2
Bảng 28. Đường kính vòng sáng, đường kính khuẩn lạc và vòng vô khuẩn
của các dòng vi khuẩn phân lập được ở ngày 2 sau khi ủ với A. hydrophila.
Dòng
R2
R2
T2
T2
L2
L2
L3
L3
L5
L5
Vòng sáng ngày 2 (mm)
8
7
8,5
9
12
12
9,5
9,5
8
8
Khuẩn lạc ngày 2 (mm)
6,5
6
7
7
8
7
6,5
6,5
6
6,5
Vòng vô khuẩn ngày 2 (mm)
1,5
1
1,5
2
4
5
3
3
2
1,5
Bảng 29. Đường kính vòng sáng, đường kính khuẩn lạc và vòng vô khuẩn
của các dòng vi khuẩn phân lập được ở ngày 3 sau khi ủ với A. hydrophila.
Dòng
R2
R2
T2
T2
L2
L2
L3
L3
L5
L5
Vòng sáng ngày 3 (mm)
8
7,5
9
9
13
12
10
11
10
9
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Khuẩn lạc ngày 3 (mm)
6,5
6,5
7
7
8,5
7
6,5
6,5
7
7
Vòng vô khuẩn ngày 3 (mm)
1,5
1
2
2
4,5
5
3,5
4,5
3
2
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Phụ lục 2: Hình biểu đồ đường chuẩn NH4+ và IAA
1. Đường chuẩn đo đạm.
Hình 24: Đường chuẩn NH4+ ngày 0
Hình 2: Đường chuẩn NH4+ ngày 2.
Hình 25: Đường chuẩn NH4+ ngày 2
Hình 26: Đường chuẩn NH4+ ngày 4.
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Hình 27: Đường chuẩn NH4+ ngày 6
2. Đường chuẩn đo IAA.
Hình 28: Đường chuẩn IAA ngày 2
Hình 29: Đường chuẩn IAA ngày 4
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Hình 30: Đường chuẩn IAA ngày 6
Phụ lục 3: Kết quả thống kê.
1. Kết quả thống kê khảo sát lượng Ammonium của 17 dòng vi khuẩn tạo ra.
a) Kết quả khảo sát lượng Ammonium do dòng vi khuẩn nhóm tạo ra.
Ngày 0
Sucmary Statistics for ngay 0
dong
R1
R2
R5
R6
R7
R8
T1
T2
T3
T4
Total
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
30
Average
0,002
0,0236667
0,00833333
0,0516667
0,03
0,0563333
0,0343333
0,0193333
0,0516667
0,0603333
0,0337667
Median
0
0,026
0,006
0,052
0,032
0,052
0,032
0,019
0,045
0,058
0,032
Standard deviation
0,0034641
0,00971253
0,00404145
0,00650641
0,0101489
0,00750555
0,00404145
0,00650641
0,011547
0,00404145
0,0208239
ANOVA Table for ngay 0 by dong
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,01151
0,00106533
0,0125754
Df
9
20
29
Mean Square
0,00127889
0,0000532667
F-Ratio
24,01
P-Value
0,0000
CV= 21,61%
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Multiple Range Tests for dam ngay 0 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong vi khuan
R1
R5
T2
R2
R7
T1
T3
R6
R8
T4
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Mean
0,002
0,00833333
0,0193333
0,0236667
0,03
0,0343333
0,0516667
0,0516667
0,0563333
0,0603333
Homogeneous Groups
X
XX
XX
XX
XX
X
X
X
X
X
Ngày 2
Sucmary Statistics for dam ngay 2 by dong vi khuan
dong vi khuan
R1
R2
R5
R6
R7
R8
T1
T2
T3
T4
Total
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
30
Average
0,118333
0,0836667
0,0943333
0,129
0,089
0,105
0,089
0,107667
0,129
0,0863333
0,103133
Median
0,121
0,081
0,097
0,129
0,089
0,105
0,089
0,113
0,129
0,089
0,097
Standard deviation
0,0122202
0,0046188
0,0046188
0,008
0,008
0,008
0
0,0092376
0,008
0,0046188
0,0179111
ANOVA Table for dam ngay 2 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,00819413
0,00110933
0,00930347
Df
9
20
29
Mean Square
0,000910459
0,0000554667
F-Ratio
16,41
P-Value
0,0000
CV= 7,22%
Multiple Range Tests for dam ngay 2 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong vi khuan
Count
R2
3
T4
3
T1
3
R7
3
R5
3
R8
3
T2
3
R1
3
T3
3
R6
3
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Mean
0,0836667
0,0863333
0,089
0,089
0,0943333
0,105
0,107667
0,118333
0,129
0.129
Homogeneous Groups
X
X
X
X
XX
XX
XX
XX
X
X
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Ngày 4
Sucmary Statistics for dam ngay 4
dong vi khuan
R1
R2
R5
R6
R7
R8
T1
T2
T3
T4
Total
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
30
Average
0,150333
0,147667
0,155
0,215667
0,167667
0,195333
0,200667
0,182667
0,220667
0,152667
0,178833
Median
0,15
0,15
0,15
0,218
0,165
0,195
0,203
0,18
0,218
0,15
0,173
Standard deviation
0,00750555
0,00404145
0,00866025
0,00404145
0,0046188
