phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui (tridax procumbens l.) mọc hoang ở thành phố cần thơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------- LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY CÚC MUI (TRIDAX PROCUMBENS L.) MỌC HOANG Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS - TS. NGUYỄN HỮU HIỆP TÔ HOÀNG DIỄM MSSV: 3108481 LỚP: VSVH-K36 Cần Thơ, Tháng 12/ 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------- LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY CÚC MUI (TRIDAX PROCUMBENS L.) MỌC HOANG Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ Cần Thơ, Tháng 12/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (ký tên) SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) PGs-Ts. Nguyễn Hữu Hiệp Tô Hoàng Diễm DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp tại trường Đại học Cần Thơ, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và động viên từ gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận tình của quý Thầy, Cô cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn. Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Quý Thầy Cô tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn. PGs.Ts. Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ người Thầy đã nhiệt tâm hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, xây dựng đề cương nghiên cứu, thực hiện thí nghiệm và hoàn thành luận văn này. Cán bộ quản lý tại phòng thí nghiệm vi sinh vật đã giúp đỡ, động viên và chia sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến cha, mẹ đã luôn ủng hộ tôi về mọi phương diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên trong cuộc sống. Xin kính chúc quý Thầy, Cô và các bạn sinh viên luôn dồi dào sức khỏe và luôn thành công. Cần Thơ, ngày 17 tháng 11 năm 2013 Tô Hoàng Diễm Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Mười bảy dòng vi khuẩn nội sinh đã được phân lập từ rễ, thân và lá của cây cúc mui (Tridax procumbens) trong môi trường PDA. Phần lớn vi khuẩn đều có khuẩn lạc dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, màu trắng đục, dạng hình que, Gram âm và có khả năng chuyển động. Kết quả khảo sát khả năng cố định N và tổng hợp IAA của vi khuẩn cho thấy, lượng ammonium và IAA này tăng cao nhất vào ngày thứ tư và giảm dần sau sáu ngày chủng. Dòng R6, T3, L4, L5, L6 có khả năng tổng hợp lượng NH4+ cao nhất so với các dòng còn lại (0,213 µg/ml - 0,221 µg/ml). Tuy nhiên các dòng vi khuẩn này tổng hợp lượng ammonium khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở ngày thứ tư sau khi chủng và lượng IAA cao nhất (16,67 µg/ml) do dòng R5 tổng hợp trong điều kiện không có tryptophane vào ngày thứ 6 sau khi chủng. Bên cạnh đó, dòng L5 có khả năng hòa tan lân cao nhất so với các dòng còn lại, đồng thời cũng có khả năng kháng khuẩn. Hai dòng R2 và T2 có khả năng kháng lại hai vi khuẩn E. coli và Aeromonas hydrophila gây bệnh. Kết quả giải trình tự gene 16S-rDNA và so sánh với dữ liệu của ngân hàng gene NCBI, dòng L5 được nhận diện là KC182058.1 Bacillus subtilis dòng M1, dòng R2 là KC443084.1 Bacillus subtilis dòng BAB - 244 và dòng T2 là KC465726.1 Bacillus subtilis dòng 14 với tỉ lệ đồng hình lần lượt là 99%, 99% và 95%. Từ khóa: Ammonium, hòa tan lân, IAA, khả năng kháng khuẩn, phân lập, vi khuẩn nội sinh. Chuyên ngành Vi sinh vật học i Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT TÓM LƯỢC ....................................................................................................................i MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii DANH SÁCH BẢNG .....................................................................................................v DANH SÁCH HÌNH .....................................................................................................vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................... viii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .......................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................1 1.2 Mục tiêu của đề tài ..................................................................................................2 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .....................................................................3 2.1 Thành phố Cần Thơ ............................................................................................... 3 2.1.1 Sơ lược về thành phố Cần Thơ ...........................................................................3 2.1.2 Vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên của thành phố Cần Thơ.................................3 2.2 Sơ lược cây cúc mui (Tridax procumbens) ............................................................. 5 2.2.1 Phân loại thực vật ............................................................................................... 5 2.2.2 Mô tả cây cúc mui ............................................................................................... 6 2.2.3 Vùng phân bố, thu hái và nhân giống cây cúc mui .............................................6 2.2.4 Đặc tính sinh học ................................................................................................ 7 2.2.5 Thành phần hoá học ............................................................................................ 7 2.2.6 Dược tính ............................................................................................................9 2.2.7 Công dụng, chỉ định và phối hợp ........................................................................9 2.3 Giới thiệu về vi khuẩn nội sinh .............................................................................10 2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh ............................................................................10 2.3.2 Các nhóm vi khuẩn nội sinh tiêu biểu .............................................................. 13 2.3.3 Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh ..................20 2.3.4 Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh lên hình thái và chức năng bộ rễ cây ..........23 2.3.5 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh ............................................................. 23 Chuyên ngành Vi sinh vật học ii Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật cố định đạm trên thế giới và trong nước ............................................................................................................................... 30 2.4.1 Trên thế giới ......................................................................................................30 2.4.2 Trong nước ........................................................................................................32 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................34 3.1 Phương tiện nghiên cứu ........................................................................................ 34 3.1.1 Thời gian nghiên cứu ........................................................................................ 34 3.1.2 Địa điểm thực hiện ............................................................................................ 34 3.1.3 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................... 34 3.1.4 Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................ 34 3.1.5 Hóa chất ............................................................................................................35 3.2 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 35 3.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui ..................................................35 3.2.2 Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn. ..................................................................37 3.2.3 Khảo sát khả năng cố định đạm của một số dòng vi khuẩn đã phân lập. .........39 3.2.4 Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn đã phân lập. ....41 3.2.5 Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn đã phân lập được. ....................................................................................................................................42 3.2.6 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn ............................. 43 3.2.7 Nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh tiêu biểu .........................................44 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn ...................................................................................48 4.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc........................................................................................... 49 4.1.2 Đặc điểm tế bào vi khuẩn .................................................................................52 4.2 Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập dựa trên lượng NH4+ (ammonium) tổng hợp được. .................................................54 4.2.1 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân lập ở rễ và thân cây cúc mui (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4) .......................................................... 54 4.2.2 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân lập từ lá của cây cúc mui (L1 - L7) .......................................................................................... 56 Chuyên ngành Vi sinh vật học iii Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.2.3 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn triển vọng ở cả nhóm 1 và nhóm 2 được phân lập ở rễ, thân và lá của cây cúc mui ............................................58 4.3. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân ở các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA. .................................................................................................60 4.4. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) ở các dòng vi khuẩn được nuôi trong môi trường Nfb lỏng không bổ sung Tryptophan ............61 4.4.1 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân lập ở rễ và thân cây cúc mui (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4) ..................................................................62 4.4.2 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân lập từ lá của cây cúc mui (L1- L7) ........................................................................................................64 4.4.3 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng ở cả nhóm 1 và nhóm 2 được phân lập ở rễ, thân và lá của cây cúc mui ......................................................... 65 4.5 Kết quả khả năng tạo kháng khuẩn ở các dòng vi khuẩn .................................66 4.5.1 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh ở đường ruột (E. coli).............66 4.5.2 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh cá (Aeromonas hydrophila)....67 4.6 Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR.......................... 69 4.6.1 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng R2 ................................................70 4.6.2 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng T2 ................................................71 4.6.3 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng L5 ................................................73 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................76 5.1 Kết luận ..................................................................................................................76 5.2 Kiến nghị ................................................................................................................76 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 77 PHỤ LỤC .....................................................................................................................95 Chuyên ngành Vi sinh vật học iv Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Thành phần môi trường PDA ..........................................................................37 Bảng 2. Thành phần môi trường Nfb ............................................................................37 Bảng 3. Công thức môi trường NBRIP lỏng.................................................................42 Bảng 4. Thành phần môi trường LB agar .....................................................................44 Bảng 5. Thành phần các chất trong phản ứng PCR ...................................................... 46 Bảng 6. Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen của vi khuẩn nội sinh ................46 Bảng 7. Vị trí và địa điểm thu mẫu của các dòng vi khuẩn được phân lập từ cây cúc mui trên môi trường PDA .............................................................................................. 49 Bảng 8. Đặc tính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA ............................................................................................................................... 52 Bảng 9. Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA .......................................................................................................................................53 Bảng 10. Lượng ammonium trung bình do các dòng vi khuẩn nhóm 1 (R1, R2, R5 R8 và T1-T4) tổng hợp được theo thời gian (µg/ml) ...................................................56 Bảng 11. Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường NBRIP đặc .....................................................................................................................61 Bảng 12. Lượng IAA trung bình do các dòng vi khuẩn nhóm 1 (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4) tổng hợp được theo thời gian(µg/ml) ................................................................ 63 Bảng 13. Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn E.coli .............................................................................................................................. 67 Bảng 14. Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Aeromonas hydrophila ..................................................................................................68 Chuyên ngành Vi sinh vật học v Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Bản đồ hành chính thành phố Cần Thơ ............................................................. 4 Hình 2: Cây cúc mui (Tridax procumbens) ....................................................................5 Hình 3: Hoa cây cúc mui ở Hyderabad, Ấn Độ .............................................................. 6 Hình 4: Các cấu trúc của các hợp chất (1- 6) .................................................................8 Hình 5: Vi khuẩn Escherichia coli ...............................................................................29 Hình 6: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila.....................................................................30 Hình 7: Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ NH4+ ....................................................... 41 Hình 8: Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ IAA ........................................................ 43 Hình 9: Gel trước khi chụp hình DNA .........................................................................47 Hình 10: Môi trường NFb bán đặc (a) và vòng pellicle xuất hiện sau khi chủng vi khuẩn (b) ........................................................................................................................ 48 Hình 11: Một số khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA Agar….. .......................................................................................................................................51 Hình 12: Vi khuẩn Gram âm (dòng T4) và vi khuẩn Gram dương (dòng L5) được chụp dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 100X. ............................................................... 53 Hình 13: Lượng NH4+ (µg/ml) do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (L1- L7) tạo ra ............57 Hình 14: Lượng NH4+ (µg/ml) do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra ....................... 59 Hình 15: Vòng halo do vi khuẩn tạo ra khi chủng vào trong môi trường NBRIP. ......60 Hình 16: Lượng IAA do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (L1 - L7) tạo ra được phân lập từ lá của cây cúc mui .........................................................................................................64 Hình 17: Lượng IAA do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra được phân lập từ rễ, thân và lá của cây cúc mui .....................................................................................................66 Hình 18: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn T4 với vi khuẩn E. coli theo thời gian ................................................................................................................................ 67 Hình 19: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn L2 và L3 với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh ở cá .............................................................................................. 68 Hình 20: Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S rDNA ................................ 