0,00750555
0,0116762
0,0112398
0,0046188
0,0046188
0,0276606
ANOVA Table for dam ngay 4 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,0210942
0,001094
0,0221882
Df
9
20
29
Mean Square
0,0023438
0,0000547
F-Ratio
42,85
P-Value
0,0000
CV= 4,14%
Multiple Range Tests for dam ngay 4 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong
Count
R2
3
R1
3
T4
3
R5
3
R7
3
T2
3
R8
3
T1
3
R6
3
T3
3
Mean
0,147667
0,150333
0,152667
0,155
0,167667
0,182667
0,195333
0,200667
0,215667
0,220667
Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Ngày 6
Sucmary Statistics for dam ngay 6
dong vi khuan
R1
R2
R5
R6
R7
R8
T1
T2
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Average
0,125
0,031
0,043
0,119
0,061
0,0613333
0,095
0,113
Median
0,128
0,028
0,046
0,119
0,055
0,055
0,101
0,11
Standard deviation
0,00519615
0,00519615
0,00519615
0,009
0,0103923
0,0192959
0,0103923
0,00519615
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
T3
T4
Total
3
3
30
Trường ĐHCT
0.143667
0.034
0.0826
0.138
0.028
0.083
0.0191398
0.0103923
0.0410329
ANOVA Table for dam ngay 6 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,0463239
0,00250333
0,0488272
Df
9
20
29
Mean Square
0,0051471
0,000125167
F-Ratio
41,12
P-Value
0,0000
CV= 13,54%
Multiple Range Tests for dam ngay 6 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong vi khuan
Count
R2
3
T4
3
R5
3
R7
3
R8
3
T1
3
T2
3
R6
3
R1
3
T3
3
Mean
0,031
0,034
0,043
0,061
0,0613333
0,095
0,113
0,119
0,125
0,143667
Homogeneous Groups
X
X
XX
X
X
X
XX
X
XX
X
b) Kết quả khảo sát lượng Ammonium do dòng vi khuẩn nhóm 2 tạo ra.
Ngày 0
Sucmary Statistics for dam ngay 0
dong
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
Total
Count
3
3
3
3
3
3
3
21
Average
0,065
0,0303333
0,054
0,0213333
0,00866667
0,077
0,0106667
0,0381429
Median
0,065
0,026
0,052
0,019
0,013
0,077
0,013
0,026
Standard deviation
0
0,00750555
0,0101489
0,00404145
0,00750555
0
0,00404145
0,0263121
Coeff. of variation
0%
24,7436%
18,7942%
18,9443%
86,6025%
0%
37,8886%
68,9831%
ANOVA Table for dam ngay 0 by dong
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,0133499
0,000496667
0,0138466
Df
6
14
20
Mean Square
0,00222498
0,0000354762
F-Ratio
62,72
P-Value
0,0000
CV= 15,6%
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Multiple Range Tests for dam ngay 0 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong
Count
L5
3
L7
3
L4
3
L2
3
L3
3
L1
3
L6
3
Mean
0,00866667
0,0106667
0,0213333
0,0303333
0,054
0,065
0,077
Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X
X
Ngày 2
Sucmary Statistics for dam ngay 2
dong
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
Total
Count
3
3
3
3
3
3
3
21
Average
0,113
0,118333
0,121
0,113
0,121
0,134333
0,118333
0,119857
Median
0,113
0,113
0,121
0,105
0,121
0,145
0,121
0,121
Standard deviation
0,016
0,0092376
0,008
0,0138564
0,016
0,0184752
0,0122202
0,0134547
ANOVA Table for dam ngay 2 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,000932571
0,002688
0,00362057
Df
6
14
20
Mean Square
0,000155429
0,000192
F-Ratio
0,81
P-Value
0,5794
CV= 11,56%
Multiple Range Tests for dam ngay 2 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong
Count
L4
3
L1
3
L7
3
L2
3
L3
3
L5
3
L6
3
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Mean
0.113
0.113
0.118333
0.118333
0.121
0.121
0.134333
Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X
X
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Ngày 4
Sucmary Statistics for dam ngay 4
dong
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
Total
Count
3
3
3
3
3
3
3
21
Average
0,185
0,195333
0,208
0,215667
0,213333
0,221
0,208333
0,206667
Median
0,18
0,195
0,203
0,218
0,211
0,226
0,211
0,211
Standard deviation
0,00866025
0,00750555
0,0160935
0,00404145
0,00404145
0,00866025
0,0046188
0,013854
ANOVA Table for dam ngay 4 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,0028
0,00103867
0,00383867
Df
6
14
20
Mean Square
0,000466667
0,0000741905
F-Ratio
6,29
P-Value
0,0022
CV= 4,17 %
Multiple Range Tests for dam ngay 4 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong
Count
L1
3
L2
3
L3
3
L7
3
L5
3
L4
3
L6
3
Mean
0,185
0,195333
0,208
0,208333
0,213333
0,215667
0,221
Homogeneous Groups
X
XX
XX
XX
X
X
X
Ngày 6
Sucmary Statistics for dam ngay 6
dong
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
Total
Count
3
3
3
3
3
3
3
21
Average
0,0916667
0,0796667
0,0826667
0,159
0,131333
0,122
0,089
0,107905
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Median
0,101
0,083
0,092
0,156
0,128
0,128
0,083
0,101
Standard deviation
0,0161658
0,0142945
0,0161658
0,0137477
0,0231805
0,0103923
0,0103923
0,0312888
Coeff. of variation
17,6354%
17,9429%
19,5554%
8,64637%
17,6501%
8,51828%
11,6767%
28,9967%
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
ANOVA Table for dam ngay 6 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
.
CV= 14,3%
Sum of Squares
0,0162411
0,00333867
0,0195798
Df
6
14
20
Mean Square
0,00270686
0,000238476
F-Ratio
11,35
P-Value
0,0001
Multiple Range Tests for dam ngay 6 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong
Count
L2
3
L3
3
L7
3
L1
3
L6
3
L5
3
L4
3
Mean
0,0796667
0,0826667
0,089
0,0916667
0,122
0,131333
0,159
Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X
X
c) Kết quả khảo sát lượng Ammonium do dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra.
Ngày 0
Sucmary Statistics for dam ngay 0
dong vi khuan
L4
L5
L6
L7
R6
T2
T3
T4
Total
Count
3
3
6
3
3
3
6
3
30
Average
0,0213333
0,00866667
0,077
0,0106667
0,0516667
0,0193333
0,0516667
0,0603333
0,0429333
Median
0,019
0,013
0,077
0,013
0,052
0,019
0,045
0,058
0,045
Standard deviation
0,00404145
0,00750555
0
0,00404145
0,00650641
0,00650641
0,010328
0,00404145
0,0257226
ANOVA Table for dam ngay 0 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,0182745
0,000913333
0,0191879
Df
7
22
29
Mean Square
0,00261065
0,0000415152
F-Ratio
62,88
P-Value
0,0000
CV= 15%
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Multiple Range Tests for dam ngay 0 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong vi khuan
Count
L5
3
L7
3
T2
3
L4
3
T3
6
R6
3
T4
3
L6
6
Mean
0,00866667
0,0106667
0,0193333
0,0213333
0,0516667
0,0516667
0,0603333
0,077
Homogeneous Groups
X
XX
XX
X
X
X
X
X
Ngày 2
Sucmary Statistics for dam ngay 2
dong vi khuan
L4
L5
L6
L7
R6
T2
T3
T4
Total
Count
3
3
6
3
3
3
6
3
30
Average
0.113
0.121
0.134333
0.118333
0.129
0.107667
0.129
0.0863333
0.1202
Median
0,105
0,121
0,145
0,121
0,129
0,113
0,129
0,089
0,121
Standard deviation
0,0138564
0,016
0,0165247
0,0122202
0,008
0,0092376
0,00715542
0,0046188
0,0177461
ANOVA Table for dam ngay 2 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,00597547
0,00315733
0,0091328
Df
7
22
29
Mean Square
0,000853638
0,000143515
F-Ratio
5,95
P-Value
0,0006
CV= 9,97%
Multiple Range Tests for dam ngay 2 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong vi khuan
Count
T4
3
T2
3
L4
3
L7
3
L5
3
T3
6
R6
3
L6
6
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Mean
0,0863333
0,107667
0,113
0,118333
0,121
0,129
0,129
0,134333
Homogeneous Groups
X
X
XX
XXX
XXX
XX
XX
X
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Ngày 4
Sucmary Statistics for dam ngay 4
dong vi khuan
L4
L5
L6
L7
R6
T2
T3
T4
Total
Count
3
3
6
3
3
3
6
3
30
Average
0,215667
0,213333
0,221
0,208333
0,215667
0,182667
0,220667
0,152667
0,207167
Median
0,218
0,211
0,226
0,211
0,218
0,18
0,218
0,15
0,2145
Standard deviation
0,00404145
0,00404145
0,00774597
0,0046188
0,00404145
0,0112398
0,00413118
0,0046188
0,0222262
ANOVA Table for dam ngay 4 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,0135048
0,000821333
0.0143262
Df
7
22
29
Mean Square
0,00192926
0,0000373333
F-Ratio
51,68
P-Value
0,0000
CV= 2,95%