70 Chuyên ngành Vi sinh vật học vi Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hình 21: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng R2 ........................................71 Hình 22: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng T2.........................................72 Hình 23: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng L5.........................................74 Chuyên ngành Vi sinh vật học vii Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 16S-rRNA 16S ribosomal RNA ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long Đ.K Đường kính DNA Deoxyribonucleic Acid EDTA Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid IAA Indol -3- acetic acid PCR Polymerase Chain Reaction PGPR Plant Growth Promoting Rhizobacteria VKNS Vi khuẩn nội sinh VSV Vi sinh vật Chuyên ngành Vi sinh vật học viii Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Thiên nhiên là một nguồn nguyên liệu của các loại dược phẩm khoảng hàng ngàn năm nay và một con số ấn tượng của các loại thuốc ngày nay đã được điều chế từ tài nguyên thiên nhiên. Một số loài thực vật và các giá trị cần thiết của chúng đã được nghiên cứu và công bố, nhưng cho đến nay nhiều loài trong số chúng vẫn còn chưa được khám phá. Vì vậy, điều cần thiết để khám phá công dụng của chúng và để tiến hành nghiên cứu ngành dược liệu học và y học để khám phá ra các loại thuốc chữa bệnh. Cây cúc mui (Tridax procumbens L.) là một thảo dược quý được tìm thấy ở khắp Ấn Độ nhưng tiếc là nó là một trong những cây dược liệu bị bỏ quên. Cây cúc mui là một loại thảo dược thường được sử dụng trong y học dân tộc, thuộc họ Cúc. Nó có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Mỹ, nhưng nó đã được lan rộng ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và giữa các vùng ôn đới trên toàn thế giới. Cây cúc mui là một loại cây thân cỏ, mọc lan bò (procumbens) và dược tính của nó rất có giá trị. Từ thuở xa xưa con người đã biết sử dụng các cây cỏ để làm thuốc phòng chữa bệnh và bảo vệ sức khỏe. Cùng với sự tồn tại và phát triển của lịch sử loài người, những kinh nghiệm nghiên cứu, sử dụng dược liệu để làm thuốc phòng chữa bệnh cũng ngày một phát triển. Trong sự nghiệp chăm sóc sức khỏe hiện nay, cây thuốcdược liệu càng được quan tâm và phát triển mạnh mẽ hơn. Theo số liệu thông kê gần đây ở nước ta có hơn 3.800 loài cây làm thuốc trên tổng số hơn 10.600 loài thực vật. Hàng năm cả nước sử dụng khoảng 50.000 tấn dược liệu (http://duoclieu.net/caythuo cvn2.html, ngày 20/8/2113). Với số lượng lớn như vậy có rất nhiều cây thuốc, vị thuốc còn xa lạ với người dùng, hoặc nghe nhắc đến nhiều nhưng chưa hiểu đầy đủ về chúng. Ngày nay, dân số thế giới đang gia tăng với tốc độ đáng báo động, và một loạt các vấn đề mới về sức khỏe tăng lên. Ví dụ, số lượng các vi khuẩn kháng thuốc tăng lên là một nguyên nhân khá được quan tâm. Sự nghiên cứu về thuốc kháng sinh và các sản phẩm tự nhiên khác từ vi sinh vật là quan trọng trong cuộc chiến toàn cầu chống lại vấn đề ngày càng tăng của việc kháng kháng sinh. Vì vậy, để đối phó với số lượng ngày càng tăng của mầm bệnh kháng thuốc, vi khuẩn nội sinh (VKNS) có thể phục vụ như là một nguồn tiềm năng của thuốc kháng sinh mới. Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hiện nay, việc nghiên cứu và ứng dụng các dòng VKNS thực vật đã và đang là những đề tài được nghiên cứu rộng rãi trên khắp thế giới. Tập đoàn vi sinh vật nội sinh hoặc sống ở vùng rễ cây trong đó có cây dược liệu có khả năng giúp cây tăng trưởng và đồng hóa tốt. Ngoài ra chúng còn có khả năng sản xuất trực tiếp các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên (Strobel, 2003) nhưng chúng cũng có khả năng kích thích cây chủ sản xuất ra các hợp chất biến dưỡng trung gian như ở cây dược liệu chúng có thể sản xuất ra các hợp chất có tính kháng khuẩn rất tốt (Hardoim et al., 2008). Nhiều nghiên cứu từ các cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Sài đất (Wedelia calendulacea, Less), cây Diếp cá (Houttuynia cordata, Thunb), cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria, Less)… đã được nghiên cứu chứng tỏ chúng có hoạt tính kháng khuẩn nhờ chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyde và các dẫn xuất ceton như methyl nnonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất α-pinen, camphen,… có tác dụng trên các vi khuẩn Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, Shigella, Salmonella, E. coli (Đỗ Tất Lợi, 2006;) vì nguyên liệu làm thuốc từ các cây cỏ rất ít độc, rẻ tiền, dễ kiếm mà hiệu quả cao, sử dụng đơn giản, thân thiện với môi trường và giúp hạn chế điều kiện kháng thuốc. Vì vậy, đề tài: “Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui (Tridax procumbens) ở Cần Thơ” nhằm nghiên cứu các tác động có ích và khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội trong cây dược liệu nói chung và cây cúc mui nói riêng ở thành phố Cần Thơ. 1.2 Mục tiêu của đề tài Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui (Tridax procumbens) có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân và có khả năng kháng khuẩn. Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Thành phố Cần Thơ 2.1.1 Sơ lược về thành phố Cần Thơ Cần Thơ là một thành phố trực thuộc trung ương, nằm bên hữu ngạn của sông Hậu, thuộc vùng đồng bằng sông Cửu Long. Đây là một trong 5 thành phố trực thuộc trung ương của Việt Nam. Ngày 24 tháng 6 năm 2009, thành phố Cần Thơ chính thức được Thủ tướng Chính phủ ra quyết định công nhận là đô thị loại 1 của Việt Nam thuộc vùng kinh tế trọng điểm của vùng đồng bằng sông Cửu Long và là vùng kinh tế trọng điểm thứ tư của Việt Nam (http://cantho.gov.vn, ngày 23/11/2013). 2.1.2 Vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên của thành phố Cần Thơ  Về vị trí địa lý: Thành phố Cần Thơ nằm ở vùng hạ lưu của Sông Mê Kông và ở vị trí trung tâm đồng bằng châu thổ Sông Cửu Long, nằm cách thành phố Hồ Chí Minh 169 km, cách thành phố Cà Mau 178 km, cách thành phố Rạch Giá 128 km, cách biển khoảng 100 km theo đường sông Hậu. Cần Thơ có tọa độ địa lý 105o13’38” - 105o50’35” kinh độ Đông và 9o 55’08” 10o19’38” vĩ độ Bắc, trải dài trên 55 km dọc bờ Tây sông Hậu. Phía bắc giáp tỉnh An Giang, phía đông giáp tỉnh Đồng Tháp và tỉnh Vĩnh Long, phía tây giáp tỉnh Kiên Giang, phía nam giáp tỉnh Hậu Giang. Diện tích nội thành là 53 km². Thành phố Cần Thơ có tổng diện tích tự nhiên là 1.409,0 km², chiếm 3,49% diện tích toàn vùng và dân số vào khoảng 1.200.300 người, mật độ dân số tính đến 2011 là 852 người/km². Cần Thơ cũng là thành phố hiện đại và lớn nhất của cả vùng hạ lưu sông Mê Kông (http://cantho.gov.vn, ngày 23/11/2013) (Hình 1). Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hình 1: Bản đồ hành chính thành phố Cần Thơ (*Nguồn:http://cantho.gov.vn/wps/wcm/connect/sotnmt/sub+site/sitemenu/linhvucquanly/datdai/can+th o-qhsdd+den+nam+2020, ngày 30/07/2013)  Về điều kiện tự nhiên: Thành phố Cần Thơ nằm toàn bộ trên đất có nguồn gốc phù sa sông Mê Kông bồi đắp và được bồi lắng thường xuyên qua nguồn nước có phù sa của dòng sông Hậu. Địa chất trong thành phố được hình thành chủ yếu qua quá trình bồi lắng trầm tích biển và phù sa của sông Cửu Long, trên bề mặt ở độ sâu 50 mét có hai loại trầm tích là Holocen (phù sa mới) và Pleistocene (phù sa cổ). Địa hình nhìn chung tương đối bằng phẳng, phù hợp cho sản xuất nông, ngư nghiệp, với độ cao trung bình khoảng 1 - 2 mét dốc từ đất giồng ven sông Hậu, và sông Cần Thơ thấp dần về phía nội đồng tức là từ phía đông bắc sang phía tây nam. Bên cạnh đó, thành phố còn có các cồn và cù lao trên sông Hậu như Cồn Ấu, Cồn Khương, Cồn Sơn, Cù lao Tân Lập. Thành phố Cần Thơ có 3 dạng địa hình chính là Địa hình ven sông Hậu hình thành dải đất cao là đê tự nhiên và các cù lao ven sông Hậu. Ngoài ra do nằm cạnh sông lớn, nên Cần Thơ có mạng lưới sông, kênh, rạch khá chằng chịt. Vùng tứ giác Long Xuyên, thấp trũng, chịu ảnh hưởng lũ trực tiếp hàng năm. Đồng bằng châu thổ chịu ảnh hưởng thủy triều cùng lũ cuối vụ. Cần Thơ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, ít bão, quanh năm nóng ẩm, không có mùa lạnh. Mùa mưa kéo dài từ tháng 5 đến tháng 11, mùa khô từ tháng 12 tới tháng 4 năm sau. Nhiệt độ trung bình năm khoảng 28°C, số giờ nắng trung bình cả năm khoảng 2.249,2 giờ, lượng mưa trung bình năm đạt 1600 cm. Độ ẩm trung bình Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT năm giao động từ 82% - 87%. Do chịu ảnh hưởng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có lợi thế về nền nhiệt độ, chế độ bức xạ nhiệt, chế độ nắng cao và ổn định theo hai mùa trong năm (http://cantho.gov.vn, ngày 23/11/2013). Các lợi thế này rất thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển của sinh vật, có thể tạo ra một hệ thống nông nghiệp nhiệt đới có năng suất cao, với nhiều chủng loại cây con, đặc biệt là các cây cỏ hoang dại có tác dụng làm thuốc chẳng hạn như cây cúc mui (Tridax procumbens). 2.2 Sơ lược cây cúc mui (Tridax procumbens) 2.2.1 Phân loại thực vật (Amita et al., 2012) Giới : Thực vật Ngành phụ: Tracheobionta (Thực vật có mạch) Phân loại: Magnoliophyta (Thực vật có hoa) Lớp: Magnoliopsida (Cây song tử diệp) Lớp phụ: Asteridae Bộ: Asterales Họ: Asteraceae (Cúc) Giống (chi): Tridax Loài: Tridax procumbens (L.) Tên khác: Cúc mui, Sài lan, Sài lông, Thu thảo Hình 2: Cây cúc mui (Tridax procumbens) (*Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Tridax_procumbens, ngày 01/08/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.2.2 Mô tả cây cúc mui (Amita et al., 2012) Cây cúc mui là cây thân thảo sống lâu năm. Thân cao từ 30 - 50 cm, có lông trắng dày, phân nhánh, mọc bò sát mặt đất. Lá lá đơn, mọc đối, có lông ở cả hai mặt, mép có răng to, nhọn, không đều. Cụm hoa hình đầu, mọc ở ngọn thân, trên một cán dài 20 - 30cm. Hoa cái hình môi, màu trắng; hoa lưỡng tính hình ống, màu vàng. Quả bế còn lông, mào lông do 10 lông to dài và 10 lông ngắn. Đài hoa được tạo thành bởi các vảy hoặc mào lông ngắn lại. Hạt rơi xuống phôi và không có phôi nhũ. Cây ra hoa, kết quả tháng 4 - 6 và tháng 8 - 12. Hình 3: Hoa cây cúc mui ở Hyderabad, Ấn Độ (*Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Tridax_procumbens, ngày 01/08/2013) Bộ phận dùng: Toàn cây - Herba Tridacis Procumbentis. 2.2.3 Vùng phân bố, thu hái và nhân giống cây cúc mui Cây gốc ở Trung Mỹ được truyền vào nước ta, nay mọc hoang ở bờ đường, bãi cỏ, đất hoang, đồi núi. Để làm thuốc, thu hái toàn cây quanh năm, dùng tươi hay phơi khô (http://danhydatviet.vn/vi/news/Duoc-lieu/Cuc-mui-5441/, ngày 24/11/2013). Nó không thể vi nhân giống bằng các cách thức như ở thực vật ví dụ như cắt. Sự nhân giống thông qua các hạt gây ra các biến thể. Các phương pháp đã được phát triển để bảo tồn sự di chuyển của chúng thông qua phương pháp vi nhân giống (Saini et al., 2008). Cây cúc mui phân bố rộng rãi là do thân sản xuất nhiều hạt và phát tán (Chauhan và Germination, 2008). Không giống như các cây lâu năm, cây cúc mui không có bất kỳ phương tiện phát tán, vì vậy nó được phân tán gần như hoàn toàn Chuyên ngành Vi sinh vật học 6 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT bằng hạt của nó. Các chùm của lông trên quả bế cho phép chúng được phát tán theo gió. 2.2.4 Đặc tính sinh học Cây cúc mui là loài thảo dược lâu năm sinh sản bằng hạt và yêu cầu phải được tiếp xúc đầy đủ cho sự phát triển. Các loại thảo mộc này chịu được hạn hán, nhiệt độ và độ ẩm, ô nhiễm môi trường, bờ biển, độ dốc và gió (Amita et al., 2012). 2.2.5 Thành phần hoá học Một số thành phần hóa học đã được nghiên cứu từ cây cúc mui như: alkaloid, flavonoid, carotenoid, β-sitisterol, n-hexane, acid fumaric, luteolin, quercitin, oxoester, acid lauric, myristic, palmitic, arachidic, acid linoleic và tannin…(Singh và Ahirwar, 2010). Trước đây, nó đã được báo cáo về sự hiện diện của dexamethasone, luteolin, glucoluteolin, betasitosterol và quercitin (Reddy et al., 2006; Subramanian et al., 1968). Acid linolenic cũng đã được báo cáo trong các phần ở phía trên của cây. Hai polysaccharide tan trong nước; WSTP - IA và WSTP - IB có chứa chuỗi chính β - (1 6) - D - Galactan cũng đã được tinh chế từ lá của cây (Raju và Davidson, 1994). Sự xác định một số sterol bằng GC - MS và các thành phần lipid của cây cúc mui cũng đã được báo cáo. Một flavonoid mới "Procumbenetin" được phân lập từ các bộ phận phía trên của cây đã được mô tả là 3,6 dimetoxy - 5,7,2',3',4' - pentahydroxyflavone 7 - O β - glucopyranoside (Singh và Ahirwar, 2010). Thành phần khoáng chất được nghiên cứu từ lá của cây cúc mui có chứa calci, magie, kali, natri và selen. Nó đã được quan sát thấy rằng có thể phục vụ như một nguồn cung cấp protein thực vật và bổ sung kali, cũng như là nguồn tiềm năng của tiền chất vitamin A (caroten) cho người dân (Chen et al., 2008; Jude et al., 2009). Bốn terpenoid mới cùng với bis-bithiophene đã được báo cáo từ Tridax procumbens là acetate taraxasteryl, beta-amyrenone, acid lupeol và oleanolic (Ali và Jahangir, 2002). Hai flavon mới, 8,3'-dihydroxy-3,7,4'-trimethoxy-6-O-β-D- glucopyranosyl flavone (1) và 6,8,3'-trihydroxy-3,7,4'-trimethoxyflavone (2) được phân lập từ Tridax procumbens Linn., cùng với bốn hợp chất đã được biết là puerarin (3), esculetin (4), acid oleanolic (5) và acid betulinic (6) (Hình 4). Các cấu trúc của hai flavon mới đã được giải thích dựa trên phân tích hóa học và phương pháp quang phổ Chuyên ngành Vi sinh vật học 7 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT (IR, 1D và 2D NMR, ESIMS, HR-ESI-MS). Các hoạt động chống oxy hóa của hai flavon mới được đánh giá bằng hai phương pháp 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) hoạt động loại bỏ triệt để gốc tự do và các xét nghiệm làm giảm năng lượng chống oxy hóa của sắt (FRAP), và các dữ liệu cho thấy các hợp chất (1) và (2) có hoạt động chống oxy hóa nhất định, với các hoạt động chống oxy hóa của hợp chất (2) là mạnh hơn so với hợp chất (1). Có thể thấy rằng các phân tử 1 có cấu trúc taraxasteryl acetate, hình dạng của các mảnh triterpene trong số đó thực tế cũng giống như của taraxasterol acetate (Runsheg et al., 2010). Hình 4: Các cấu trúc của các hợp chất (1- 6) (*Nguồn: www.ijpbs.net/vol-3/issue-1/bio/P% 20 -% 2061.pdf, ngày 04/08/2013) Cây cúc mui giàu natri, kali và calci (Jude, 2009). Lá của nó chủ yếu chứa protein thô 26%, chất xơ thô 17%, và carbohydrate hòa tan 39%, calcium oxide 5%. Acid oleanolic cũng thu được với số lượng nhiều từ cây cúc mui và nó được cho là một tác nhân trị đái tháo đường tiềm năng khi thử nghiệm với a-glucosidase (Verma et al., 1998; Ali và Jahagir, 2002). Chuyên ngành Vi sinh vật học 8 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.2.6 Dược tính Cây cúc mui đã được biết đến với một số hoạt động điều trị tiềm năng như tác động bảo vệ gan, khả năng điều hòa miễn dịch, hứa hẹn hoạt động chữa lành vết thương, chống tiểu đường, hạ huyết áp, giảm sưng tấy do côn trùng cắn, chống viêm và chống oxi hóa, viêm phế quản, kiết lỵ và tiêu chảy. Cây cúc mui cũng ngăn rụng tóc và được sử dụng như một loại thuốc bổ tóc (Nazeruddin et al., 2011).  Hoạt động kháng khuẩn Toàn bộ cây cúc mui đã được báo cáo cho hoạt động kháng khuẩn của nó trên nhiều loài vi khuẩn. Dịch chiết cây tươi được sử dụng hai lần một ngày trong 3-4 ngày để chữa trị các vết đứt và vết thương. Chiết xuất của cả cây cúc mui cho thấy hoạt tính kháng khuẩn chỉ chống lại Pseudomonas aeruginosa. Bốn chủng vi khuẩn được sử dụng trong thử nghiệm là cả vi khuẩn gram dương và gram âm Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus và cả hai vi khuẩn gram âm Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa (Mahato và Chaudhary, 2005). Theo nghiên cứu của Bharathi et al., 2012 đã xác định hoạt động kháng khuẩn của chiết xuất methanolic và ethyl acetate từ lá của cây cúc mui có khả năng chống lại Echerichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Bacillus cereus, Staphylococcus eureus. Chiết xuất n-hexane từ hoa cây cúc mui cho thấy hoạt động chống Bacillus cereus và Klebsiella sp, chiết xuất ethy acetate ở những phần phía trên của hoa cây cúc mui chỉ chống lại Mycobacterium smegmatis và Staphylococcus aureus. Chiết xuất n-hexan của tất cả những phần phía trên của cây cúc mui đã được báo cáo về hoạt động chống Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Salmonella nhóm C và Salmonella paratyphi (Taddei và Rosas, 2000). 2.2.7 Công dụng, chỉ định và phối hợp Thường được dùng trong phạm vi dân gian làm thuốc sát trùng, chữa sưng tấy thay vị Sài đất. Ở Campuchia, cây dùng làm thuốc giải nhiệt, trị ho và đau thấp khớp. Ngày dùng 20 - 30g, sắc nước uống (http://danhydatviet.vn/vi/news/Duoc-lieu/Cucmui-5441/, ngày 24/11/2013). Chuyên ngành Vi sinh vật học 9 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.3 Giới thiệu về vi khuẩn nội sinh 2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh Endophytes, theo định nghĩa là các vi sinh vật (VSV) (chủ yếu là nấm và vi khuẩn) sống trong mô của cây còn tươi cả đời hoặc một phần chu kỳ sống của chúng mà không gây ra các triệu chứng có hại rõ ràng cho các cây chủ (Sturz et al., 2000; Wellington và Marcela, 2004). Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào các hoạt động sinh học của nấm nội sinh và vi khuẩn nội sinh (Strobel, 2003). Bởi vì sống trong một môi trường tương đối ổn định - trong mô thực vật, endophytes có thể sản xuất được nhiều hoạt tính sinh học hơn các vi khuẩn vùng rễ hoặc bất kỳ vi khuẩn khác mà được phân lập từ bề mặt cây trồng hoặc từ đất (Dowler và Weaver, 1974; Andrews, 1992). Là một thành viên của endophytes, VKNS cũng đã được quan tâm nhiều hơn về hoạt động sinh học đối kháng của chúng bao gồm cả kiểm soát sinh học của các bệnh thực vật, kích thích tăng trưởng thực vật, và cố định đạm…(Harris et al., 1994; Chen et al., 1995; Cui et al., 2003; Qiao et al., 2006). Vi khuẩn nội sinh được tìm thấy hầu hết ở các loài thực vật, chúng cư trú ở trong nội mô của thực vật ký chủ và giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh… Hầu hết các dạng nội sinh này bắt đầu xuất hiện từ vùng rễ hay bề mặt lá, tuy nhiên, một số loại có thể ký sinh trên hạt. Vi khuẩn nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng vai trò là một tác nhân điều hòa sinh học. Vi khuẩn nội sinh sản xuất hàng loạt các sản phẩm tự nhiên có lợi cho thực vật ký chủ mà ta có thể khai thác những tác nhân đó để ứng dụng trong y học, nông nghiệp hay công nghiệp. Ngoài ra nó còn có tiềm năng loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong đất bằng cách tăng cường khả năng khử độc trên thực vật và làm cho đất trở nên màu mỡ thông qua chu trình phosphate và cố định đạm. Ngày càng có nhiều quan tâm trong việc phát triển các ứng dụng tiềm năng công nghệ sinh học của VKNS để phát triển các giống cây trồng có khả năng khử độc đồng thời có khả năng sản xuất sinh khối và nhiên liệu sinh học. Những tương tác có lợi giữa thực vật - vi khuẩn thúc đẩy sức khỏe, sự phát triển của cây trồng, vấn đề này đang được các nhà nghiên cứu quan tâm. Gần đây, họ đang nghiên cứu tiềm năng cho giải pháp nâng cao khả năng phân hủy sinh học của các chất gây ô nhiễm trong đất. Hầu hết các nghiên cứu này tập trung vào các vi khuẩn ở rễ (Lindow và Brandt, 2003; Kuiper et al., 2004; Berg et al., 2005). Vi khuẩn nội sinh có Chuyên ngành Vi sinh vật học 10 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT thể được xem như là vi khuẩn tập trung trong mô thực vật mà có những dấu hiệu nhiễm bệnh hay hậu quả tiêu cực đối với cây chủ (Schulz và Boyle, 2005). Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trong cây trồng (Quispel, 1992). Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3 cách là: bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots), thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như Azotbacter, Bacillus, Beijerinckia, Derxia, Enterobacteriaceae (Klebsiella, Enterobacter, Pantoea), Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum, Gluconacetobacter và Paenibacillus (Elmerich, 2007). Tuy nhiên nó cũng có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị trí bị tổn thương của lá (Roos và Hittingh, 1983). Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các VKNS có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002). Mật số của quần thể VKNS rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ; nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi trường (Pillay và Nowak, 1997; Tan et al., 2003). Một số nhóm VKNS không gây hại hay gây bệnh cho cây chủ, mà trái lại chúng có thể thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kích thích sự sinh trưởng thực vật và sự cố định đạm từ không khí (Sturz et al., 2000). Hơn nữa, một số dòng VKNS có thể cải thiện sự phát triển bệnh (Benhamou et al., 1996) và kích thích sự chống chịu của cây trồng đối với sự tác động của các nhân tố vô sinh và hữu sinh (Hallmann et al., 1997). Vùng rễ là nơi tiếp giáp giữa rễ thực vật và đất, là nơi lắng động các chất hữu cơ, và là nơi xuất phát của các môi trường sống và các nguồn sống khác nhau cho các vi sinh vật đất. Thực vật có thể thay đổi vùng rễ của chúng nhờ sự hấp thu các chất dinh dưỡng, độ ẩm và oxy từ vùng rễ; và các chất do rễ tiết ra. Đặc tính quan trọng của các dịch rễ là có tỉ lệ C/N cao nên có thể đẩy mạnh sự phong phú của các vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ (Döbereiner, 1974). Ngược lại, vi sinh vật vùng rễ có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây do sự tác động của chúng đến giá trị của các chất dinh dưỡng, sự phát triển và hình thái của rễ (Harari et al., 1988). Nhờ sự đa dạng của cây trồng và sự đa dạng của vùng rễ nên các nhà khoa học đã khám phá được nhiều nhóm VKNS khác nhau từ các loại cây khác nhau. Chuyên ngành Vi sinh vật học 11 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Các vi khuẩn vùng rễ làm tăng sự hấp thu dinh dưỡng và sự chuyển hóa các chất trong các cây còn non (Rovira et al., 1983). Azospirillum brasilense đã thúc đẩy sự phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ ở Panicum miliaceum (Harari et al., 1988). Vi khuẩn nốt rễ sống trong rễ lúa giúp cây hấp thu nhiều nitơ, lân, kali và sắt tăng từ 10 - 64% (Biswas et al., 2000). Chaintreuil et al. (2000) đã phát hiện những vi khuẩn nốt rễ còn sống trong rễ lúa hoang (Oryza breviligulata) ở vùng Châu Phi và chúng có nguồn gốc từ những cây điên điển (Sesbania sp.) mọc chen lẫn với cây lúa hoang. Như vậy vi khuẩn nốt rễ không những nội sinh ở cây họ đậu mà còn xâm nhiễm vào cả cây hòa bản và cố định đạm sinh học cho cây. Hơn 300.000 loại thực vật được biết trên trái đất, mỗi loài có một hay nhiều loài VKNS (Strobel et al., 2004). Tuy nhiên chỉ có một số ít cây trồng được nghiên cứu tường tận vì hiệu quả kinh tế của chúng và tìm thấy nhiều loài VKNS mới với nhiều đặc tính tốt (Ryan et al., 2008). Vi khuẩn nội sinh giúp tăng cường sinh trưởng và chuyển hóa các chất trong cây. Vi khuẩn nội sinh có thể sống bám ở bề mặt rễ, hay chui vào rễ qua lông hút hoặc các vị trí tổn thương của cây. Sau khi xâm nhập vào cây chủ các VKNS có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây, vào các khoảng gian bào, vào hệ mạch (Sprent và James, 1995; Reinhold - Hurek, 1988; Zinniel et al., 2002), giúp tăng cường sự dinh dưỡng của cây bằng nhiều cơ chế trực tiếp hay gián tiếp, bao gồm sự cố định Nitơ trong khí quyển, cung cấp khoáng chất như phosphate tổng hợp hoocmon thực vật (Hill et al., 1972; Khalil et al., 1989; Kloepper và Beauchamp, 1992; Kloepper et al., 1992; Hallmann et al., 1997; Kobayashi và Palmudo, 2000; Hung và Annnapurna, 2004; Lãng Ngọc Dậu et al., 2007). Vi khuẩn nội sinh có vai trò quan trọng trong việc cố định đạm cho cây trồng. Thí nghiệm trên mía ở Brazil cho thấy VKNS có thể cung cấp 80 kg/ha/năm (Boddey et al., 1995). Đây là những vi sinh vật có lợi, có vai trò quan trọng trong sự ổn định chu trình dinh dưỡng Nitơ, bổ sung nguồn đạm cho đất và dinh dưỡng cây trồng, ổn định năng suất mùa vụ, phát triển bền vững sinh thái (Persello - Cartieaux et al., 2003). Nhiều VKNS trong cây lúa mùa, cây cỏ chăn nuôi, cây khóm như Azospirillum lipoferum, Klebsiella pneumoniae, Burkholderia tropica… cũng có khả năng hòa tan lân khó tan (Lăng Ngọc Dậu et al., 2007; Nguyễn Thị Thu Hà et al., 2009; Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Ái Chi, 2009). Vi khuẩn Enterobacter cloacae có khả năng tổng hợp IAA từ tiền chất L-tryptophan (Koga et al., 1991). Vi khuẩn Azotobacter cũng có khả Chuyên ngành Vi sinh vật học 12 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT năng tổng hợp IAA từ tiền chất L - tryptophan (Ahmad et al., 2005). Nghiên cứu của Somers et al. (2005) cho thấy vi khuẩn Azospirillum brasilense có khả năng tổng hợp IAA từ L - tryptophan. Một trong những khám phá mới về VKNS là chúng có khả năng tổng hợp ra những hợp chất chống lại mầm bệnh như vi khuẩn, nấm, tuyến trùng… gây bệnh cho cây trồng, có thể xem những hợp chất này (phytophathogens) như là một hợp chất kiểm soát sinh học hay đối kháng (biocontrol agents) (Berg et al., 2005). Ngoài ra, chúng còn có thể tổng hợp ra những hợp chất tự nhiên phân hủy các hóa chất độc hại như thuốc bảo vệ thực vật, dung môi hữu cơ…nên còn gọi là các hợp chất phân hủy thực vật (phytoremediation) (Siciliano et al., 2001) góp phần trong việc xây dựng nền nông nghiệp bền vững. 2.3.2 Các nhóm vi khuẩn nội sinh tiêu biểu Ngày nay các nhà khoa học đã phát hiện nhiều nhóm VKNS trong nhiều loại cây trồng và cả những loài thực vật hoang dại, các nhóm VKNS thường gặp sẽ mô tả dưới đây: 2.3.2.1 Vi khuẩn Azospirillum Vào năm 1923, Beijerinck phân lập được nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn, và đã được Becking (1963) phát hiện lại. Đến năm 1976, Döbereiner và Day mô tả về sự liên hợp của những vi khuẩn này với các cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác nhau. Sau đó các vi khuẩn này được phân thành giống mới, và được gọi là Azospirillum (Tarrand et al., 1978). Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động và có dạng hình que ngắn; kích thước biến thiên trong khoảng 0,8-1,7μm chiều rộng và 1,4 3,7μm chiều dài (Nguyễn Hữu Hiệp et al., 2005). Các loài Azospirillum biểu hiện sự phân bố sinh thái vô cùng rộng lớn và được gắn liền với sự đa dạng to lớn của cây trồng (Van Berkum và Bohlool, 1980). Trong những năm 1984 - 1985, người ta đã phát hiện nhiều loài của giống Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca) (Reinhold et al., 1986); trong đó các vi khuẩn xâm nhập vào bên trong nhu mô rễ có khả năng cố định đạm, hòa tan lân ở dạng khoáng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Seshadri et al., 2000; Richardson, 2003), sản xuất kích thích tố thực vật (Vande Broek et al., 1999), hay Chuyên ngành Vi sinh vật học 13 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng (Rangarajan et al., 2003). Khi Okon và Labandera - Gonzalez (1994) phân tích tài liệu về các thử nghiệm ngoài đồng ở các cây trồng được chủng với Azospirillum thì nhận thấy sản lượng cây trồng tăng 5 30%, cao hơn nhiều so với khi sử dụng phân bón hóa học. Sản lượng tăng là do hệ thống rễ phát triển tốt hơn, tương quan với việc tăng tỉ lệ nước và khoáng được rễ hấp thu. 2.3.2.2 Vi khuẩn Azotobacter Năm 1966, Döbereiner phân lập được loài Azotobacter paspali từ các cây cỏ đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm của bà (Döbereiner, 1974). Sự khám phá ra vi khuẩn A. paspali là một bước quan trọng trong sự cố định đạm cộng sinh. Đây là loài đặc hiệu cho Paspalum notatum và khoai lang. Tuy nhiên, khi Brown (1976) theo dõi sự khử acetylene thì nhận thấy không phải lúc nào Paspalum notatum cũng được cộng sinh với sự có mặt của A. paspali ở vùng rễ, và bà cho rằng A. paspali cải thiện sự sinh trưởng của Paspalum notatum chủ yếu là bằng việc tạo ra các auxin hơn là bằng sự cố định đạm. 2.3.2.3 Vi khuẩn Klebsiella Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm γ - Proteobacteria, là vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que, không hay ít chuyển động, kết nang, sống kỵ khí không bắt buộc. Có 2 loài quan trọng là Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca. Vi khuẩn Klebsiella thường xuất hiện tự nhiên trong đất, một số xâm nhập vào cây trồng và sống nội sinh trong cây. Có khoảng 30% các dòng của 2 loài này có thể cố định đạm trong các điều kiện kỵ khí (http://en.wikipedia.org/wiki/Klebsiella, 24/11/2013). Theo Lü và Song (2001), vi khuẩn Klebsiella oxytoca dòng SG-11 được phân lập từ rễ lúa là vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật nhờ vào khả năng cố định đạm từ nitơ không khí và khả năng tổng hợp IAA từ tryptophan theo lộ trình indole -3pyruvic acid của chúng. Ở Ấn Độ, Jha và Kumar (2007) nghiên cứu vi khuẩn K. oxytoca dòng GR - 3 được phân lập từ rễ và thân của cây cỏ đuôi mèo (Typha australis) thì nhận thấy chúng có mật số ở rễ là 6x106 CFU/g, khả năng tổng hợp IAA từ tiền chất tryptophan là 30μg/mg trọng lượng khô, khả năng hòa tan lân khó tan là 31,5 μg/mg trọng lượng khô, và mức độ biểu hiện hoạt tính của phức hệ nitrogenase qua phản ứng khử acetylene là khá cao (1,25μmol C2H4/mg protein/h). Sau đó, các nhà nghiên cứu sử Chuyên ngành Vi sinh vật học 14 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT dụng vi khuẩn K. oxytoca dòng GR - 3 chủng cho giống lúa Malviya dhan - 36 thì nhận thấy vi khuẩn này giúp gia tăng toàn bộ chiều dài cây và tăng hàm lượng chlorophyll - a có hiệu quả; đồng thời chúng còn kích thích sự thành lập rễ bên và rễ bất định cho cây. 2.3.2.4 Vi khuẩn Enterobacter Vi khuẩn Enterobacter cũng thuộc nhóm γ - Proteobacteria, hầu hết là vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que, sống kỵ khí không bắt buộc. Một số loài của vi khuẩn này sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật có khả năng cố định đạm, là vi khuẩn kích thích sự sinh trưởng thực vật (http://en.wikipedia.org/wiki/Enterobacter, 24/11/2013). Hwangbo et al. (2003) đã phân lập được loài Enterobacter intermedium từ vùng rễ của một số cây cỏ ở Triều Tiên, chúng có khả năng hòa tan các phosphate khó tan để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng cách sản xuất hợp chất 2-ketogluconic acid. 2.3.2.5 Vi khuẩn Burkholderia Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn cố định đạm, Gram âm, dạng hình que ngắn, đường kính khoảng 1 m, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu (Caballero - Mellado et al., 2004). Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, trong môi trường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất. Trong môi trường nuôi cấy, chúng tạo thành các khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng 2-4 cm, tròn, phẳng hoặc lài (Caballero - Mellado et al., 2004; 2007). Vi khuẩn này có khả năng cố định đạm và tạo nốt sần trong những cây họ đậu nhiệt đới (Mounlin et al., 2001). Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định đạm, kích thích sự tăng trưởng của cây, hiện diện trong vùng rễ và rễ của nhiều loại cây như: bắp, mía, cà phê, lúa (Scarpella et al., 2003). Hiện nay người ta tìm được khoảng hơn 40 loài Burkholderia (Martinez - Aguilar et al., 2008) bao gồm vi khuẩn cố định đạm trong đất, rễ cây, đẩy mạnh các giai đoạn phát triển của cây (Coenye và Vandamme, 2003; Osullivan và Mahenthiralingam, 2005). Chuyên ngành Vi sinh vật học 15 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.3.2.6 Vi khuẩn Pseudomonas Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Trong số những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học. Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử. Các đặc điểm sinh lý là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen (http://vi.wiki pedia.org/wiki/Pseudomonas, 24/11/2013). Một số chủng Pseudomonas có ảnh hưởng quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển thực vật như tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như: auxin, cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong đất ở một số loài như: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syringae (Glickmann et al., 1998). Khả năng phân giải phosphat. Trong rác ủ, phospho tồn tại ở nhiều dạng hợp chất khác nhau. Phospho được tích luỹ trong rác khi động thực vật chết đi, những hợp chất phospho hữu cơ này được vi sinh vật phân giải tạo thành các hợp chất phospho vô cơ khó tan. Do đó phospho tồn tại ở hai dạng: phospho hữu cơ và phospho vô cơ. Vi sinh vật hòa tan lân hữu cơ chủ yếu thuộc hai chi: Bacillus và Pseudomonas. Các loài có khả năng phân giải mạnh là B. megatherium, B. mycoides và Pseudomonas sp. Trong số các loài Pseudomonas spp., P.fluorescens là được chú ý nghiên cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại mầm bệnh phát sinh từ đất, nó còn có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng (Nguyễn Trọng Thể, 2004). * Pseudomonas fluorescens: Pseudomonas fluorescens là vi khuẩn hình que, Gram âm, sống trong đất, thực vật và cả trên mặt nước. Nhiệt độ phát triển tối ưu từ 25 - 30oC. Chủng Pf-5 trong vùng rễ của cây trồng và sản xuất nhiều loại chất chuyển hóa thứ cấp bao gồm thuốc kháng sinh chống lại đất chịu tác nhân gây bệnh (Paulsen et al., 2005). Chủng Pseudomonas fluorescens SBW25 phát triển trên lá cây và rễ nơi chúng có thể đóng góp vào sự tăng trưởng thực vật. Tầm quan trọng của những sinh vật này đã tăng lên vì khả năng phân huỷ các chất ô nhiễm khác nhau và sử dụng chúng như kiểm soát sinh học chống lại Chuyên ngành Vi sinh vật học 16 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT tác nhân gây bệnh. Pseudomonas fluorescens là một loài vi khuẩn thú vị và quan trọng để nghiên cứu vì nó tạo ra một kháng sinh đặc biệt (mupirocin) đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị một số loại da, tai, và các rối loạn mắt (http://microbewiki. kenyon.edu/index.php/Pseudomonas fluorescens, 24/11/2013). 2.3.2.7 Vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus có dạng hình que, Gram dương, di động bằng roi, có kích thước 2-3 x 0,7-0,8µm, nội bào tử ở trung tâm có kích thước 1,5-1,8 x 0,8 µm. Vi khuẩn B. subtilis cũng được tìm thấy có khả năng tiết ra một số hợp chất diệt khuẩn và diệt nấm. Sản phẩm các kháng sinh được tiết ra là difficidin, oxydifficidin, bacitracin, bacillin, bacilomycin B có khả năng kháng các loài vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí (Claus và Berkeley, 1986). Bên cạnh đó, Wei Sheng Wu Xue Bao (1998) đã phân lập và nhận diện được một số dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis, B. subtilis, B. azotoformans, B. cereus, B. pumilus, B. brevis, B. megaterium, B. firmu có khả năng cố định đạm ở vùng rễ cây gạo. Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,… một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; một vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B. Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 45oC, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65oC (Rosovitz et al., 1998) . Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 - 10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 - 6 như Bacillus acidocaldrius (Cao Thị Hạnh, 2007). Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong xử lý môi trường,.. Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên: Chuyên ngành Vi sinh vật học 17 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT *Bacillus subtilis Bacillus subtilis, còn được gọi là trực khuẩn cỏ khô hoặc trực khuẩn cỏ, là một loại vi khuẩn Gram dương , catalase dương tính, thuộc chi Bacillus , Bacillus subtilis là trực khuẩn hình que, có khả năng tạo bào tử, có khả năng chịu đựng các điều kiện môi trường khắc nghiệt. Mặc dù loài này thường được tìm thấy trong đất, tuy nhiên nhiều bằng chứng cho thấy B. subtilis cũng tồn tại trong ruột người, động vật (http://menvisinh.org/content/Bacillus-subtilis, 24/11/2013). B. subtilis có thể phân chia đối xứng để tạo thành hai tế bào con (nhị phân phân hạch), hoặc không đối xứng, tạo bào tử trong điều kiện môi trường bất lợi như hạn hán, độ mặn, bức xạ cực cao, pH và dung môi, môi trường nghèo dinh dưỡng. Trong môi trường sống khắc nghiệt, trước giai đoạn hình thành bào tử, các tế bào vi khuẩn có thể tự tạo ra các chất đề kháng (kháng sinh), hoặc giết chết đồng loại để tìm kiếm dinh dưỡng (http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis, 24/11/2013). B.subtilis có khả năng sinh tổng hợp một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn Gram (-), Gram (+) và nấm gây bệnh. Các sản phẩm kháng sinh được tiết ra là difficidin, oxydifficidin, bacitracin, bacillin, bacilomycin B có khả năng kháng các loài vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí (Claus and Berkeley, 1986). Nghiên cứu của Stein (2005) cho thấy tiềm năng sản sinh chất kháng sinh của B. subtilis đã được ghi nhận hơn 50 năm qua. Theo nghiên cứu của Fernando et al. (2005), Bacillus megaterium và B. subtilis được phát hiện là vi khuẩn nội sinh trong cây cà phê. Ngoài ra, B. subtilis cũng đã được báo cáo là vi khuẩn nội sinh trong cây dẻ, giúp cây chống lại bệnh cháy lá do nấm Cryphonectria parasitica gây ra (Wilhelm et al, 1998). * Bacillus amyloliquefaciens Bacillus amyloliquefaciens là một trực khuẩn gram dương có liên quan chặt chẽ với các loài Bacillus subtilis. Hai loài này có nhiều gen tương đồng và xuất hiện tương tự nhau không thể phân biệt được chúng một cách trực quan (Friest et al., 1987). Bacillus amyloliquefaciens là trực khuẩn Gram dương, hình que, di động, kích thước 0,7 - 0,9 x1,8 - 3m, nội bào tử (0,6 - 0,8 x 1 - 1,4m), là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí, phát triển tối ưu ở pH = 7, NaCl không cần thiết cho sự tăng trưởng. Nhiệt độ giới hạn 15 - 50o C, nhiệt độ tối ưu 30 - 40oC (http://www.tgw1916.net/Bacillus/ Chuyên ngành Vi sinh vật học 18 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT amyloliquefaciens.html, ngày 26/11/2013). Nó cũng tổng hợp protein barnase là một loại kháng sinh tự nhiên (http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_amyloliquefaciens, ngày 26/11/2013). B. amyloliquefaciens FZB42 được coi là PGPR do kiểm soát sinh học và sản xuất auxin thúc đẩy tăng trưởng thực vật (Chen et al., 2007). Bacillus amyloliquefaciens được tìm thấy để sản xuất hỗn hợp của acid lactic, isovaleric, isobutyric, acid acetic và cũng được báo cáo là có khả năng hòa tan lân (Idriss et al., 2002). Sushil et al. (2013) cho rằng dòng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sks_bnj_1 thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật và ảnh hưởng trên đất vùng rễ của đậu tương. Mẫu phân lập được xác định dựa vào trình tự gen 16S - rRNA cho thấy 98,7% tương đồng với dòng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sks_bnj_1 (AY 932.823) chúng có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng ở cây đậu tương như: sản xuất siderophore, indole -3- acetic acid, deaminase ACC, phosphatases, phytase, HCN, cellulase, hòa tan kẽm và đối kháng với các mầm bệnh trong đất gây ra. Nghiên cứu này cho thấy rằng dòng vi khuẩn B. amyloliquefacienssks_bnj_1 cải thiện hầu hết các thuộc tính vùng rễ, cây tăng trưởng, đồng hóa các chất dinh dưỡng và năng suất của đậu tương. * Bacillus cereus Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh (http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus, ngày 24/11/2013). Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 - 1,5) x (3 - 5)µm, có khi dài hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 - 1,5)µm nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào (Lương Đức Phẩm, 2007). Khuẩn lạc của chúng phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm (Nguyễn Lân Dũng, 1983). Theo nghiên cứu của Swetha và Valli (2012) trên cây bứa mủ vàng (Garcinia xanthochymus), Bacillus cereus sống nội sinh có khả năng diệt các chủng vi khuẩn E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi và Klebsiella pneumonia. Chuyên ngành Vi sinh vật học 19 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT * Bacillus polymyxa Bacillus polymyxa là vi khuẩn Gram dương, có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi, trơn, nhày, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy. Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 - 1) x (2 - 7) µm, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh (Nguyễn Lân Dũng, 1983). Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao. Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng 1,7 - 2,6 µm, nằm giữa tế bào. Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccharide trong cây. Chúng còn có khả năng cố định đạm. Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và những môi trường có tính acid yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược (http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus, ngày 24/11/2013). 2.3.3 Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào bên trong cơ thể (mô) thực vật có thể sống sót và phát triển bên ngoài môi trường và có thể có nguồn gốc từ những hạt giống và cây con khi chúng ta phân phối hạt giống hạt cây con giống từ vùng này sang vùng khác. Chúng nhanh chóng phát triển trong đất vùng rễ hay bề mặt rễ (Hallmann, 2001), từ đây chúng nhân mật số và di chuyển vào trong mô thực vật bằng nhiều con đường. Trước hết, VKNS xuất phát từ nguồn nhất định. 2.3.3.1 Nguồn gốc Qua những kết quả thu được từ thân, lá hạt, rễ, Mano và Morisaki (2008) cho rằng nguồn của VKNS là đất vùng rễ. Kết hợp nhiều kết quả phân lập VKNS từ rễ cây lúa mì, bông vải, bắp ngọt, bắp đá và cải canola đều kết luận VKNS xuất phát từ đất. Vai trò của hạt như là một nguồn của VKNS vẫn là một điều còn tranh cãi (Hallmann et al., 1997). 2.3.3.2 Di chuyển Theo Hallmann (2001), thường VKNS được thu hút hay di chuyển từ môi trường bên ngoài đến cây chủ bằng cơ chế hóa hướng động hay ngẫu nhiên hoặc cả hai cơ chế. Chuyên ngành Vi sinh vật học 20 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Rễ cây tiết ra bên ngoài một số hợp chất như là dưỡng chất để VKNS tìm đến và quần tụ trên bề mặt rễ, ví dụ: vi khuẩn có ích Pseudomonas fluorescens và Azospirillum brasilense hướng đến rễ lúa mì do rễ lúa mì tổng hợp và phóng thích chất kích thích tổng hợp (Bashan, 1986). Ngoài ra, sự tiếp xúc ngẫu nhiên với rễ cây do rễ phát triển để tìm nguồn nước hay dưỡng chất cũng là cơ hội quan trọng để vi khuẩn có thể tiếp xúc với lông hút của rễ non. 2.3.3.3 Tiếp cận Một hợp chất trung gian để gắn chặt VKNS vào bề mặt rễ là lectins. Đây là hợp chất rất đặc biệt thường gặp trong các trường hợp vi khuẩn cộng sinh và giả thiết này cũng được các nhà khoa học đề cập đến VKNS vì Duijff et al. (1997) đã chứng minh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens dòng WCS417r đến bề mặt rễ do một hợp chất lipo - polysaccharide. 2.3.3.4 Xâm nhập hay xuyên thấu Theo Hallmann (2001), có nhiều con đường chính để VKNS xâm nhập vào bên trong mô thực vật như: - Các lỗ tự nhiên như thủy khổng (Hydathodes), lỗ khí khổng (stomata), lỗ rễ (bì khổng = lenticels). - Lỗ từ sự ma sát với đất hay vết bệnh, vị trí hình thành rễ ngang (lateral roots). - Vi lỗ (micropores). - Vết thương do tác động vật lý (wounds). Tuy nhiên con đường quan trọng và có khả năng nhất là VKNS xâm nhập vào bên trong mô thực vật là vết thương và vi lỗ hiện diện khi bắt đầu sự hình thành lông hút, chính đây là lớp tế bào non rất dễ xâm nhập. Thêm vào đó, vết bệnh cũng có thể là cửa ngỏ cho vi khuẩn xâm nhập vào bên trong ví dụ như trường hợp vết bệnh từ tuyến trùng (Hallmann et al., 1997) và vết nấm bệnh do Rhizotonia solani (Mahaffee và Kloepper, 1997). Ngoài ra vi khuẩn có thể tiết ra enzyme cellulase để phá hủy lớp tế bào biểu bì của rễ non để xâm nhập vào bên trong thực vật như trường hợp vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus. Vi khuẩn xâm nhập vào thẳng bên trong nhu mô rễ non và chúng vào thẳng những tế bào rễ. Chuyên ngành Vi sinh vật học 21 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Vi khuẩn có thể xâm nhập vào rễ lúa bằng các rãnh trong các rễ ngang của giống Sprice, chúng tập trung vào bên ngoài và bên trong vùng nhu mô rễ và các mạch gỗ rồi từ đây chúng khuếch tán vào thân lúa, chúng được tìm thấy trong các tế bào nhu mô lá. 2.3.3.5 Sinh sản Mặc dù VKNS tập trung hay tiếp cận các địa điểm mà chúng có khả năng xâm nhập vào bên trong mô thực vật nhưng mật số tương đối thấp chỉ từ 1.000 đến 1.000.000 tế bào/g mô thực vật (Hallmann, 2001), và chúng bắt buộc phải sinh sản một số lượng tương đối lớn trước khi xâm nhập vào bên trong mô thực vật. Hurek et al. (1994) cho rằng sự phân cắt hay sinh sản vi khuẩn Azoarcus sp. được tìm thấy bên ngoài và cả bên trong nhu mô rễ lúa và cỏ Kallar. 2.3.3.6 Xâm nhập Hallmann (2001) tóm tắt sự xâm nhập của VKNS vào bên trong mô thực vật bằng 7 con đường như sau: - Vi khuẩn nội sinh tập trung và xâm nhập ngẫu nhiên trên bề mặt rễ non của - Chúng cũng có thể tập trung và xâm nhập bên dưới lớp biểu bì rễ. - Chúng có thể tập trung và xâm nhập ngay vết thương ở rễ do sự ma sát. - Vi khuẩn nội sinh có thể tập trung và xâm nhập ngay lỗ mọc các lông hút. - Chúng tiếp cận đầu lông hút của rễ non để di chuyển vào trong. - Chúng len lỏi khoảng hở giữa các tế bào rễ. - Chúng có thể đi theo trong quá trình hấp thu chất dinh dưỡng vào rễ qua con cây. đường các mạch gỗ. Nhìn chung, VKNS có khả năng tập trung ở những vị trí đã trình bày ở phần trên là do rễ cây tiết ra những chất dinh dưỡng cần thiết cho vi khuẩn sinh sản. Beatle và Lindow (1995) [trích từ Hallmann, 2001] cho rằng VKNS có thể xâm nhập vào bên trong mô lá nhờ các khẩu của lục lap, qua con đường này vi khuẩn có đủ khoảng không thích hợp có đủ oxi cần thiết cho sự sinh trưởng trong điều kiện vi hiếu khí như khoảng trống chứa khí ở nhu mô rễ lúa mà Rheinold et al. (1987) đã phát hiện các VKNS sống tốt. Chuyên ngành Vi sinh vật học 22 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.3.3.7 Định cư Sau khi xâm nhập vào trong nhu mô thực vật, VKNS di chuyển đến các bó mạch gỗ để theo nước từ rễ lên các phần khác trên không của cây. Vi khuẩn nội sinh cũng có thể tập trung sinh sống và phát triển trong các tế bào nhu mô lá, tế bào diệp lục. Ở đây chúng có thể phát triển lâu dài hay có thể tiếp tục sinh sản và di chuyển đến các bộ phận khác của cây. 2.3.4 Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh lên hình thái và chức năng bộ rễ cây Một trong những hiệu quả nổi bật của VKNS đến hình thái rễ như gia tăng số lượng và độ dày của rễ tơ, làm tăng chiều dài của rễ trưởng thành, làm ngắn khoảng cách giữa chóp rễ và vùng mà ở đó rễ bắt đầu kéo dài. Nguyên nhân chính của việc kích thích hình thành rễ này là do vi khuẩn tiết các phytohormones và vì những thay đổi hình thái của rễ. Việc kích thích sự phát triển của rễ, đặc biệt là độ dày ở vùng rễ hoạt động nhằm làm tăng khả năng hút dinh dưỡng và hút nước của cây, tăng hô hấp của rễ và enzyme hô hấp, làm cho rễ ăn vào đất tốt hơn và cải thiện sự phát triển của cây, hình thành rễ, làm tăng nốt rễ, tạo những chất kích thích tăng trưởng (auxins, cytokinins, gibberellins) (Fulchieri et al., 1993). 2.3.5 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh Trong đất, vi khuẩn thường tập trung xung quanh rễ cây. Rễ cây tác động đến sự phát triển của vi khuẩn, ngược lại vi khuẩn vùng rễ cũng tác động đến hoạt động thực vật. Kết quả phân tích cho thấy dịch rễ cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn đất, kích thích sự gia tăng của một số vi khuẩn vùng rễ, dịch rễ có tỉ lệ C/N cao, làm tăng dồi dào vi khuẩn cố định đạm vùng rễ, còn những loại vi khuẩn này có khả năng cố định đạm cho cây hấp thụ, thúc đẩy sự kéo dài của rễ, giải phóng chất khoáng qua việc tiết acid, làm tăng hòa tan của lân và những nguyên tố dinh dưỡng khác cho cây hấp thụ, có vai trò quan trọng trong phân hủy sinh học (Kloepper, 1994). Vi khuẩn bám vào mặt rễ, xâm nhập vào bên trong rễ, phát triển trên hệ thống rễ và nhân mật số do sự điều khiển của gen chuyên biệt. Khi mật số vi khuẩn có ích đưa vào đủ lớn, chúng sẽ phát huy hiệu quả tích cực như cung cấp dinh dưỡng cho cây, quan trọng nhất là đạm (Kloepper, 1994). Việc xâm nhập vào rễ là yếu tố quyết định sự thành công trong mối quan hệ giữa thực vật và vi khuẩn, mật số của vi khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, nhất là môi trường vùng rễ (Elmerich và New, 2007). Chuyên ngành Vi sinh vật học 23 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.3.5.1 Khả năng cố định đạm của vi khuẩn nội sinh a. Vai trò của vi khuẩn trong chu trình nitơ Nitơ là nguyên tố dinh dưỡng rất quan trọng đối với sinh vật bậc cao và cả vi sinh vật. Trong không khí nitơ chiếm khoảng 78,16% thể tích của không khí, với số lượng lớn như vậy nhưng cây trồng không thể đồng hóa được. Tuy nhiên, nhờ có hệ vi sinh vật nên cây trồng có thể hấp thu nitơ ở dạng này. Vì vậy, chu trình nitơ là một trong các quá trình hóa học quan trọng nhất trong đất, gồm các quá trình cơ bản sau: - Quá trình amon hóa: Quá trình phân hủy chuyển hóa các hợp chất hữu cơ dưới tác dụng của vi sinh vật để hình thành các hợp chất hữu cơ giản đơn là NH4+ hoặc NH3 được gọi là quá trình amon hóa. - Quá trình nitrate hóa: NH4+ được hình thành từ quá trình amon hóa hoặc NH4+ có ở các loại phân hóa học sẽ được tiếp tục chuyển hóa thành nitrite (NO 2-) và sau đó thành nitrate (NO3-) dưới tác dụng hệ vi khuẩn nitrite (Nitrosomonas, Nitrocystis, Nitrosobobus, Nitrosopira) và vi khuẩn nitrate hóa (Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus). NH4+ + 3/2 O2 → NO2- + H2O + 2H + năng lượng NO2- + ½ O2 → NO3- + năng lượng - Quá trình phản nitrate hóa: Trong điều kiện có rất ít hoặc không có oxy, các dạng nitơ hợp chất (NO3- , NO2- ) bị chuyển hóa thành nitơ phân tử dưới tác dụng vi khuẩn khử nitrate (Pseudomonas denitrificans, Ps.acruginosa, Ps.stutzeri,…) (Nguyễn Như Thanh, 2004). b. Cấu tạo enzyme nitrogenase và cơ chế cố định nitơ Những tổn thất về nitơ do quá trình phản nitrate hóa gây nên, được bù đắp lại nhờ một quá trình sinh học đặc biệt được gọi là quá trình cố định nitơ. Nhóm vi sinh vật có khả năng thực hiện quá trình này được gọi là các vi sinh vật cố định nitơ, chúng có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử trong không khí thành các hợp chất chứa nitơ và làm giàu thêm nguồn dự trữ thức ăn chứa nitơ trong đất (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007). Nitrogenase là một phức hợp gồm hai thành phần là protein: Protein nhỏ chứa sắt (Fe Pro), protein lớn chứa Fe và Mo (MoFe - Pro) (Trần Cẩm Vân, 2004). Chuyên ngành Vi sinh vật học 24 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT - MoFe - Pro (thành phần I), gồm có bốn đơn vị phụ với khối lượng phân tử tổng cộng khoảng 180.000 - 235.000 Da. Có hai nguyên tử Mo cho mỗi phân tử trong hai cụm Mo - Fe - S và có một cụm Fe - S thay đổi. - Fe - Pro (thành phần thứ II), gồm hai tiểu phần đồng nhất có khối lượng phân tử khoảng 30.000 - 70.000 Da. Nó chứa một cụm sắt - sulfure (4Fe - 4S) tham gia các phản ứng oxy hóa khử bao hàm sự biến đổi nitơ sang NH3. Cả thành phần I và II đều mẫn cảm với oxy. Vì vậy việc chiết xuất và phân tích Nitrogenase đều phải tiến hành trong điều kiện kỵ khí (Nguyễn Như Thành, 1990). Phản ứng cố định đạm sinh học xảy ra được ở một số vi sinh vật là nhờ sự xúc tác riêng biệt enzyme nitrogenase. Enzyme nitrogenase xúc tác biến đổi đạm ở thể khí (N2) thành NH3. Đầu tiên, các loài vi khuẩn cố định đạm phá vỡ dần liên kết cộng hóa trị bậc III của nitơ (dạng rất bền) bằng cách gắn thêm dần dần những proton [H+] vào chúng (David et al., 2003). Phản ứng khử nitơ dưới tác dụng của enzyme nitrogenase có thể biểu thị qua phương trình. N2 + 8e- + 8H+ + 16ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP +16P Phương trình khử này gồm nhiều phương trình phản ứng kế tiếp nhau: 2[H+] N2 2[H+] HN=NH ATP ATP 2[H+] H2N-NH2 ATP 2NH3 NH3 sẽ kết hợp với acid hữu cơ tạo thành protein NH3 + acid hữu cơ → amino acid → protein 2.3.5.2 Khả năng hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh Lân là nguyên tố dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng, là thành phần cấu trúc nên các phân tử đa lượng, hiện diện nhiều trong các bộ phận non của cây và trong hạt giống. Phân lân giúp cây phân chia tế bào nhanh hơn, cung cấp nguồn năng lượng cho cây sử dụng. Rất cần thiết ở giai đoạn đầu, lân giúp bộ rễ phát triển mạnh, cây đâm cành mạnh, mau ra hoa, dễ đậu trái. Lân còn giúp cải thiện phẩm chất trái làm cho thịt trái chắc hơn. Thiếu lân bộ rễ của cây sẽ kém phát triển, tốc độ sinh trưởng của cây giảm, cây cho nhánh ít, lá mỏng, năng suất trái giảm. Cây trồng Chuyên ngành Vi sinh vật học 25 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT chỉ có thể sử dụng được lân từ đất dưới dạng hòa tan trong dung dịch đất. Vì vậy, cây trồng chỉ có thể hút được lân ở dạng dễ tiêu trong đất. Hầu hết đất nông nghiệp chứa lượng lớn lân, một phần đáng kể trong đó được tích tụ là kết quả của việc bón phân lân thường xuyên. Tuy nhiên, một lượng lớn phosphate vô cơ hòa tan cung cấp cho đất dưới dạng phân bón hóa học thì nhanh chóng bị cố định và trở thành dạng khó sử dụng đối với cây. Nhiều loài vi khuẩn có khả năng chuyển hóa dạng lân khó tan trong đất như calcium monohydrogen phosphate (CaHPO4)2, calcium monohydrogen dihydrate phosphate (CaHPO4.2H2O), calcium orthophosphate (Ca3(PO4)2) thành dạng lân dễ tan để cây trồng sử dụng. Đặng Thị Huỳnh Mai và Cao Ngọc Điệp (2002) đã phân lập được vi khuẩn và nấm có khả năng chuyển hóa lân dạng khó tan trong các loại đất ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Kucey et al. (1989), Rasid et al. (2004) giải thích sự hòa tan lân dạng khó tan trong đất là do sự bài tiết các acid hữu cơ và xác định tác nhân này làm giảm pH đất, điều này rất quan trọng trong cơ chế hòa tan lân dạng khó tan trong đất. Sự có mặt của các acid hữu cơ như: acid lactic, acid citric, acid gluconic, acid succinic, acid fumaric, acid acetic, acid oxalic…trong đất cao cũng là nguyên nhân làm giảm pH đất. Sự khoáng hóa của những hợp chất này được thực hiện bới hoạt động của nhiều phosphatase (còn được gọi là phosphohydrolase). Những phản ứng khử phosphoryl này liên quan đến sự thủy phân cầu nối phosphoanhydride. Phosphohydrolase acid, không giống phosphatase kiềm, hoạt động xúc tác tối ưu ở giá trị pH từ acid đến trung tính. Hơn thế nữa, chúng còn được phân nhóm thành phosphatase acid đặc hiệu hoặc không đặc hiệu, liên quan đến tính đặc hiệu cơ chất của chúng. Phosphohydrolase đặc hiệu với những hoạt tính khác nhau bao gồm 3’- nucleotidase, 5’- nucleotidase, hexose phosphate và phytase. Một nhóm đặc hiệu của enzyme giải phóng P có thể cắt cầu nối C-P từ phosphonate hữu cơ (Rossosilini et al., 1998). 