Multiple Range Tests for dam ngay 4 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong vi khuan
Count
T4
3
T2
3
L7
3
L5
3
L4
3
R6
3
T3
6
L6
6
Mean
0,152667
0,182667
0,208333
0,213333
0,215667
0,215667
0,220667
0,221
Homogeneous Groups
X
X
X
XX
XX
XX
X
X
Ngày 6
Sucmary Statistics for dam ngay 6
dong vi khuan
L4
L5
L6
L7
R6
T2
T3
T4
Total
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Count
3
3
6
3
3
3
6
3
30
Average
0,159
0,131333
0,122
0,089
0,119
0,113
0,143667
0,034
0,117667
Median
0,156
0,128
0,128
0,083
0,119
0,11
0,138
0,028
0,128
Standard deviation
0,0137477
0,0231805
0,00929516
0,0103923
0,009
0,00519615
0,0171192
0,0103923
0,0359063
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
ANOVA Table for dam ngay 6 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,0333907
0,003998
0,0373887
Df
7
22
29
Mean Square
0,0047701
0,000181727
F-Ratio
26,25
P-Value
0,0000
CV= 11,46%
Multiple Range Tests for dam ngay 6 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong vi khuan
Count
T4
3
L7
3
T2
3
R6
3
L6
6
L5
3
T3
6
L4
3
Mean
0,034
0,089
0,113
0,119
0,122
0,131333
0,143667
0,159
Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
XX
XX
X
2. Kết quả khảo sát lượng IAA do 17 dòng vi khuẩn tạo ra
a) Kết quả khảo sát lượng IAA do dòng vi khuẩn nhóm 1 tạo ra.
Ngày 2
Sucmary Statistics for IAA NGAY 2
dong vi khuan
R1
R2
R5
R6
R7
R8
T1
T2
T3
T4
Total
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
30
Average
8,41667
9,16667
12,4167
6,33333
7,08333
9,58333
9,16667
9,66667
7,5
5,83333
8,51667
Median
8,25
9,0
12,5
6,5
7,0
9,75
9,25
9,75
7,25
6,0
8,75
Standard deviation
0,288675
0,288675
0,381881
0,288675
0,144338
0,520416
0,381881
0,144338
0,433013
0,520416
1,88795
ANOVA Table for IAA NGAY 2 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
100,742
2,625
103,367
Df
9
20
29
Mean Square
11,1935
0,13125
F-Ratio
85,28
P-Value
0,0000
CV= 4,25%
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Multiple Range Tests for IAA NGAY 2 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong vi khuan
T4
R6
R7
T3
R1
T1
R2
R8
T2
R5
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Mean
5,83333
6,33333
7,08333
7,5
8,41667
9,16667
9,16667
9,58333
9,66667
12,4167
Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Ngày 4
Sucmary Statistics for IAA NGAY 4
dong vi khuan
R1
R2
R5
R6
R7
R8
T1
T2
T3
T4
Total
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
30
Average
14,4967
13,6667
14,0
13,5
12,78
12,61
12,1667
13,0533
11,7767
12,3333
13,0383
Median
14,33
13,5
13,83
13,5
12,67
12,5
12,17
12,83
11,83
12,33
12,83
Standard deviation
0,288675
0,44411
0,603241
0,67
0,348281
0,190526
0,165025
0,386825
0,422532
0,335012
0,904258
ANOVA Table for IAA NGAY 4 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
20,2756
3,4372
23,7128
Df
9
20
29
Mean Square
2,25285
0,17186
F-Ratio
13,11
P-Value
0,0000
CV= 3,18%
Multiple Range Tests for IAA NGAY 4 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong vi khuan
T3
T1
T4
R8
R7
T2
R6
R2
R5
R1
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Mean
11,7767
12,1667
12,3333
12,61
12,78
13,0533
13,5
13,6667
14,0
14,4967
Homogeneous Groups
X
XX
XX
XX
XX
XX
XX
XX
XX
X
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Ngày 6
Sucmary Statistics for IAA NGAY 6
dong vi khuan
R1
R2
R5
R6
R7
R8
T1
T2
T3
T4
Total
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
30
Average
11,3333
10,6667
16,6667
4,77667
13,22
9,0
3,88667
8,77667
5,22333
2,88667
8,64367
Median
11,0
10,67
16,67
5,0
13,33
9,33
4,0
9,0
5,0
3,0
9,0
Standard deviation
0,878768
1,665
0,335012
0,692556
0,840417
0,882553
0,509542
0,692556
0,386825
0,509542
4,35954
ANOVA Table for IAA NGAY 6 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
537,622
13,5401
551,162
Df
9
20
29
Mean Square
59,7358
0,677007
F-Ratio
88,24
P-Value
0,0000
CV= 9,52%
b) Kết quả khảo sát lượng IAA do dòng vi khuẩn nhóm 2 tạo ra.
Ngày 2
Sucmary Statistics for IAA NGAY 2
dong vi khuan
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
Total
Count
3
3
3
3
3
3
3
21
Average
5,75
7,16667
6,66667
5,08333
7,41667
3,91667
6,33333
6,04762
Median
6,0
7,0
6,75
5,25
7,75
4,0
6,5
6,25
Standard deviation
0,661438
0,520416
0,629153
0,520416
0,57735
0,144338
0,288675
1,24654
ANOVA Table for IAA NGAY 2 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
27,4524
3,625
31,0774
Df
6
14
20
Mean Square
4,5754
0,258929
F-Ratio
17,67
P-Value
0,0000
CV = 8,41%
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Multiple Range Tests for IAA NGAY 2 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong vi khuan
L6
L4
L1
L7
L3
L2
L5
Count
3
3
3
3
3
3
3
Mean
3,91667
5,08333
5,75
6,33333
6,66667
7,16667
7,41667
Homogeneous Groups
X
X
XX
XX
XX
XX
X
Ngày 4
Sucmary Statistics for IAA NGAY 4
dong vi khuan
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
Total
Count
3
3
3
3
3
3
3
21
Average
12,78
9,66667
13,8333
9,22333
12,39
14,89
13,9433
12,3895
Median
12,67
9,5
13,5
9,17
12,5
15,17
13,83
12,67
Standard deviation
0,348281
0,288675
0,878768
0,254231
0,348281
0,95142
0,344287
2,11424
ANOVA Table for IAA NGAY 4 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
85,0274
4,37307
89,4005
Df
6
14
20
Mean Square
14,1712
0,312362
F-Ratio
45,37
P-Value
0,0000
CV= 4,51%
Multiple Range Tests for IAA NGAY 4 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong vi khuan
L4
L2
L5
L1
L3
L7
L6
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Count
3
3
3
3
3
3
3
Mean
9,22333
9,66667
12,39
12,78
13,8333
13,9433
14,89
Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
XX
X
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Ngày 6
Sucmary Statistics for IAA NGAY 6
dong vi khuan
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
Total
Count
3
3
3
3
3
3
3
21
Average
9,22333
6,55667
8,22333
8,33333
6,77667
12,11
12,11
9,04762
Median
9,33
6,67
8,33
8,33
7,0
12,0
12,33
8,67
Standard deviation
0,508462
0,835783
0,508462
0,665006
0,386825
0,190526
0,696563
2,2212
ANOVA Table for IAA NGAY 6 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
94.0168
4.65793
98.6748
Df
6
14
20
Mean Square
15.6695
0.33271
F-Ratio
47.10
P-Value
0.0000
CV= 6,38%
Multiple Range Tests for IAA NGAY 6 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong vi khuan
L2
L5
L3
L4
L1
L7
L6
Count
3
3
3
3
3
3
3
Mean
6,55667
6,77667
8,22333
8,33333
9,22333
12,11
12,11
Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X
X
b) Kết quả khảo sát lượng IAA do dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra.
Ngày 2
Summary Statistics for IAA ngay 2
dòng vi khuan
L3
L6
L7
R1
R5
Total
Count
3
3
3
3
3
15
Average
6,66667
3,91667
6,33333
8,41667
12,4167
7,55
Median
6,75
4,0
6,5
8,25
12,5
6,75
Standard deviation
0,629153
0,144338
0,288675
0,288675
0,381881
2,9417
ANOVA Table for IAA ngay 2 by dòng vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
119,692
1,45833
121,15
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Df
4
10
14
Mean Square
29,9229
0,145833
F-Ratio
205,19
P-Value
0,0000
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
CV= 5,06%
Multiple Range Tests for IAA ngay 2 by dòng vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dòng vi khuan
L6
L7
L3
R1
R5
Count
3
3
3
3
3
Mean
3,91667
6,33333
6,66667
8,41667
12,4167
Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
Ngày 4
Summary Statistics for IAA ngay 4
dòng vi khuan
L3
L6
L7
R1
R5
Total
Count
3
3
3
3
3
15
Average
13,8333
14,89
13,9433
14,4967
14,0
14,2327
Median
13,5
15,17
13,83
14,33
13,83
14,33
Standard deviation
0,878768
0,95142
0,344287
0,288675
0,603241
0,701208
ANOVA Table for IAA ngay 4 by dòng vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
2.39729
4.4864
6.88369
Df
4
10
14
Mean Square
0,599323
0,44864
F-Ratio
1,34
P-Value
0,3224
CV= 4,71%
Multiple Range Tests for IAA NGAY 4 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dòng vi khuan
L3
L7
R5
R1
L6
Count
3
3
3
3
3
Mean
13,8333
13,9433
14,0
14,4967
14,89
Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
Ngày 6
Summary Statistics for IAA ngay 6
dòng vi khuan
L3
L6
L7
R1
R5
Total
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Count
3
3
3
3
3
15
Average
8,22333
12,11
12,11
11,3333
16,6667
12,0887
Median
8,33
12,0
12,33
11,0
16,67
12,0
Standard deviation
0,508462
0,190526
0,696563
0,878768
0,335012
2,83776
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
ANOVA Table for IAA ngay 6 by dòng vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
109,411
3,329
112,74
Df
4
10
14
Mean Square
27,3527
0,3329
F-Ratio
82,17
P-Value
0,0000
CV= 4,77%
Multiple Range Tests for IAA NGAY 6 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dòng vi khuan
L3
R1
L7
L6
R5
Count
3
3
3
3
3
Mean
8,22333
11,3333
12,11
12,11
16,6667
Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
3. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân.