2.3.5.3 Khả năng tổng hợp indole - 3 - acetic acid (IAA) của vi khuẩn nội sinh. Indole -3- acetic acid (IAA) hay còn gọi là auxin, là chất điều hòa chủ yếu của sự sinh trưởng thực vật. IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, phân hóa sinh mô, phát triển trái và hạt, chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng. Chuyên ngành Vi sinh vật học 26 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật như việc cố định đạm VKNS. Ngoài ra, vi khuẩn còn sản sinh tổng hợp auxin, cytokinin tác động đến quá trình tổng hợp ethylene của cây, có vai trò trung tâm trong sự tăng trưởng thực vật, chất điều hòa quá trình sinh học từ phân chia tế bào, kéo dài, phân hóa sinh mô, phát triển trái và hạt. Nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng tổng hợp IAA (Glick, 1995). IAA kích thích mạnh mẽ quá trình tăng trưởng và các hoạt động sinh lý trong cây, đặc trưng nhất là quá trình sinh trưởng của cây thông qua sự tăng trưởng của các loại tế bào. Tác động của auxin phụ thuộc vào dạng tế bào, ở các nồng độ khác nhau như IAA kích thích đồng thời sự giãn dài trục lá mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự khởi đầu của rễ bên và thành lập lông rễ (Theologis và Ray, 1982; Gray et al., 2001). Trong tự nhiên, IAA có hai dạng: IAA liên kết (CH2-COO-R) và IAA tự do (RCH2COOH). Chỉ có IAA tự do điều khiển các hoạt động sinh lý của thực vật, đặc trưng là sự tăng trưởng của cây qua sự tăng trưởng của tế bào (Suzuki et al., 2003). Xét cơ chế tổng hợp IAA của vi khuẩn Pseudomonas cho thấy L-Tryptophan đóng vai trò quan trọng, được xem là tiền chất trong lộ trình tổng hợp IAA của các thực vật lẫn vi sinh vật. Có 3 lộ trình tiêu biểu nhất cho sự biến đổi của L- tryptophan thành IAA đã được Koga et al., (1991) mô tả chi tiết như sau:  Lộ trình indole -3- pyruvic acid Tryptophan  indole -3- pyruvic acid  indole -3- acetaldehyde  IAA  Lộ trình tryptamine Tryptophan  tryptamine  indole -3- acetaldehyde  IAA  Lộ trình indole -3- acetamide Tryptophan  indole -3- acetamine  IAA 2.3.5.4 Khả năng đối kháng sinh học của vi khuẩn nội sinh với một số vi sinh vật gây bệnh a. Khả năng đối kháng sinh học (biocontrol) Vi khuẩn nội sinh có thể có khả năng làm yếu đi hay ngăn cản tác hại của các vi sinh vật gây hại. Một trong những sự đóng góp của vi khuẩn nội sinh từ thực vật là một vài vi khuẩn nội sinh từ những thực vật khác nhau đã cho thấy hoạt tính sinh học tiềm năng như hoạt động kháng khuẩn (Ravikumar et al., 2010), kháng nấm (Cho et Chuyên ngành Vi sinh vật học 27 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT al., 2007) và chống ung thư (Taechowisan et al., 2007). Một Vi khuẩn nội sinh tổng hợp các chất hóa học có trong thực vật, nhiều loài có khả năng tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật để bảo vệ chống lại các tác nhân gây bệnh và một số các hợp chất này đã được chứng minh bằng việc khám phá ra các loại thuốc kháng sinh hữu ích. Sự đa dạng của các hợp chất được tạo ra bởi các vi khuẩn nội sinh đã được chứng minh để chống lại tác nhân gây bệnh và thậm chí cả bệnh ung thư ở động vật bao gồm cả con người. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh vai trò của vi khuẩn nội sinh trong việc ngăn chặn sự tác hại của nấm Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum trên bông vải (Chen et el., 1995); nấm Fusarium oxysporum f. sp. pisi trên đậu pea (Benhamou et al., 1996), Verticillium albo-atrum và Rhizoctonia solani trên khoai tây (Nowak et al., 1995), Rhizoctonia solani trên khoai tây (Pleban et al., 1995) và lúa (Krishnamurthy và Gnanamanickam, 1997)…Một nghiên cứu gần đây của Swetha Sunkar et al. (2013), một loại vi khuẩn nội sinh đã được xác định là vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa được phân lập từ có khả năng chống lại một số vi khuẩn gây bệnh như Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Salmonella typhi. Nhiều giống VKNS như Pseudomonas, Burkholderia và Bacillus (Lodewyckx et al., 2002) được biết là những loài trong những giống vi khuẩn tổng hợp ra nhiều sản phẩm thứ cấp bao gồm các kháng sinh, chất kháng ung thư, hợp chất hữu cơ thơm, kháng nấm, kháng virus, kháng sâu... và những sản phẩm thứ cấp này được trích ly từ sự lên men của những loài vi khuẩn này (Ryan et al., 2008). b. Một số vi khuẩn gây bệnh phổ biến * Escheriachia coli (E. coli) Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) thuộc họ Enterobacteriaceae, họ vi khuẩn thường trực ở trong ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh ở đường ruột và ở các cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997). Theo Nguyễn Như Thanh et al. (1997), E. coli là một trực khuẩn ngắn 2 đầu tròn, kích thước 2 - 3 µm. Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Trong môi trường nuôi cấy, có khi quan sát thấy những trực khuẩn dài 4 - 8 µm. Phần lớn vi khuẩn E. coli có khả năng di động do có tiên mao ở xung quanh thân, nhưng cũng có một số chủng không có khả năng di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô. Chuyên ngành Vi sinh vật học 28 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Trong điều kiện bình thường E. coli khu trú thường xuyên ở phần sau của ruột, ít khi có ở dạ dày hay đoạn đầu ruột non của động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát triển nhanh về số lượng, độc lực, gây loạn khuẩn, bội nhiễm đường tiêu hóa và trở thành nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978). Hình 5: Vi khuẩn Escherichia coli (*Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/File:EscherichiaColi_NIAID.jpg, ngày 17/11/2013) *Aeromonas hydrophila Trước đây, Aeromonas thuộc họ Vibrionaceae do chúng có một vài đặc điểm tương tự Vibrio. Nhưng đến giữa thập niên 80 Aeromonas được tách ra một họ riêng là Aeromonadaceae (Honerman và Moris, 2007), bởi có các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa khác biệt như không mẫn cảm với phản ứng O/129 (150µg) ngoại trừ A. caviae (Trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008). Theo Barrow và Feltham (1993), Aeromonas chia thành 2 nhóm dựa trên khả năng di động và ngưỡng nhiệt độ phát triển của chúng. Nhóm thứ nhất gồm: A. hydrophila, A. sobria và A. caviae có các đặc điểm là có khả năng di động, hai đầu hơi tròn, Gram âm, hình que ngắn, hiếu khí không bắt buộc, phát triển được ở 37oC… nhóm thứ hai là A. salmonicida (có ba loài phụ gồm: A. salmonicada, A. achromogenes và A. nova) có đặc điểm tương tự nhưng chúng chỉ phát triển tốt nhất ở 22oC hoặc thấp hơn và không có tiêm mao cũng như chúng không có khả năng di động (Trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008). Shotts và Rimler (1973), Aeromonas hydrophila có những đặc trưng sau: Gram âm, que thẳng, kích thước khoảng 0,5x1,4 - 4,0 µm, có roi ở 2 cực cơ thể, kỵ khí, lên men carbonate hình thành acid hoặc khí gas, oxydase dương tính, khử nitrate. Chuyên ngành Vi sinh vật học 29 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Aeromonas hydrophila khi phát triển trên môi trường đặc trưng SA sẽ cho các khuẩn lạc có dạng tròn, hơi lồi, nhẵn và có màu vàng nhạt (Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005). B. Austin và D. Austin (1986), cho rằng A. hydrophila là nguyên nhân của một vài tình trạng bệnh khác nhau như thối vây, bệnh đốm đỏ và thường liên kết với mầm bệnh khác như A. salmonicida. Theo Lewis và Plumb (1979) cho rằng trong các chủng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophila được xem là chủng gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất, gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết ở những loài cá nuôi và cá tự nhiên, theo Angka (1990), A. hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java-Indonesia và gây tỷ lệ chết từ 80-90%. Bên cạnh đó, trong báo cáo của Saitanu et al. (1982) đã tìm thấy vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết do bệnh nhiễm trùng máu trên cá chép. Hình 6: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (*Nguồn:http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%ADptin:Aeromonas_hydrophila.jpg, ngày 17/11/2013) 2.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật cố định đạm trên thế giới và trong nước 2.4.1 Trên thế giới Hiện nay người ta đã tìm được nhiều giống VKNS như: Azoarcus, Enterobacter, Agrobacterium, Pseudomonas, Clavibacter, Bacillus, Brudyrhizobium, Azospirillum, Cellulomonas, Pantoea, Klebsiella, Gluconacetobacter, Burkholderia, Corynebacterium, Rhizobium, Herbaspirillum… ở các cây lương thực, cây hoa màu, cây họ đậu và cây cỏ… Berg et al. (1980) nghiên cứu đặc tính sinh học của Azospirillum cộng sinh ở cây mía giúp tăng cường hoạt tính của enzyme nitrogenase từ đó làm tăng tỉ lệ tổng hợp đạm của cây. Chuyên ngành Vi sinh vật học 30 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Ở Thụy Điển, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy ở vùng rễ của các loài ngũ cốc và cỏ chăn nuôi các vi khuẩn Enterobacter và Bacillus (Lindberg và Granhall, 1984). Ở Nhật, các nhà nghiên cứu đã xác định được các VKNS Herbaspirillum có khả năng cố định đạm ở các loài lúa hoang (Elbelatagy et al., 2001). Người ta cũng đã tiến hành thí nghiệm chủng vi khuẩn Herbaspirillum seropedicae và giống Burkholderia vào cây lúa, kết quả các vi khuẩn có thể cố định đạm khoảng 19% tổng số đạm cần thiết cho cây (Verma et al., 2001). Ở Mỹ, mất hơn 6 năm nghiên cứu ở 4 loại cây trồng (bắp, lúa miến, đậu tương và lúa mì) và 27 loại cỏ tự nhiên khác nhau người ta đã xác định được 15 giống VKNS: Agrobacterium, Bacillus, Bradyrhizobium, Erwinia, Cellulomonas, Clavibacter, Corynebacterium, Enterobacterium, Escherichia, Klebsiella, Microbacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Rothia và Xanthomonas (Zinniel et al., 2002). Trong đó số vi khuẩn Gram dương xấp xỉ bằng số vi khuẩn Gram âm. Ở Ấn Độ, khi nghiên cứu ở 4 loài lúa trồng khác nhau người ta đã xác định được VKNS Gluconacetobacter diazotrophicus có khả năng cố định đạm nhờ vào gen nif (Muthukumarasamy et al., 2002). Trong những năm gần đây, do sự đa dạng rất lớn và tiềm năng chưa được khai thác của VKNS, chúng xuất hiện như một nguồn thay thế các sản phẩm có hoạt tính sinh học tự nhiên với các ứng dụng tiềm năng trong ngành công nghiệp dược phẩm. Do đó, VKNS đã gây sự chú ý trong ngành công nghiệp dược phẩm. Hiện nay trên thế giới đang tập trung nghiên cứu ra các chủng VKNS từ cây thảo dược có khả năng kháng sinh nhằm phục vụ cho ngành dược. Hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất từ rễ, thân, lá cây cúc mui (Tridax procumbens) đã được nghiên cứu chống lại vi khuẩn Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Proteus vulgaris (Gram âm), Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus (Gram dương) theo nghiên cứu của Aniel Kumar O. và L. Mutyala Naidu (2011). Chu-long Zhang et al. (2009) đã phân lập được chủng VKNS từ cây thảo dược dâm dương hoắc (Epimedium brevicornu Maxim) có khả năng ức chế mạnh các loài Alternaria alternata, Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium dahliae, Botrytis cinerea và Botrytis fabae, và sau khi phân tích trình tự gen 16S và thử nghiệm các đặc tính vật lý và hóa học đã xác định được chủng Phyllobacterium. Sudipta Roy và Debdulal Banerjee (2010) đã phân lập được các chủng VKNS từ cây dược liệu dừa cạn (Vinca Chuyên ngành Vi sinh vật học 31 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT rosea) có khả năng tạo kháng sinh và sau khi thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn với các vi khuẩn gây bệnh như Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Vibrio cholerae, Escherichiae coli và Candida albicans, kết quả cho thấy chủng Vrb 46 (được cho là tương tự như chủng Bacillus coagulans) có khả năng đối kháng với tất cả các loài vi khuẩn gây bệnh trên. Bacillus polymyxa nội sinh trên cây Arabidopsis thaliana có khả năng tổng hợp kháng sinh polymyxin kháng lại cả nấm và vi khuẩn (Salme Ticmusk et al., 2005). Theo nghiên cứu của Artidtaya et al. (2012) trên cây Phyllodium pulchellum, vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sống nội sinh có khả năng diệt E.coli, Pseudomonas aeruginosa. Theo nghiên cứu của Sheng Qin et al. (2009) đã phân lập được một số dòng VKNS như: Streptomyces Specialis trong rễ cây Sedum sp, Pseudomonas alni trong lá cây Hoa môi (Callicarpa longifolia) cũng có khả năng kháng khuẩn. 2.4.2 Trong nước Ở nước ta, việc nghiên cứu các VKNS có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp kích thích tố IAA ở các cây nông nghiệp đã được tiến hành khá nhiều trong những năm gần đây. Tại Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học - Đại học Cần Thơ, Nguyễn Hữu Hiệp et al. (2005) đã phân lập và nhận diện các dòng Azospirillum bằng kỹ thuật PCR từ rễ và thân lúa hoang, lúa trồng và một số loại cỏ ở ruộng lúa; Cao Ngọc Điệp (2005) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn nốt rễ (Sinorhizobium fredii) và vi khuẩn Pseudomonas spp. trên cây đậu nành đã làm gia tăng số trái và giảm số trái lép trên cây. Gần đây, Nguyễn Hữu Hiệp et al. (2008) phân lập được một số dòng vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus nội sinh ở rễ, thân và lá của các giống mía trồng tại huyện Cù Lao Dung và huyện Mỹ Tú, Tỉnh Sóc Trăng. Đến nay, Việt nam đã có nhiều công trình nghiên cứu cây dược liệu nhưng phần lớn các nghiên cứu này chỉ tập trung khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cây dược liệu thông qua các nghiên cứu điều trị lâm sàng. Tuy nhiên, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật nội sinh hoặc sống ở vùng rễ cây dược liệu có khả kích thích cây phát tiển tốt thông qua khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp hormone tăng trưởng kích thích cây dược liệu phát triển, góp phần giảm các loại bệnh, giảm chi phí sản xuất và đặc biệt là khả năng tổng hợp các hoạt chất kháng khuẩn của chúng khi sống nội sinh Chuyên ngành Vi sinh vật học 32 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT với cây chưa được quan tâm nhiều. Vì vậy, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật hữu ích này để phát triển cây dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả hơn, nhằm thay thế các loại kháng sinh tổng hợp giúp giảm tỷ lệ kháng thuốc ở một số mầm bệnh nguy hiểm sẽ mang nhiều ý nghĩa quan trọng trong giai đoạn hiện nay. Chuyên ngành Vi sinh vật học 33 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu 3.1.1 Thời gian nghiên cứu - Từ tháng 06 đến tháng 07 năm 2013 tìm tài liệu và viết đề cương luận văn. - Từ tháng 08 đến tháng 11 năm 2013 chuẩn bị vật liệu, vật dụng và thực hiện đề tài. - Cuối tháng 11 đến đầu tháng 12 năm 2013 hoàn thành và báo cáo luận văn tốt nghiệp. 3.1.2 Địa điểm thực hiện - Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, phòng Sinh hóa, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ. 3.1.3 Vật liệu thí nghiệm - Mẫu cây cúc mui (Tridax procumbens) gồm toàn bộ rễ, thân, lá và đất mọc hoang ở khuôn viên trường Đại học Cần Thơ. 3.1.4 Dụng cụ và thiết bị Sử dụng dụng cụ và thiết bị của phòng thí nghiệm Vi sinh vật có tại Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ: - Micropipet - Đĩa petri, ống nghiệm - Ống trữ mẫu - Ống đong 10ml, 100ml - Cốc thủy tinh 10ml, 100ml, 200ml - Kẹp, kim cấy, que trải mẫu, đèn cồn - Lame, Lacmelle - Máy Vortex - Tủ cấy vi sinh vật Airstream Biosafe II - ESCO (Pháp) - Tủ ủ vi sinh vật Binder (Đức) - Kính hiển vi Olympus CH - 2 (Nhật) - Máy lắc mẫu Chuyên ngành Vi sinh vật học 34 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT - Máy PCR - Bộ điện di - Cân điện tử. - Nồi khử trùng nhiệt ướt - Máy ly tâm - Sổ tay ghi chép số và một số dụng cụ cần thiết khác. 3.1.5 Hóa chất - Hóa chất dùng khử mẫu: nước cất vô trùng, cồn 70o, dung dịch H2O2 3%. - Môi trường agar PDA. - Hóa chất dùng nhuộm Gram vi khuẩn: Iod, Fushin, Crystal violet, cồn 70o, nước cất vô trùng. - Hóa chất để đo IAA: FeCl3, H2SO4, K2HPO4, KH2PO4, IAA thương mại. - Hóa chất để đo lượng đạm vi khuẩn cố định được: KCl 2M, (NH4)2SO4, phenol nitroprusside, sodium hypochloride. - Hóa chất dùng để trích DNA vi khuẩn đã phân lập: TE pH (8), SDS 10%, isopropanol, ethanol (cồn) 70%, CTAB 10%/NaCl 0,7M, Proteinase K (20 mg/ml), nước cất hai lần vô trùng, Chloroform: isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1). Dung dịch TE gồm các thành phần sau: 1% Triton X - 100, 1M Tris HCl - 8,5, 0,5 M EDTA - 8,0, nước cất vô trùng. - Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng PCR nhận diện vi khuẩn đã phân lập : PCR buffer, Taq polymerase, DNA vi khuẩn đã phân lập, nước cất hai lần vô trùng, dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng điện di gel chứa sản phẩm phản ứng PCR: Agarose 1,2%, TBE buffer 1X, loading buffer, thang chuẩn PstI, ethidium bromide (EtBr). 