Ngày 1
Sucmary Statistics for ngay 1
dong vi khuan
L1
L2
L3
L5
L6
L7
R5
R6
R7
R8
T4
Total
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
33
Average
113,333
120,967
119,7
132,167
132,7
119,433
116,667
117,8
119,433
118,833
126,8
121,621
Median
110,0
123,1
120,0
128,6
133,3
120,0
120,0
116,7
120,0
116,7
125,0
120,0
Standard deviation
5,7735
3,69504
10,4532
9,46802
9,3145
10,8611
5,7735
1,90526
10,8611
3,69504
15,2797
9,47951
ANOVA Table for ngay 1 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
1170.21
1705.35
2875.56
Df
10
22
32
Mean Square
117,021
77,5158
F-Ratio
1,51
P-Value
0,2015
CV = 7,24%
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Multiple Range Tests for ngay 1 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong vi khuan
L1
R5
R6
R8
L7
R7
L3
L2
T4
L5
L6
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Mean
113,333
116,667
117,8
118,833
119,433
119,433
119,7
120,967
126,8
132,167
132,7
Homogeneous Groups
X
X
XX
XX
XX
XX
XX
XX
XX
X
X
Ngày 3
Sucmary Statistics for ngay 3
dong vi khuan
L1
L2
L3
L5
L6
L7
R5
R6
R7
R8
T4
Total
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
33
Average
121,667
123,933
132,367
147,767
133,833
125,167
119,233
118,867
123,133
126,067
128,167
127,291
Median
118,8
126,3
130,0
150,0
133,3
122,2
116,7
108,3
125,0
111,1
125,0
125,0
Standard deviation
6,03435
4,99032
11,0419
13,4894
15,9067
7,12905
12,9867
18,302
11,2171
26,8813
7,19328
13,9393
ANOVA Table for ngay 3 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
2072,05
4145,67
6217,73
Df
10
22
32
Mean Square
207,205
188,44
F-Ratio
1,10
P-Value
0,4043
CV = 10,78%
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Multiple Range Tests for ngay 3 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong vi khuan
R6
R5
L1
R7
L2
L7
R8
T4
L3
L6
L5
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Mean
118.867
119.233
121.667
123.133
123.933
125.167
126.067
128.167
132.367
133.833
147.767
Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
XX
XX
XX
XX
XX
X
Ngày 5
Sucmary Statistics for ngay 5
dong vi khuan
L1
L2
L3
L5
L6
L7
R5
R6
R7
R8
T4
Total
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
33
Average
127,767
126,067
140,167
220,833
140,8
133,367
125,533
121,1
138,167
129,767
179,367
143,903
Median
130,0
120,0
141,7
233,3
145,5
127,3
122,2
121,4
136,4
130,8
171,4
136,4
Standard deviation
6,92556
12,1001
6,24286
49,1017
12,2462
10,5078
17,4406
7,65441
3,05996
9,29319
18,0229
32,7461
ANOVA Table for ngay 5 by dong vi khuan
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
26937,7
7376,04
34313,7
Df
10
22
32
Mean Square
2693,77
335,275
F-Ratio
8,03
P-Value
0,0000
CV= 12,7%
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Multiple Range Tests for ngay 5 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong vi khuan
R6
R5
L2
L1
R8
L7
R7
L3
L6
T4
L5
Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Mean
121,1
125,533
126,067
127,767
129,767
133,367
138,167
140,167
140,8
179,367
220,833
Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
4. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh của một số
dòng vi khuẩn phân lập được.
a) Khả năng kháng E. coli
Ngày 1
Sucmary Statistics for ngay 1
dong
R2
T2
T4
Total
Count
2
2
2
6
Average
0,075
0,14
0,25
0,155
Median
0,075
0,14
0,25
0,14
Standard deviation
0,0353553
0,0565685
0,0707107
0,0902774
Mean Square
0,01565
0,00315
F-Ratio
4,97
ANOVA Table for ngay 1 by dong
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,0313
0,00945
0,04075
Df
2
3
5
P-Value
0,1117
CV= 36,2%
Multiple Range Tests for ngay 1 by dong
Method: 95.0 percent LSD
dong
Count
R2
2
T2
2
T4
2
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Mean
0,075
0,14
0,25
Homogeneous Groups
X
X
X
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Ngày 2
Sucmary Statistics for ngay 2
dong
R2
T2
T4
Total
Count
2
2
2
6
Average
0,1
0,19
0,315
0,201667
Median
0,1
0,19
0,315
0,19
Standard deviation
0,0707107
0,0565685
0,0494975
0,107036
ANOVA Table for ngay 2 by dong
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,0466333
0,01065
0,0572833
Df
2
3
5
Mean Square
0,0233167
0,00355
F-Ratio
6,57
P-Value
0,0802
CV= 29,54%
Multiple Range Tests for ngay 2 by dong
Method: 95.0 percent LSD
dong
Count
R2
2
T2
2
T4
2
Mean
0,1
0,19
0,315
Homogeneous Groups
X
XX
X
Ngày 3
Sucmary Statistics for ngay 3
dong
R2
T2
T4
Total
Count
2
2
2
6
Average
0,15
0,2
0,33
0,226667
Median
0,15
0,2
0,33
0,2
Standard deviation
0
0
0,0282843
0,0840635
ANOVA Table for ngay 3 by dong
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,0345333
0,0008
0,0353333
Df
2
3
5
Mean Square
0,0172667
0,000266667
F-Ratio
64,75
P-Value
0,0034
CV= 7, 2%
Multiple Range Tests for ngay 3 by dong
Method: 95.0 percent LSD
dong
Count
R2
2
T2
2
T4
2
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Mean
0,15
0,2
0,33
Homogeneous Groups
X
X
X
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
b) Khả năng kháng Aeromonas hydrophila của các dòng vi khuẩn phân lập được.
Ngày 1
Sucmary Statistics for ngay 1
dong
L2
L3
L5
R2
T2
Total
Count
2
2
2
2
2
10
Average
0,45
0,25
0,175
0,125
0,175
0,235
Median
0,45
0,25
0,175
0,125
0,175
0,2
Standard deviation
0,0707107
0,0707107
0,0353553
0,0353553
0,0353553
0,127039
ANOVA Table for ngay 1 by dong
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,1315
0,01375
0,14525
Df
4
5
9
Mean Square
0,032875
0,00275
F-Ratio
11,95
P-Value
0,0090
CV= 22,3%
Multiple Range Tests for ngay 1 by dong
Method: 95.0 percent LSD
dong
Count
R2
2
L5
2
T2
2
L3
2
L2
2
Mean
0,125
0,175
0,175
0,25
0,45
Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
Ngày 2
Sucmary Statistics for ngay 2
dong
L2
L3
L5
R2
T2
Total
Count
2
2
2
2
2
10
Average
0,45
0,3
0,175
0,125
0,175
0,245
Median
0,45
0,3
0,175
0,125
0,175
0,2
Standard deviation
0,0707107
0
0,0353553
0,0353553
0,0353553
0,127911
ANOVA Table for ngay 2 by dong
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,1385
0,00875
0,14725
Df
4
5
9
Mean Square
0,034625
0,00175
F-Ratio
19,79
P-Value
0,0029
CV = 17,07%
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013
Trường ĐHCT
Multiple Range Tests for ngay 2 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong
Count
R2
2
L5
2
T2
2
L3
2
L2
2
Mean
0,125
0,175
0,175
0,3
0,45
Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
Ngày 3
Sucmary Statistics for ngay 3
dong
L2
L3
L5
R2
T2
Total
Count
2
2
2
2
2
10
Average
0,475
0,4
0,25
0,125
0,2
0,29
Median
0,475
0,4
0,25
0,125
0,2
0,25
Standard deviation
0,0353553
0,0707107
0,0707107
0,0353553
0
0,141028
ANOVA Table for ngay 3 by dong
Source
Between groups
Within groups
Total (Corr.)