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui * Thu mẫu: mẫu cây cúc mui gồm rễ, thân, lá được lấy từ thành phố Cần Thơ. Trước khi thực hiện đề tài cần lấy mẫu đất đem về phòng thí nghiệm Vi sinh vật để đo độ pH đất. Chuyên ngành Vi sinh vật học 35 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT * Khử trùng bề mặt và phân lập mẫu: - Rửa thật sạch bùn đất bám ở rễ, thân, lá dưới vòi nước chảy mạnh, để ráo tự nhiên. Dùng kéo cắt rời rễ, thân, lá thành để riêng từng bộ phận trong bọc nylon sạch, buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh (- 5oC) nếu chưa phân lập ngay. - Khử trùng nước cất, bình tam giác (để đựng mẫu khử), eppendorf, đầu col xanh, col vàng, môi trường PDA, cối, chày. Việc khử trùng mẫu được thực hiện trong điều kiện vô trùng. - Cắt các bộ phận thành những khúc nhỏ 2 - 3cm (để riêng từng bộ phận). Sau đó cho từng bộ phận mẫu vào các cốc thủy tinh riêng biệt để tiến hành khử trùng bề mặt mẫu: cho ethanol 70o vào cốc cho vừa ngập mẫu, lắc nhẹ (để mẫu không bị dập) khoảng 30 giây, rửa sạch bằng nước cất, tiếp tục cho dung dịch H2O2 3% vào cốc và ngâm trong khoảng từ 3 - 5 phút, sau đó rửa thật sạch bằng nước cất vô trùng (4 lần) để tẩy rửa hóa chất còn thừa. - Hút 50µl nước rửa mẫu lần cuối cùng trải trên môi trường PDA đặc (Bảng 1) và ủ ở 30oC. Sau 2-3 ngày kiểm tra xem có vi sinh vật nào phát triển không. Nếu không có vi sinh vật nào phát triển, chứng tỏ mẫu đã được khử trùng bề mặt sạch và những vi khuẩn phân lập được sau này là VKNS trong cây. - Gắp khoảng 2g mẫu rễ (hoặc thân, hoặc lá) cho vào cối vô trùng giã nhuyễn rồi thêm 0,5 - 2ml nước cất vô trùng vào cối, để yên 10 phút, trộn và hút lấy phần dịch trích cho vào tube eppendorf 1,5 ml, để yên 10 phút cho dịch mẫu lắng xuống và hút 100µl phần trong cho vào 900µl nước cất ; có nghĩa là đã pha loãng 10 lần, tiến hành pha loãng 100, 10-1,10-2. Sau đó, hút 100µl dịch mẫu đã pha loãng cho vào môi trường Nfb bán đặc (Bảng 2) trong ống nghiệm, đậy nắp lại cho vào tủ ủ, ủ ở 30oC. Sau 2 - 4 ngày, ta thấy xuất hiện vòng màu sáng (vòng pellicle), cách bề mặt môi trường 2 - 5cm (Tran Van Van et al., 1997), đó là chứng tỏ có sự hiện diện của VKNS. - Chuyển vi khuẩn từ môi trường bán đặc sang môi trường đặc: hút 50 µl từ lớp màng mỏng để lấy vi khuẩn trải lên bề mặt đĩa chứa môi trường PDA đặc, trải đều và đậy nắp lại cho vào tủ ủ, ủ ở 30oC. Sau 2 - 3 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, nhỏ, tròn và phải nằm trên đường cấy cấy chuyển sang những đĩa khác cho tới khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng, chuyển mẫu đã ròng vào ống nghiệm chứa môi trường đặc trữ ở - 5oC và được xem là một dòng vi khuẩn. Chuyên ngành Vi sinh vật học 36 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 1. Thành phần môi trường PDA Hóa chất Liều lượng (g/l) Khoai tây 200 Dextrose 20 Nước cất 1000 ml Kháng sinh 1 ml 5,6  0,2 pH (*Ghi chú: Môi trường đặc thêm 20g agar/ l môi trường; môi trường bán đặc thêm 2g agar/ l môi trường). Bảng 2. Thành phần môi trường Nfb (Kireg và Dobereiner, 1984) Hóa chất Liều lượng (g/l) Malic acid 5 K2HPO4 5 MgSO4.7H2 0,2 CaCl2 0,02 NaCl 0,1 KOH 4,5 FeEDTA (1,64%) Dung dịch nguyên tố vi lượng 4 ml/l (a) 2 ml/l Dung dịch vitamin (b) 1 ml/l Bromothymol blue 0,5% trong KOH 0,2N 2 ml/l pH 5,5 (*Ghi chú: Môi trường đặc thêm 20g agar/ l môi trường; môi trường bán đặc thêm 2g agar/ l môi trường). 3.2.2 Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn. 3.2.2.1 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập ta đồng thời tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Tuy nhiên, đối với những khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát. Chuyên ngành Vi sinh vật học 37 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 3.2.2.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002). Quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học: nhỏ 20µl nước cất vô trùng lên kính mang vật, dùng kim cấy đã được hơ nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội lấy một ít mẫu vi khuẩn từ khuẩn lạc trải đều lên giọt nước, đậy kính đậy vật lại và quan sát ở độ phóng đại 400 lần, ghi nhận sự chuyển động của vi khuẩn (nếu có), quan sát và ghi nhận hình dạng. 3.2.2.3 Nhuộm Gram Khi mẫu đã ròng, nhuộm Gram mẫu theo các bước sau: - Lấy 10 µl nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật. - Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật. - Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật. - Nhỏ từ một đến hai giọt Crytal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều Crystal violet bằng que cấy và để 2 phút. - Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước. - Nhỏ từ 1 - 2 giọt dung dịch Iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong một phút. - Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô. - Rửa lại bằng cồn 70o thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sao cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa. - Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô. - Nhỏ từ 1 - 2 giọt Fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để 1 phút. - Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của Fushin. - Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước. - Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là mẫu Chuyên ngành Vi sinh vật học 38 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Gram dương, có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm và tiến hành đo kích thước tế bào vi khuẩn. 3.2.2.4 Đo kích thước vi khuẩn Phương pháp đo kích thước vi khuẩn: đặt thước trắc vi vật kính (miếng kính đặc biệt dài 2 cm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng 10 µm) vào bàn kính, chỉnh cho thấy rõ ảnh của thước. Dịch chuyển thước trắc vi vật kính và thước trắc vi thị kính (miếng kính tròn có khắc 100 vạch đặt giữa hai thấu kính của thị kính) sao cho 2 thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho 1 vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và một vạch thứ 2 nào đó của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch khác của thước trắc vi thị kính. Đếm số khoảng của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính. Trị số mỗi khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thức sau: x= 10µm*N/n. Trong đó: N là số khoảng của thước trắc vi vật kính, N= 6 n là số khoảng của thước trắc vi thị kính, n= 35 x là trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính. Ta có: x = 1,7143 µm. Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh để thấy rõ ảnh của vi mẫu. Di chuyển mẫu vật để một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, tìm vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo. Đếm số khoảng thước trắc vi nằm trong khoảng giữa 2 vạch này. Suy ra kích thước vi mẫu bằng trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính nhân với số khoảng đếm được. 3.2.3 Khảo sát khả năng cố định đạm của một số dòng vi khuẩn đã phân lập. Nguyên tắc: xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng giữa phenol và NH3 với sự hiện diện của tác nhân oxy hoá là hypochlorite hình thành phức có màu xanh, dưới pH kiềm. Sự hiện diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3 phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982). Hóa chất: - Chuẩn bị dung dịch KCl 2M :Hòa tan 15g KCl trong 100ml nước cất. - Stock (NH4+): hoà tan 0,4717g (NH4)2S04 vào 1lít nước. Trữ dung dịch ở tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 40ml stock NH4+ để được 200ml, sau cùng được dung dịch chứa 2µg/ml. Chuyên ngành Vi sinh vật học 39 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT - Thuốc thử phenol nitroprusside: Hoà tan 5g phenol và 0.025g nitroprusside trong nước được 0,5 l. - Hypocloride buffer: Hoà tan 15ml NaOCl +5g NaOH vào nước được 0,5 l. - Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường Nfb lỏng (không N). Cho 15 ml môi trường NFb vào các ống nghiệm nắp đen khử trùng nhiệt ướt 120oC trong 20 phút. Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại 3 lần. Nuôi các dòng trên máy lắc 200 vòng/phút. Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 0, 2, 4, 6 (sau khi chủng). Phương pháp định lượng: Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hoà tan và nửa lít nước cất. Pha buffer: Cho 15ml NaOCl có nồng độ thường (5 - 5,25%) và 5g NaOH vào 0,5 lit nước cất. Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm. Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 5ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 0 ml NH4+ Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 4ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 1 ml NH4+ Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 3ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 2 ml NH4+ Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 2ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 3 ml NH4+ Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 1ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 4ml NH4+ Đường chuẩn 5 ppm gồm có: 0ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 5 ml NH4+ Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn: - Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào các eppendorf. - Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút 1 ml dịch vi khuẩn đã ly tâm và 4ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử. Tiến hành đo phổ OD. Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+, đo phổ OD ở bước sóng 636nm, sau đó vẽ trên đồ thị Excel có thể tính ra được nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn. Các số liệu thu thập được được xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphics plus 4.0. Chuyên ngành Vi sinh vật học 40 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hình 7: Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ NH4+ (*Ghi chú: Từ trái qua phải của hình là 0, 1, 2, 3, 4 và 5 ppm). 3.2.4 Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn đã phân lập. Dùng micropipette hút lần lượt 5µl dd VKNS từ mỗi ống nghiệm môi trường tăng sinh PDA lỏng có bổ sung yeast extract 1% nhỏ lên đĩa môi trường chứa lân khó tan (NBRIP) đặc (Bảng 3), mỗi đĩa 1 dòng, 3 lần lặp lại. Sau đó ủ ở 30oC, theo dõi sự phát triển của chúng từ 1 - 2 ngày, dòng nào phát triển được trên môi trường NBRIP thì có khả năng hòa tan lân khó tan. Quan sát và đo đường kính vòng halo, khuẩn lạc mỗi ngày.  Độ hữu hiệu của các dòng vi khuẩn hòa tan lân khó tan Hiệu quả hòa tan lân E được tính theo công thức: Đường kính halo E= x 100 (C. NGUYEN và ctv, 1992) Đường kính khuẩn lạc Chuyên ngành Vi sinh vật học 41 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 3. Công thức môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999) Hóa chất Liều lượng (g/l) Glucose 10 Ca3(PO4)2 5 MgCl2.6H2O 5 MgSO4.7H2O 0,25 KCl 0,2 Bromo 3 ml (NH4)2SO4 0,1 pH 7,0 (*Ghi chú: Môi trường đặc thêm 20g agar/ l môi trường; môi trường bán đặc thêm 2g agar/ l môi trường). 3.2.5 Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn đã phân lập được. - Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb lỏng (không Tryptophan). - Cho 15 ml môi trường NFb vào các ống nghiệm nắp đen khử trùng nhiệt ước 121o C trong 20 phút. - Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại 3 lần. - Nuôi các dòng trên máy lắc 200 vòng/phút, trùm kín các ống nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA sinh ra bị phân hủy bởi ánh sáng. Định lượng IAA trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng). - Chuẩn bị thuốc thử Salkowski R2: 4,5 g FeCl3 trong 1lít H2SO4 10,8 M. - Chuẩn bị phosphat buffer 200ml: A: KH2PO4 0,136g/100ml nước cất B: K2HPO4 0,174g/100ml nước cất - Lấy 39 ml A, 61 ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, chỉnh pH 7. - Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm nắp đen cho vào eppendorf. Chuyên ngành Vi sinh vật học 42 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT - Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. - Hút cẩn thận 1ml phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào các ống Durham. - Thêm 2ml thuốc thử Salkowski R2 vào các ống Durham trên. - Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn sau đó đo quang phổ OD ở bước sóng 530 nm. - Chuẩn bị đường chuẩn IAA: cân 0,0016g IAA tổng hợp hòa tan với 10 ml phosphat buffer được nồng độ là 160 µg/l. Sau đó pha loãng ra các nồng độ 0; 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 80 µg/ml. Hình 8: Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ IAA (*Ghi chú: Từ trái qua phải của hình là 0, 2,5, 5, 10, 20, 30, 40 và 80 µg/ml) - Kết quả đo phổ OD được vẽ thành đồ thị đường chuẩn IAA trên excel với trục tung là phổ OD có giá trị từ 0 đến 3, trục hoành là nồng độ IAA có giá trị từ 0 đến 80 µg/ml. - Kết quả đo OD của các dòng phân lập được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ đó suy ra được nồng độ IAA đã được vi khuẩn tổng hợp. - Các số liệu thu thập được được xử lý bằng Excel và phần mềm thống kê Statgraphics plus 4.0. 3.2.6 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn - Chuẩn bị môi trường Luria Bertani (LB) agar (Bảng 4). - Trải vi khuẩn gây bệnh E.coli và Aeromonas hidrophylla lên bề mặt đĩa môi trường. Chuyên ngành Vi sinh vật học 43 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 - Trường ĐHCT Dùng giấy thấm đường kính 0,5 cm nhúng vào vi khuẩn nuôi đạt mật số 108 tế bào/ml trong vài phút và đặt giấy thấm lên bề mặt môi trường đã trải vi khuẩn E.coli. - Ủ 35oC - Quan sát khả năng tạo vòng kháng khuẩn sau 12 - 24 và 48 giờ. - Các số liệu thu thập được được xử lý bằng Excel và phần mềm thống kê Statgraphics plus 4.0.  Vòng vô khuẩn được xác định bằng cách: Vòng vô khuẩn (cm) = Đường kính vòng sáng - Đường kính khuẩn lạc Bảng 4. Thành phần môi trường LB agar Hóa chất Liều lượng (g/l) Bacto tryptone 10 Bacto yeast extract 5 NaCl 10 Cycloheximide (thuốc chống nấm) 0,01 Agar 20 pH 7 3.2.7 Nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh tiêu biểu Sau khi kiểm tra khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn đã phân lập được, chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA cao nhất để thực hiện phản ứng PCR với mồi 16S - rRNA và so sánh với dữ liệu trên ngân hàng gene NCBI để định danh vi khuẩn. Quy trình trích DNA nhanh theo phương pháp của (Barberio et al., 1998). Cấy vi khuẩn từ ống trữ ròng lên đĩa Petri chứa môi trường PDA. Ủ 1 - 2 ngày trong tủ ủ ở 30o C. Khi khuẩn lạc vi khuẩn hình thành, dùng que cấy chọn 1 - 2 khuẩn lạc rời và đều nhau cho vào tuýp Eppendorf có chứa 20 μl nước cất hai lần. Đun cách thủy các tuýp ở 95oC trong 10 phút. Sau đó làm lạnh các tuýp trong nước đá xay nhuyễn thời gian 10 phút để phá vỡ tế bào vi khuẩn. Chuyên ngành Vi sinh vật học 44 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Ly tâm nhẹ hai lần, thu được dịch trích DNA của vi khuẩn. Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm có ba bước: Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94oC - 95oC trong 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation). Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi (primers) bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn bắt cặp (annealing). Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation). Sau khi ly trích DNA từ các dòng VKNS trong cây cúc mui, phản ứng PCR gen 16S-rDNA (Lane, 1985) sử dụng đoạn mồi: 27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ 1492R 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’ Sau khi trích DNA các dòng vi khuẩn, sẽ tiến hành phản ứng PCR bằng máy PCR Bio-Rad DNA Engine. Chuyên ngành Vi sinh vật học 45 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 5. Thành phần các chất trong phản ứng PCR Thành phần Thể tích (μl) Nước cất hai lần 11,75 Buffer 10X 2,5 MgCl2 2,0 dNTP 4,0 DMSO 2,0 Primer F 0,25 Primer R 0,25 Taq 0,25 DNA vi khuẩn 2 Tổng thể tích 25 Bảng 6. Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen của vi khuẩn nội sinh Bước phản Tên Số lượng ứng bước chu kỳ 1 Biến tính 2 3 Nhiệt độ (oC) Thời gian 95 5 phút Biến tính 35 95 30 giây Gắn mồi 35 55 30 giây Kéo dài 35 72 1 phút 72 10 phút Kéo dài Chuẩn bị gel agarose 1% với thể tích 40 ml. Cân 0,4 g agarose cho vào chai nắp xanh. Đong 40 ml dung dịch TE 1X cho vào chai và lắc nhẹ cho agarose tan đều. Đặt chai vào lò vi sóng, đun khoảng 5 phút để cho agarose tan hoàn toàn và tạo thành dung dịch trong suốt. Lấy chai ra để nguội khoảng 55o - 60oC rồi bổ sung 0,8 μl Ethium bromide, lắc nhẹ đều. Rót dung dịch vào góc dưới của khuôn gel đã được chuẩn bị, tránh tạo bọt khí. Để khoảng 45 phút cho gel nguội và đặc lại rồi lấy lược ra khỏi khuôn. Chuyên ngành Vi sinh vật học 46 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hình 9: Gel trước khi chụp hình DNA Đặt khuôn gel vào bể điện di dung dịch TE buffer 1X cho ngập gel. Load các mẫu sản phẩm PCR vào mỗi giếng với thể tích 10 μl bao gồm 8 μl mẫu trộn với 2 μl loading buffer. Sau cùng, load 4 μl DNA thang chuẩn 100 bp vào giếng. Mở nguồn điện, cài đặt cho thiết bị ở 95 Vol trong 80 - 90 phút. Quan sát thấy chất chỉ thị màu xanh di chuyển gần cuối gel, tắt nguồn điện, lấy khuôn gel ra để chụp hình. Chụp hình gel đã điện di sản phẩm PCR. Sau khi điện di, chụp hình DNA bằng hệ thống máy Bio-Rad Universal Hood II (Mỹ). Nếu các dòng vi khuẩn có band ở vị trí trùng với kích thước và vị trí của đối chứng dương thì đó là dòng vi khuẩn cùng loài với đối chứng dương. Chọn 3 dòng triển vọng nhất để giải trình tự và định danh tại Công ty Macrogen, Korea. Chuyên ngành Vi sinh vật học 47 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Từ rễ, thân và lá của cây cúc mui mọc hoang ở khuôn viên trường Đại học Cần Thơ đã phân lập được 17 dòng vi khuẩn trên môi trường PDA (Độ pH đất = 5,5). Hầu hết các dòng vi khuẩn này đều phân bố ở cả rễ, thân và lá của cây cúc mui. Vi khuẩn phân lập được tập trung nhiều nhất ở lá là 7 dòng chiếm tỉ lệ 41,18%; kế đến ở rễ là 6 dòng chiếm tỉ lệ 35,29%; và ở thân là 4 dòng chiếm tỉ lệ 23,53%. Khi được chủng vào môi trường NFb bán đặc và ủ trong vòng 6 ngày, các dòng vi khuẩn tạo thành vòng pellicle màu trắng đục cách mặt môi trường khoảng 0,5cm (Hình 10), đồng thời chúng phát triển và làm thay đổi màu môi trường NFb ban đầu. Chứng tỏ các dòng vi khuẩn này đều có đặc tính là sinh trưởng và phát triển trong điểu kiện vi hiếu khí. Vòng pellicle (a) (b) Hình 10: Môi trường NFb bán đặc (a) và vòng pellicle xuất hiện sau khi chủng vi khuẩn (b) Các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA từ rễ, thân, lá của cây cúc mui được ký hiệu lần lượt gồm các chữ cái R, T, L kèm theo thứ tự các dòng (Bảng 7). Chuyên ngành Vi sinh vật học 48 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 7. Vị trí và địa điểm thu mẫu của các dòng vi khuẩn được phân lập từ cây cúc mui trên môi trường PDA STT Dòng vi khuẩn Vị trí phân lập Địa điểm thu mẫu 1 R1 Rễ Trường Đại học Cần Thơ 2 R2 Rễ Trường Đại học Cần Thơ 3 R5 Rễ Trường Đại học Cần Thơ 4 R6 Rễ Trường Đại học Cần Thơ 5 R7 Rễ Trường Đại học Cần Thơ 6 R8 Rễ Trường Đại học Cần Thơ 7 T1 Thân Trường Đại học Cần Thơ 8 T2 Thân Trường Đại học Cần Thơ 9 T3 Thân Trường Đại học Cần Thơ 10 T4 Thân Trường Đại học Cần Thơ 11 L1 Lá Trường Đại học Cần Thơ 12 L2 Lá Trường Đại học Cần Thơ 13 L3 Lá Trường Đại học Cần Thơ 14 L4 Lá Trường Đại học Cần Thơ 15 L5 Lá Trường Đại học Cần Thơ 16 L6 Lá Trường Đại học Cần Thơ 17 L7 Lá Trường Đại học Cần Thơ 4.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc Quan sát và mô tả đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn trên môi trường PDA đặc sau khi nuôi cấy và đã chọn được các dòng thuần cho thấy: hầu hết các dòng vi khuẩn đều phát triển rất nhanh, thời gian để các dòng vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc là 12 giờ, chậm nhất là 24 giờ; phần lớn các vi khuẩn phân lập được đều có khuẩn lạc dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, màu trắng đục và có tính nhầy, một số ít khuẩn lạc có dạng không đều, bìa răng cưa, độ nổi lài và có màu vàng hay hồng. Đặc điểm màu sắc, hình dạng khuẩn lạc được thể hiện ở ( Hình 11, Bảng 8): Chuyên ngành Vi sinh vật học 49 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Màu sắc khuẩn lạc: Phần lớn các khuẩn lạc của vi khuẩn có màu trắng đục 10/17 dòng chiểm tỉ lệ 58,81%; 2/17 dòng có màu trắng trong; 2/17 dòng có màu hồng nhạt; 2/17 dòng có màu vàng nhạt đều chiếm 11,77% và 1/17 dòng có màu vàng đậm chiếm 5,88%. Hình dạng khuẩn lạc: Phần lớn các khuẩn lạc có dạng tròn, 13/17 dòng chiếm tỉ lệ 76,5%; 4/17 dòng có dạng không đều chiếm 23,5%. Độ nổi khuẩn lạc: Đa số khuẩn lạc có độ nổi mô 11/17 dòng chiếm tỉ lệ 64,7%; các dòng còn lại có độ nổi lài 6/17 chiếm tỉ lệ 35,3%. Dạng bìa khuẩn lạc: Các khuẩn lạc có dạng bìa nguyên gồm 12/17 dòng chiếm 70,6%; 5/17 dòng có dạng bìa răng cưa chiếm 29,4%. Kích thước khuẩn lạc: Đường kính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được có kích thước dao động từ 2 - 8 cm sau khi cấy trên môi trường PDA và ủ ở 30oC khoảng từ 12 - 36h. Chuyên ngành Vi sinh vật học 50 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Dòng T3 Dòng L4 L4 Dòng R8 Dòng L3 Dòng T1 Dòng L1 Hình 11: Một số khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA Agar (Dòng L4) Khuẩn lạc có màu vàng nhạt, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô (Dòng T3) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô (Dòng L3) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, nhăn, độ nổi lài (Dòng R8) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô (Dòng L1) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi hơi mô (Dòng T1) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa răng cưa, độ nổi hơi lài Chuyên ngành Vi sinh vật học 51 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 8. Đặc tính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA STT Dòng vi khuẩn Màu sắc khuẩn lạc Hình dạng khuẩn lạc Đường kính khuẩn lạc (cm) 1 R1 Trắng đục Không đều, bìa nguyên, mô 4x5 2 R2 Trắng trong Tròn, bìa nguyên, lài 5 3 R5 Hồng nhạt Không đều, bìa răng cưa, mô 4 4 R6 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, lài 5 5 R7 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, mô 3 6 R8 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, mô 3 7 T1 Trắng đục Tròn, bìa răng cưa, lài 3 8 T2 Trắng trong Không đều, bìa nguyên, lài 4x5 9 T3 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, mô 3 10 T4 Vàng đậm Tròn, bìa nguyên, mô 2 11 L1 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, mô 3 12 L2 Trắng đục Tròn, bìa răng cưa, mô 4 13 L3 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, lài 8 14 L4 Vàng nhạt Tròn, bìa nguyên, mô 2 15 L5 Hồng nhạt Không đều, bìa răng cưa, lài 2x3 16 L6 Vàng nhạt Tròn, bìa răng cưa, mô 3 17 L7 Trắng đục Tròn, bìa nguyên, mô 4 4.1.2 Đặc điểm tế bào vi khuẩn Quan sát hình thái và sự chuyển động của vi khuẩn được kiểm tra bằng phương pháp giọt ép, dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần cho thấy các dòng vi khuẩn có đặc điểm như sau: - Đa số các vi khuẩn đều có khả năng chuyển động do có chiên mao ở đỉnh gồm 13/17 dòng chiếm 76,5%; và 4/17 dòng còn lại không có khả năng chuyển động chiếm tỉ lệ rất ít 23,5%. - Phần lớn các dòng vi khuẩn đều có dạng hình que ngắn 9/17 dòng chiếm 52,94% dạng que dài là 7/17 dòng chiếm 41,18%, chỉ có duy nhất 1/17 dòng có dạng cầu đôi chiếm tỉ lệ rất ít 5,88% . Chuyên ngành Vi sinh vật học 52 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Dòng L1 Dòng T4 Hình 12: Vi khuẩn Gram âm (dòng T4) và vi khuẩn Gram dương (dòng L1) được chụp dưới kính hiển vi ở độ phóng đại vật kính X100. Bảng 9. Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA STT Dòng vi khuẩn Gram * Hình dạng Chuyển động ** 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 R1 R2 R5 R6 R7 R8 T1 T2 T3 T4 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 + + + + + + - Que ngắn Que dài Que dài Que dài Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que dài Que ngắn Que dài Que ngắn- chuỗi đôi Que ngắn- chuỗi đôi Que dài Que dài Que ngắn Cầu đôi +++ ++ ++ + + +++ + ++ + + +++ ++ + Kích thước vi khuẩn (µm) Chiều Chiều dài rộng 1,04 5,22 3,48 2,61 1,92 0,52 1,04 1,74 3,13 0,52 3,48 2,61 2,09 2,61 2,61 1,74 1,92 0,87 1,74 1,74 1,74 0,87 0,34 0,34 0,87 0,87 0,87 1,39 1,57 1,74 1,74 1,22 0.87 0,87 (Ghi chú: *: - Gram âm, + Gram dương; **: - không chuyển động, + có chuyển động; + chuyển động chậm, ++ chuyển động vừa, +++ chuyển động nhanh.) Chuyên ngành Vi sinh vật học 53 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.2 Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã được phân lập dựa trên lượng NH4+ (ammonium) tổng hợp được. Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được sau khi chủng vào môi trường Nfb lỏng (không N, không Yeast extract). Sau khi khảo sát khả năng cố định đạm dựa vào lượng NH4+ (ammonium) do vi khuẩn sinh ra (phương pháp so màu Indophenol Blue), kết quả cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn khảo sát đều có khả năng cố định đạm sinh học được chia làm 2 nhóm phân bố đều ở rễ, thân và lá. Nhìn chung, các dòng vi khuẩn bắt đầu tạo ra lượng NH4+ (ammonium) ở ngày đối chứng (1 giờ sau khi chủng), tuy nhiên với hàm lượng rất thấp. Lượng ammonium bắt đầu tăng lên ở ngày thứ 2 nhưng vẫn còn thấp và đạt mức cực đại ở ngày thứ 4, sau đó bắt đầu giảm mạnh ở ngày thứ 6 sau khi chủng. Đây là xu hướng chung của hầu hết các dòng vi khuẩn vì do ngày đầu sau khi chủng, các dòng vi khuẩn chưa kịp thích ứng với môi trường nên khả năng hoạt động thấp tạo nên hàm lượng đạm thấp, đến ngày thứ 2 và ngày thứ 4 sau khi chủng, khi đã bắt đầu quen với môi trường, chúng sinh trưởng và phát triển mạnh nên khả năng tổng hợp đạm cao hơn. Đến ngày thứ 6 sau khi chủng, khi đã phát triển ở mức tối đa, mật số vi khuẩn ngày càng tăng nhưng chất dinh dưỡng trong môi trường để chúng sử dụng có giới hạn nên chúng có xu hướng sử dụng lượng đạm mà chúng đã tổng hợp được nên hàm lượng đạm giảm đi đáng kể. 4.2.1 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân lập ở rễ và thân cây cúc mui (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4) Ở 1 giờ sau khi chủng, cả 10 dòng vi khuẩn (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4) ở nhóm 1 được phân lập ở rễ và thân đều đã tổng hợp được lượng ammonium nhưng nhìn chung đều rất thấp. Thấp nhất là lượng ammonium trung bình do dòng R1 tạo ra gần như bằng 0 (0,002 µg/ml). Tuy nhiên, các dòng R6, R8, T3, T4 lại tổng hợp lượng ammonium trung bình khá cao tương đương nhau (khác biệt không có ý nghĩa thống kê với nhau) nhưng lại khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại chỉ sau 1 giờ chủng (hàm lượng ammonium trung bình dao động từ 0,052 µg/ml - 0,06 µg/ml). Hàm lượng đạm trung bình cao nhất (0,06 µg/ml) do dòng T4 tổng hợp được. Đến ngày thứ 2 sau khi chủng, hàm lượng ammonium trung bình do tất cả các dòng vi khuẩn nhóm 1 tạo ra đều tăng lên. Tuy nhiên, do đặc tính của mỗi dòng vi khuẩn khác nhau nên khả năng tổng hợp đạm ở mỗi dòng vi khuẩn cũng rất khác nhau. Bên cạnh một số dòng vi khuẩn tổng hợp lượng đạm trung bình tăng rất mạnh còn có Chuyên ngành Vi sinh vật học 54 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT một số dòng vi khuẩn tăng chậm ở ngày thứ 2 sau khi chủng. Dòng R6 và T3 vẫn tổng hợp hàm lượng đạm cao nhất và tương đương nhau (hàm lượng đạm trung bình ở 2 dòng đều là 0,129 µg/ml ), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng khác ở ngày thứ 2 sau khi chủng. Ngoài ra, dòng R1 tuy tổng hợp lượng đạm trung bình thấp nhất (0,002 µg/ml) sau 1 giờ chủng, nhưng đến ngày thứ 2 sau khi chủng, lượng đạm trung bình do dòng vi khuẩn này tạo ra lại khá cao và khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với dòng R6 và T3, chứng tỏ rằng dòng R1 phát triển rất nhanh và tổng hợp lượng đạm rất mạnh chỉ sau 2 ngày chủng. Ngược lại, dòng T4 tuy tổng hợp lượng đạm trung bình cao nhất sau 1 giờ chủng (hàm lượng đạm trung bình là 0,06 µg/ml) nhưng đến ngày thứ 2 sau khi chủng, hàm lượng đạm trung bình (0,086 µg/ml) lại rất thấp hơn so với các dòng còn lại ở nhóm 1 ngoại trừ dòng R2 (0,084 µg/ml), tuy nhiên 2 dòng vi khuẩn này khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê. Hàm lượng đạm trung bình do các dòng vi khuẩn nhóm 1 tổng hợp được lại tiếp tục tăng cao ở ngày thứ 4 sau khi chủng, cao nhất vẫn là hàm lượng đạm do dòng R6 và T3 tổng hợp được (0,216 µg/ml và 0,221 µg/ml) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại, 2 dòng này vẫn tạo ra lượng đạm trung bình tương đương nhau. Điều này chứng tỏ khả năng tổng hợp ammonium ở dòng R6 và T3 tương đương nhau và có triển vọng tạo ra hàm lượng đạm cao nhất so với các dòng vi khuẩn được phân lập ở rễ và thân. Thấp nhất là hàm lượng đạm trung bình do các dòng R1, R2, R5 và T4 tạo ra (hàm lượng đạm trung bình dao động từ (0,148 µg/ml – 0,153 µg/ml) Đến ngày thứ 6 sau khi chủng, hàm lượng đạm trung bình đều giảm xuống đáng kể ở hầu hết các dòng vi khuẩn nhóm 1. Tuy nhiên, hàm lượng đạm trung bình do dòng T3 và R1 tổng hợp giảm đi rất ít nên hàm lượng đạm trung bình vẫn còn cao và khác biệt không có ý nghĩa, cao nhất là lượng đạm do dòng T3 tổng hợp được (0,144 µg/ml) ở mức khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại trong nhóm 1. Dòng R2 và T4 tổng hợp lượng đạm thấp nhất (0,031 µg/ml và 0,034 µg/ml). Một cách tổng quát, 10 dòng vi khuẩn được phân lập ở rễ và thân đều có khả năng tổng hợp được lượng ammonium nhất định chỉ sau 1 giờ chủng nhưng rất thấp là do khi vừa chủng, các dòng vi khuẩn vẫn chưa đủ thời gian phát triển để tổng hợp ra ammonium nên hàm lượng ammonium tạo ra rất thấp (hàm lượng đạm trung bình dao động từ 0,002 µg/ml - 0,06 µg/ml) xấp xỉ bằng 0. Dòng T4 tuy tạo ra hàm lượng đạm trung bình sau 1 giờ chủng cao nhất nhưng đến ngày 2, ngày 4, ngày 6 sau khi chủng Chuyên ngành Vi sinh vật học 55 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT hàm lượng đạm trung bình lại thấp nhất so với các dòng còn lại ở nhóm 1, có thể là do dòng T4 thích ứng nhanh với môi trường nên tổng hợp lượng đạm cao ở ngày đối chứng nhưng khả năng tổng hợp ammonium lại thấp hơn các dòng khác nên mặc dù hàm lượng đạm trung bình do dòng T4 tạo ra ở ngày 2, ngày 4 sau khi chủng có tăng lên nhưng tăng rất ít. Đáng kể nhất là khả năng tổng hợp ammonium ở dòng R6 và T3, hàm lượng đạm trung bình từ ngày đầu đến ngày thứ 6 sau khi chủng đều cao nhất và tương đương nhau, khác biệt rất có ý nghĩa so với các dòng khác, chứng tỏ dòng R6 và T3 là 2 dòng triển vọng nhất trong tất cả các dòng vi khuẩn được phân lập từ rễ và thân (Bảng 10). Bảng 10. Lượng ammonium do các dòng vi khuẩn nhóm 1 (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4) tổng hợp được theo thời gian (µg/ml) Đạm ngày 0 Đạm ngày 2 Đạm ngày 4 Đạm ngày 6 R1 0,002e 0,118ab 0,15e 0,125ab R2 0,024bc 0,084e 0,148e 0,031e R5 0,008de 0,094de 0,155e 0,043de R6 0,052a 0,129a 0,216a 0,119b R7 0,03bc 0,089e 0,168d 0,061d R8 0,056a 0,105cd 0,195b 0,061d T1 0,034b 0,089e 0,201b 0,095c T2 0,019cd 0,108bc 0,183c 0,113bc T3 0,052a 0,129a 0,221a 0,144a T4 0,06a 0,086e 0,153e 0,034e 21,61 7,22 4,14 13,54 Dòng vi khuẩn CV (%) (*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%). 4.2.2 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân lập từ lá của cây cúc mui (L1 - L7) Kết quả cho thấy 7 dòng vi khuẩn ở nhóm 2 được phân lập từ lá cây cúc mui đều có khả năng tổng hợp được lượng ammonium. Cũng tương tự như nhóm 1 (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4), các dòng vi khuẩn ở nhóm 2 (L1 - L7) đều tạo được hàm lượng NH4+ Chuyên ngành Vi sinh vật học 56 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT nhất định sau 1 giờ chủng và lượng NH4+ này tăng cao nhất vào ngày thứ tư rồi giảm dần vào ngày thứ 6 sau khi chủng. Hàm lượng ammonium trung bình do các dòng vi khuẩn ở nhóm 2 tạo ra sau 1 giờ chủng rất thấp, nhưng nhìn chung cao hơn so với nhóm 1. Dòng L6 tạo ra hàm lượng đạm trung bình cao nhất (0,077 µg/ml) ở mức khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng khác trong nhóm 2, thấp nhất là hàm lượng đạm trung bình do dòng L5 tạo ra (0,009 µg/ml) nhưng vẫn cao hơn hàm lượng đạm trung bình do dòng R2 tạo ra (0,002 µg/ml) ở nhóm 1. Hình 13: Lượng NH4+ (µg/ml) do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (L1- L7) tạo ra (*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%). Đến ngày thứ 2 sau khi chủng, lượng ammonium trung bình do tất cả các dòng vi khuẩn ở lá tổng hợp được đều tăng lên đáng kể, nhưng lượng đạm ở ngày 2 vẫn thấp hơn so với ngày 4 sau khi chủng. Dòng L6 vẫn tổng hợp được lượng đạm cao nhất (0,134 µg/l) so với các dòng còn lại. Tuy nhiên, ở ngày thứ 2 sau khi chủng, lượng ammonium trung bình ở cả 7 dòng trong nhóm 2 đều khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (hàm lượng đạm trung bình dao động từ 0,113 µg/l - 0,134 µg/l). Đến ngày thứ 4 sau khi chủng, hàm lượng đạm trung bình vẫn tiếp tục tăng cao và đạt đỉnh điểm ở cả 7 dòng, các dòng L3 - L7 tổng hợp lượng ammonium trung bình rất cao (dao động từ 0,208 µg/l - 0,221 µg/l) khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên, cao nhất là hàm lượng đạm ở 3 dòng L4, L5, L6 (0,216 µg/l; 0,213 Chuyên ngành Vi sinh vật học 57 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT µg/l; 0,221 µg/l). Dòng L4 và L7 khác biệt không có ý nghĩa so với dòng L2, dòng L2 lại khác biệt không ý nghĩa so với dòng L1. Dòng L1 tổng hợp lượng đạm trung bình thấp nhất (0,185 µg/l) so với các dòng khác ở nhóm 2 nhưng lại cao hơn hàm lượng đạm trung bình do một số dòng ở nhóm 1 tạo ra. Đến ngày thứ 6 sau khi chủng, lượng đạm ở tất cả các dòng đều giảm, lượng đạm trung bình do dòng L4 tạo ra vẫn còn cao (0,159 µg/l) khác biệt có ý nghĩa so với các dòng khác ở nhóm 2. Giảm đáng kể là hàm lượng đạm ở các dòng L1, L2, L3 và L7 (hàm lượng đạm trung bình dao động từ 0,185 µg/l – 0,208 µg/l ở ngày thứ 4 sau khi chủng đến ngày thứ 6 sau khi chủng giảm xuống còn 0,08 µg/l – 0,092 µg/l). Một cách tổng quát hàm lượng ammonium tăng dần từ ngày đầu đến ngày 4 và giảm xuống ở ngày 6 sau khi chủng, lượng ammonium cao nhất ở ngày thứ 4 sau chủng. Một số dòng vi khuẩn có triển vọng tổng hợp được hàm lượng đạm cao nhất so với các dòng vi khuẩn ở nhóm 2 được phân lập từ lá cây cúc mui là dòng L4, L5, L6. 