Sum of Squares
0,1665
0,0125
0,179
Df
4
5
9
Mean Square
0,041625
0,0025
F-Ratio
16,65
P-Value
0,0043
CV = 17,24%
Multiple Range Tests for ngay 3 by dong vi khuan
Method: 95.0 percent LSD
dong
Count
R2
2
T2
2
L5
2
L3
2
L2
2
Chuyên ngành Vi sinh vật học
Mean
0,125
0,2
0,25
0,4
0,475
Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
Viện NC &PT Công nghệ Sinh học
[...]... kháng thuốc Vì vậy, đề tài: Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui (Tridax procumbens) ở Cần Thơ nhằm nghiên cứu các tác động có ích và khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội trong cây dược liệu nói chung và cây cúc mui nói riêng ở thành phố Cần Thơ 1.2 Mục tiêu của đề tài Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui (Tridax procumbens) có khả năng cố định... năng kháng khuẩn Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Vi n NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Thành phố Cần Thơ 2.1.1 Sơ lược về thành phố Cần Thơ Cần Thơ là một thành phố trực thuộc trung ương, nằm bên hữu ngạn của sông Hậu, thuộc vùng đồng bằng sông Cửu Long Đây là một trong 5 thành phố trực thuộc trung ương của Vi t Nam Ngày... (chi): Tridax Loài: Tridax procumbens (L.) Tên khác: Cúc mui, Sài lan, Sài lông, Thu thảo Hình 2: Cây cúc mui (Tridax procumbens) (*Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Tridax _procumbens, ngày 01/08/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Vi n NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.2.2 Mô tả cây cúc mui (Amita et al., 2012) Cây cúc mui là cây thân thảo sống lâu... sắc nước uống (http://danhydatviet.vn /vi/ news/Duoc-lieu/Cucmui-5441/, ngày 24/11/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 9 Vi n NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.3 Giới thiệu về vi khuẩn nội sinh 2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh Endophytes, theo định nghĩa là các vi sinh vật (VSV) (chủ yếu là nấm và vi khuẩn) sống trong mô của cây còn tươi cả đời hoặc một... trú ở trong nội mô của thực vật ký chủ và giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh Hầu hết các dạng nội sinh này bắt đầu xuất hiện từ vùng rễ hay bề mặt lá, tuy nhiên, một số loại có thể ký sinh trên hạt Vi khuẩn nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng vai trò là một tác nhân điều hòa sinh học Vi khuẩn nội sinh. .. 2004; Berg et al., 2005) Vi khuẩn nội sinh có Chuyên ngành Vi sinh vật học 10 Vi n NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT thể được xem như là vi khuẩn tập trung trong mô thực vật mà có những dấu hiệu nhiễm bệnh hay hậu quả tiêu cực đối với cây chủ (Schulz và Boyle, 2005) Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trong cây trồng (Quispel, 1992)... Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh Trong đất, vi khuẩn thường tập trung xung quanh rễ cây Rễ cây tác động đến sự phát triển của vi khuẩn, ngược lại vi khuẩn vùng rễ cũng tác động đến hoạt động thực vật Kết quả phân tích cho thấy dịch rễ cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn đất, kích thích sự gia tăng của một số vi khuẩn vùng rễ, dịch rễ có tỉ lệ C/N cao, làm tăng dồi dào vi khuẩn cố định đạm vùng... cho các cây chủ (Sturz et al., 2000; Wellington và Marcela, 2004) Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào các hoạt động sinh học của nấm nội sinh và vi khuẩn nội sinh (Strobel, 2003) Bởi vì sống trong một môi trường tương đối ổn định - trong mô thực vật, endophytes có thể sản xuất được nhiều hoạt tính sinh học hơn các vi khuẩn vùng rễ hoặc bất kỳ vi khuẩn khác mà được phân lập từ... Hoa cây cúc mui ở Hyderabad, Ấn Độ (*Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Tridax _procumbens, ngày 01/08/2013) Bộ phận dùng: Toàn cây - Herba Tridacis Procumbentis 2.2.3 Vùng phân bố, thu hái và nhân giống cây cúc mui Cây gốc ở Trung Mỹ được truyền vào nước ta, nay mọc hoang ở bờ đường, bãi cỏ, đất hoang, đồi núi Để làm thuốc, thu hái toàn cây quanh năm, dùng tươi hay phơi khô (http://danhydatviet.vn /vi/ news/Duoc-lieu/Cuc -mui- 5441/,... dài rễ ở Panicum miliaceum (Harari et al., 1988) Vi khuẩn nốt rễ sống trong rễ lúa giúp cây hấp thu nhiều nitơ, lân, kali và sắt tăng từ 10 - 64% (Biswas et al., 2000) Chaintreuil et al (2000) đã phát hiện những vi khuẩn nốt rễ còn sống trong rễ lúa hoang (Oryza breviligulata) ở vùng Châu Phi và chúng có nguồn gốc từ những cây điên điển (Sesbania sp.) mọc chen lẫn với cây lúa hoang Như vậy vi khuẩn