4.2.3 Khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn triển vọng ở cả nhóm 1 và nhóm 2 được phân lập ở rễ, thân và lá của cây cúc mui Khi so sánh khả năng tổng hợp ammonium ở các dòng vi khuẩn triển vọng ở cả rễ, thân và lá cây cúc mui, kết quả là ở ngày đầu tuy hàm lượng đạm trung bình do 5 dòng triển vọng tạo ra có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê, hàm lượng đạm trung bình cao nhất do dòng L6 tổng hợp được (0,077 µg/ml), thấp nhất là hàm lượng đạm do dòng L4 và L5 tổng hợp được (0,021 µg/ml và 0,009 µg/ml). Nhưng đến ngày thứ 2 và ngày thứ 4 sau khi chủng, hàm lượng đạm trung bình ở các dòng tăng lên đáng kể nhưng hầu hết sự khác biệt không ý nghĩa thống kê giữa tất cả các dòng. Điều này cho thấy khả năng tổng hợp đạm khác biệt rất lớn giữa các dòng, dòng L4 và L5 tổng hợp đạm tăng nhanh sau 2 và 4 ngày chủng, dòng L6 tăng chậm nhất. Tuy nhiên cao nhất vẫn là lượng đạm do dòng L6 tổng hợp được (hàm lượng đạm trung bình là 0,134 µg/ml ở ngày thứ 2 sau khi chủng và 0,221 µg/ml ở ngày thứ 4 sau khi chủng). Đến ngày thứ 6 sau khi chủng, hàm lượng đạm trung bình vẫn giảm xuống nhưng không đáng kể ở cả 3 dòng T3, L4, L5 (hàm lượng đạm trung bình dao động từ 0,131 µg/ml - 0,159 µg/ml). Hàm lượng đạm trung bình giảm đáng kể nhất là dòng R6 và L6 (hàm lượng đạm tương ứng 0,216 µg/ml và 0,221 µg/ml ở ngày 4 sau khi chủng giảm xuống còn 0,119 µg/ml và 0,122 µg/ml ở ngày 6 sau khi chủng). Chuyên ngành Vi sinh vật học 58 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hình 14: Lượng NH4+ (µg/ml) do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra (*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%). Tổng quát, cả 17 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp NH4+, trong đó các dòng R6, T3, L4, L5, L6 là triển vọng nhất. Các dòng vi khuẩn triển vọng này đã tạo lượng NH4+ cao nhất so với 17 dòng vi khuẩn đã được phân lập từ rễ, thân và lá của cây cúc mui. Những dòng triển vọng này có xu hướng bắt đầu tổng hợp NH 4+ ở ngày 2 tăng mạnh ở ngày 4 và giảm dầm ở ngày 6. Tuy hàm lượng đạm trung bình do các dòng R6, T3, L4, L5 và L6 tổng hợp được có khác biệt ở ngày đầu sau khi chủng nhưng đến ngày 2 và ngày 4 sau khi chủng, cả 5 dòng vi khuẩn triển vọng đều tổng hợp lượng đạm rất cao và tương đương nhau (khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê). Điều này cho thấy khả năng tổng hợp đạm tuy chênh lệch giữa các dòng vi khuẩn triển vọng nhưng lượng đạm cao nhất mà chúng tổng hợp tương đương nhau chứng tỏ cả 5 dòng này đều có triển vọng như nhau (dao động từ 0,213 µl/ml - 0,221 µl/ml). Tuy nhiên, lượng ammonium do các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây cúc mui có khả năng tổng hợp ammonium rất thấp. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Phương Tâm (2011), các dòng vi khuẩn nội sinh MA 48, MA 41, MA 40 và MA 49 được phân lập từ cây mía có khả năng tổng hợp đạm rất cao (dao động từ 8,93 µl/ml 9,92 µl/ml) ở ngày thứ 4 sau khi chủng. Hai dòng vi khuẩn E 3704 và E 1631 nội sinh trong lá hẹ và rễ ngò gai, phân lập được trên môi trường NFb bởi Trần Mỹ Xuyên (2010), tổng hợp được lượng ammonium cao nhất ở ngày thứ 4 sau chủng lần lượt là 3,52 µl/ml và 3,55 µl/ml. Chuyên ngành Vi sinh vật học 59 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.3. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân ở các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA. Trong số 17 dòng vi khuẩn phân lập được sau khi khảo sát khả năng hòa tan lân trong môi trường NBRIP đặc , kết quả chỉ có 11 dòng vi khuẩn có khả năng tạo được vòng halo chứng tỏ các dòng vi khuẩn này có khả năng hòa tan lân khó tan. Hình 15: Vòng halo do dòng vi khuẩn L5 tạo ra khi chủng vào trong môi trường NBRIP. Nhìn chung, hiệu quả hòa tan lân tăng dần từ ngày 1 đến ngày 5 sau khi chủng. Ở ngày thứ nhất sau khi chủng, hầu hết hiệu quả hòa tan lân ở các dòng đều như nhau (khác biệt không có ý nghĩa thống kê), tuy nhiên, dòng L5 và L6 cho hiệu quả hòa tan lân cao nhất ( hiệu quả hòa tan lân lần lượt là 132,2 E và 132,7 E) khác biệt có ý nghĩa so với dòng L1 cho hiệu quả hòa tan lân hấp nhất là dòng L1 (113,3 E), 2 dòng này có hiệu suất hòa tan lân tương đương nhau, tuy nhiên lại khác biệt không có ý nghĩa so với các dòng còn lại. Đến ngày 3 và ngày 5 sau khi chủng, hiệu quả hòa tan lân tăng lên ở cả 11 dòng vi khuẩn, dòng L5 vẫn cho hiệu quả hòa tan lân cao nhất (hiệu quả hòa tan lân ở ngày 5 sau khi chủng là 220,8 E) khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại. Một nghiên cứu khác về vi khuẩn nội sinh ở cây dưa hấu của Nguyễn Thanh Bình (2013) cho thấy dòng NDH15 cho khả năng hòa tan lân cao nhất với hiệu quả hòa tan lân là 246 E ở ngày thứ 5 sau khi chủng. Chuyên ngành Vi sinh vật học 60 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 11. Hiệu quả hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường NBRIP đặc Thời gian ủ Dòng vi khuẩn 1 ngày 3 ngày 5 ngày Đ.K halo/ Đ.K khuẩn lạc (cm) Hiệu quả hòa tan lân (E) Đ.K halo/ Đ.K khuẩn lạc (cm) Hiệu quả hòa tan lân (E) Đ.K halo/ Đ.K khuẩn lạc (cm) Hiệu quả hòa tan lân (E) R5 1,167 116,7ab 1,192 119,2b 1,255 125,5c R6 1,178 117,8ab 1,189 118,9b 1,211 121,1c R7 1,194 119,4ab 1,231 123,1b 1,382 138,2c R8 1,188 118,8ab 1,261 126,1ab 1,298 129,8c T4 1,268 126,8ab 1,282 128,2ab 1,794 179,4b L1 1,133 113,3b 1,217 121,7b 1,278 127,8c L2 1,21 121ab 1,239 123,9b 1,261 126,1c L3 1,197 119,7ab 1,324 132,4ab 1,402 140,2c L5 1,322 132,2a 1,478 147,8a 2,208 220,8a L6 1,327 132,7a 1,338 133,8ab 1,408 140,8c L7 1,194 119,4ab 1,252 125,2ab 1,334 133,4c CV (%) 7,24 10,78 12,7 (*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%). 4.4. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) ở các dòng vi khuẩn được nuôi trong môi trường Nfb lỏng không bổ sung Tryptophan Sau khi xác định khả năng cố định đạm và hòa tan lân khó tan của 17 dòng vi khuẩn đã phân lập được, tiếp tục nuôi cấy các dòng vi khuẩn này trong môi trường Nfb lỏng (không bổ sung Tryptophan, không N, không Yeast extract) , theo dõi và đo hàm lượng IAA được tạo ra. Kết quả cho thấy tất cả 17 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp indol-3aceteic acid (IAA) mà không cần bổ sung Tryptophan (tiền chất tổng hợp indol-3aceteic acid) vào môi trường nuôi. Tương tự như khả năng tổng hợp đạm, nhìn chung, các dòng vi khuẩn này đều tổng hợp lượng IAA thấp ở ngày thứ 2, đến ngày thứ 4 lượng IAA được tổng hợp cao nhất và sau đó lượng IAA giảm rõ rệt ở ngày thứ 6 sau Chuyên ngành Vi sinh vật học 61 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT khi chủng. Tuy nhiên, một số dòng vi khuẩn tạo ra lượng IAA tiếp tục tăng cao ở ngày thứ 6 sau khi chủng. Các dòng này có khả năng tổng hợp được hàm lượng IAA rất cao. Lượng IAA do các dòng vi khuẩn tổng hợp được chia làm 2 nhóm qua các ngày cụ thể như sau: 4.4.1 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 1 được phân lập ở rễ và thân cây cúc mui (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4) Ở ngày thứ 2 sau khi chủng, tất cả các dòng vi khuẩn ở nhóm 1 (R1, R2, R5 - R8 và T1-T4) được phân lập từ rễ và thân cây cúc mui đều tổng hợp được lượng IAA nhất định. Tuy nhiên, dòng R5 có khả năng tổng hợp lượng IAA trung bình cao nhất (12,42 µg/ml) và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng vi khuẩn còn lại, các dòng R2, R8, T1, và T2 tổng hợp lượng IAA trung bình cũng khá cao và tương đương nhau (khác biệt không có ý nghĩa), các dòng vi khuẩn còn lại chỉ tổng hợp lượng IAA ở mức trung bình và tổng hợp lượng IAA trung bình thấp nhất là dòng R6 và T4 (6,33 µg/ml và 5,33 µg/ml). Đến ngày thứ 4 sau khi chủng, lượng IAA trung bình do các dòng vi khuẩn tổng hợp được nhìn chung cao hơn so với ngày thứ 2. Tuy nhiên, về khả năng tổng hợp IAA ở các dòng vi khuẩn có sự thay đổi, dòng R1 tổng hợp được lượng IAA trung bình cao nhất (14,5 µg/ml) khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với dòng R5 (14 µg/ml), nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng khác trong nhóm 1, chứng tỏ dòng R1 và R5 là 2 dòng triển vọng nhất về khả năng tổng hợp IAA trong số 10 dòng ở nhóm 1 được phân lập từ rễ cây cúc mui. Dòng R2, R6, T2 cũng có khả năng tổng hợp lượng IAA cao ở ngày thứ 4 sau chủng (hàm lượng IAA trung bình dao động từ (13,05 µg/ml - 13,67 µg/ml). Thấp nhất là lượng IAA do dòng T3 tạo ra (11,78 µg/ml), nhưng nhìn chung cao hơn nhiều so với lượng IAA do tất cả các dòng vi khuẩn ở nhóm 1 tạo ra nhưng lại thấp hơn hàm lượng IAA trung bình do dòng R5 tạo ra (14,42 µg/ml) ở ngày 2 sau khi chủng. Hàm lượng IAA do các dòng vi khuẩn tổng hợp được giảm đáng kể ở ngày thứ 6 sau khi chủng, ngoại trừ dòng R5 và R7 hàm lượng IAA trung bình tăng lên so với lượng IAA trung bình ở ngày thứ 4 sau khi chủng (lượng IAA trung bình lần lượt là 16,67 µg/ml và 13,22 µg/ml). Dòng R5 tổng hợp lượng IAA trung bình cao nhất ở ngày thứ 6 (16,67 µg/ml) sau khi chủng, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại. Hàm lượng IAA do dòng T4 tạo ra giảm mạnh nhất ở ngày thứ 6 sau khi Chuyên ngành Vi sinh vật học 62 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT chủng (hàm lượng IAA trung bình ở ngày thứ 4 là 12,33 µg/ml giảm xuống còn 2,89 µg/ml). Bảng 12. Lượng IAA trung bình do các dòng vi khuẩn nhóm 1 (R1, R2, R5 R8 và T1 - T4) tổng hợp được theo thời gian (µg/ml) Dòng vi khuẩn IAA ngày 2 IAA ngày 4 IAA ngày 6 R1 8,42c 14,5a 11,33c R2 9,17b 13,67bc 10,67c R5 12,42a 14ab 16,67a R6 6,33e 13,5bc 4,78e R7 7,08d 12,78de 13,22b R8 9,58b 12,61de 9d T1 9,17b 12,17ef 3,89ef T2 9,67b 13,05cd 8,78d T3 7,5d 11,78f 5,22e T4 5,83e 12,33ef 2,89f CV (%) 4,25 3,18 9,52 (*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%). Tổng quát, các dòng vi khuẩn đều tạo được lượng IAA nhất định và có xu hướng tăng từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 4 sau khi chủng, đến ngày thứ 6 thì hàm lượng IAA trung bình do tất cả các dòng tổng hợp được giảm đáng kể ngoại trừ dòng R5 và R7 vẫn tiếp tục tăng. Dòng R5 tổng hợp lượng IAA trung bình cao nhất ở ngày thứ 2 sau khi chủng (12,42 µg/ml) nhưng đến ngày thứ 4 và thứ 6 sau khi chủng mặc dù có tăng nhưng không đáng kể (hàm lượng IAA trung bình ở ngày thứ 4 và thứ 6 lần lượt là 14 µg/ml và 16,67 µg/ml) nhưng nhìn chung hàm lượng IAA trung bình của dòng R5 ở cả 3 ngày đều cao hơn các dòng khác trong nhóm 1. Điều này chứng tỏ dòng R5 có khả năng tổng hợp hàm lượng IAA rất cao nhưng khá chậm. Dòng có triển vọng nhất ở nhóm 1 là dòng R1và R5 với hàm lượng IAA trung bình lần lượt là 14,5 µg/ml ở ngày 4 sau khi chủng và 16,67 µg/ml ở ngày 6 sau khi chủng. Chuyên ngành Vi sinh vật học 63 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.4.2 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 2 được phân lập từ lá của cây cúc mui (L1- L7) Tất cả 7 dòng vi khuẩn ở nhóm 2 (L1- L7) được phân lập từ lá của cây cúc mui đều có khả năng tổng hợp IAA cũng theo quá trình tương tự như ở nhóm 1(R1, R2, R5 - R8 và T1 - T4), lượng IAA tăng dần từ ngày 2 đến ngày 4 sau khi chủng và đến ngày thứ 6 đều giảm. Hình 16: Lượng IAA do các dòng vi khuẩn nhóm 2 (L1 - L7) tạo ra được phân lập từ lá của cây cúc mui (*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%). Ở ngày thứ 2 sau khi chủng, lượng IAA trung bình do dòng L2, L3 và L5 khác biệt không có ý nghĩa thống kê, nhưng dòng L5 tạo ra lượng IAA trung bình cao nhất (7,42 µg/ml). Dòng L6 tuy tổng hợp được lượng IAA trung bình thấp nhất (3,92 µg/ml) ở ngày 2 nhưng đến ngày thứ 4 sau khi chủng lại tổng hợp lượng IAA trung bình cao nhất (14,89 µg/ml). Bên cạnh đó, dòng L3 và L7 cũng có khả năng tổng hợp lượng IAA trung bình cao (hàm lượng IAA trung bình tương ứng là 13,83 µg/ml và 13,94 µg/ml) và khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê. Các dòng L1, L2, L4, và L5 cũng tổng hợp lượng IAA tăng ở ngày thứ 4 sau khi chủng nhưng hàm lượng IAA trung bình (dao động từ 9,22 µg/ml - 12,78 µg/ml) thấp hơn nhiều so với lượng IAA Chuyên ngành Vi sinh vật học 64 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT do dòng L6, L7, và L3 tổng hợp. Điều này cho thấy dòng L6, L7, và L3 là các dòng triển vọng nhất trong số 7 dòng vi khuẩn ở nhóm 2 được phân lập từ lá. Các dòng vi khuẩn đều tạo lượng IAA trung bình giảm mạnh ở ngày thứ 6 sau khi chủng ngoại trừ dòng L6 và L7 giảm không đáng kể nên hàm lượng IAA ở 2 dòng này cao nhất và tương đương nhau, khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại ở nhóm 2 ở ngày thứ 6 sau khi chủng (lượng IAA trung bình đều là 12,11 µg/ml). 4.4.3 Khả năng tạo IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng ở cả nhóm 1 và nhóm 2 được phân lập ở rễ, thân và lá của cây cúc mui Khi so sánh khả năng tổng hợp IAA giữa các dòng triển vọng trong số 17 dòng vi khuẩn phân lập được ở cả rễ, thân và lá của cây cúc mui. Kết quả là đa số các dòng vi khuẩn đều tổng hợp lượng IAA tăng từ ngày 2 đến ngày 4 và giảm xuống ở ngày 6 sau khi chủng. Riêng chỉ có hàm lượng IAA trung bình do dòng R5 tổng hợp được có xu hướng tăng dần từ ngày 2 đến ngày 6 sau khi chủng (lượng IAA trung bình từ 12,42 µg/ml - 16,67 µg/ml). Dòng L6 tuy tổng hợp lượng IAA trung bình ở ngày 4 cao nhất (14,89 µg/ml) khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng triển vọng khác, nhưng đến ngày 6 sau khi chủng lượng IAA trung bình lại giảm và thấp hơn lượng IAA trung bình do dòng R5 tổng hợp được (16,67 µg/ml) . Vì vậy dòng R5 là dòng triển vọng nhất về khả năng tổng hợp IAA. Theo kết quả nghiên cứu của Lata et al. (2006) trong môi trường có bổ sung Tryptophan, vi khuẩn Pseudomonas stutzeri được phân lập từ cây cúc dại (Echinacae) có khả năng tổng hợp lượng IAA là 18,8 µg/ml. Trong khi đó, chủng Bacillus thuringiensis chỉ có khả năng tổng hợp lượng IAA từ 1,53 - 9,71 µg/ml (Raddadi et al., 2008). Năm 2010, Ngô Minh Toàn phân lập được dòng vi khuẩn nội sinh trên cây chuối có khả năng tạo được 9,273 µg/ml IAA vào ngày thứ 4 sau khi chủng. Từ các nghiên cứu trên cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập được từ cây cúc mui có khả năng tổng hợp IAA rất cao, lên đến 16,67 µg/ml khi trong môi trường không bổ sung Tryptophan. Đây là một trong những tiềm năng giúp cho cây phát triển tốt. Chuyên ngành Vi sinh vật học 65 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hình 17: Lượng IAA do các dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra được phân lập từ rễ, thân và lá của cây cúc mui (*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%). 4.5 Kết quả khả năng kháng khuẩn ở các dòng vi khuẩn Khi thử nghiệm khả năng kháng khuẩn với 2 loài vi khuẩn gây bệnh (E. coli và Aeromonas hydrophila), kết quả là 3 trong số 17 dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh đường ruột (E. coli) và 4 trong số 17 dòng vi khuẩn có khả năng kháng lại vi khuẩn gây bệnh ở cá (Aeromonas hydrophila). Trong đó có 2 dòng có khả năng kháng khuẩn với cả 2 loài vi khuẩn gây bệnh nhưng rất yếu. 4.5.1 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh ở đường ruột (E. coli) Khi khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng VKNS phân lập được với vi khuẩn E. coli gây bệnh đường ruột, dòng R2, T2, T4 có khả năng tạo vòng sáng. Điều này chứng tỏ các dòng R2, T2, T4 có khả năng kháng lại vi khuẩn E. coli gây bệnh. Nhìn chung ở ngày đầu sau khi ủ, dòng T4 cho thấy khả năng kháng khuẩn cao nhất (vòng vô khuẩn là 2,5 mm), tuy nhiên sự khác biệt ở cả 3 dòng này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Đến ngày thứ 2 sau khi ủ, vòng vô khuẩn tăng lên nhưng không đáng kể, ở dòng T4 vẫn cho hiệu số cao nhất và khác biệt không ý nghĩa thống kê so với dòng T2. Điều này chứng tỏ dòng T4 có khả năng kháng lại E. coli mạnh nhất. Đến ngày thứ 3 sau khi ủ, khả năng kháng khuẩn ở cả 3 dòng đều tăng nhưng rất ít, hiệu quả kháng khuẩn cao nhất vẫn là dòng T4 (3,3 mm), khác biệt có ý nghĩa so Chuyên ngành Vi sinh vật học 66 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT với 2 dòng còn lại. Tuy nhiên, khả năng đối kháng của cả 3 dòng R2, T2 và T4 đối với vi khuẩn E. coli nhìn chung đều rất yếu. Ngày 1 Ngày 3 Hình 18: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn T4 với vi khuẩn E. coli theo thời gian Bảng 13. Khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn E. coli Thời gian ủ Dòng 1 ngày 2 ngày 3 ngày vi khuẩn Vòng vô khuẩn Vòng vô khuẩn Vòng vô khuẩn (D-d, mm) (D-d, mm) (D-d, mm) R2 0,75a 1b 1,5b T2 1,4a 1,9ab 2b T4 2,5a 3,15a 3,3a CV (%) 36,2 29,54 7,2 (*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%). 4.5.2 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn gây bệnh Aeromonas hydrophila Khi khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng VKNS phân lập được với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh ở cá. Kết quả là 5 dòng R2, T2, L2, L3, L5 có khả năng tạo vòng sáng quanh khuẩn lạc chỉ sau 1 ngày sau khi ủ, chứng tỏ 5 dòng này đều có khả năng kháng lại vi khuẩn Aeromonas hydrophila. Dòng L2 cho thấy vòng vô khuẩn cao nhất, chứng tỏ dòng L2 có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại ở ngày 1 và ngày 2 sau khi ủ (hiệu số trung bình lần lượt là 4,5 mm và 4,5 mm). Tuy nhiên, vòng vô khuẩn từ ngày 1 đến ngày 2 Chuyên ngành Vi sinh vật học 67 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT sau khi ủ vẫn không đổi ở cả 5 dòng, ngoại trừ dòng L3 có tăng lên nhưng không đáng kể. Đến ngày thứ 3 sau khi ủ, vòng vô khuẩn ở tất cả các dòng đều tăng nhưng rất ít ngoại trừ dòng R2 vẫn không đổi. Vòng vô khuẩn cao nhất vẫn là dòng L2 (4,75 mm). Dòng L3 cũng cho khả năng kháng lại vi khuẩn Aeromonas hydrophila cao (vòng vô khuẩn là 4 mm) và khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê so với dòng L2 nhưng khác biệt có ý nghĩa so với 3 dòng còn lại, thấp nhất vẫn là dòng R2 (1,25 mm) (Bảng 14). Bảng 14. Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Aeromonas hydrophila Thời gian ủ Dòng vi 1 ngày 2 ngày 3 ngày khuẩn Vòng vô khuẩn Vòng vô khuẩn Vòng vô khuẩn (D-d, mm) (D-d, mm) (D-d, mm) R2 1,25b 1,25c 1,25b T2 1,75b 1,75c 2b L2 4,5a 4,5a 4,75a L3 2,5b 3b 4a L5 1,75b 1,75c 2,5b CV (%) 22,3 17,07 17,24 (*Ghi chú: những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%). Dòng L2 Dòng L3 Hình 19: Khả năng đối kháng của dòng vi khuẩn L2 và L3 với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh ở cá Chuyên ngành Vi sinh vật học 68 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Tổng quát, trong số 17 dòng phân lập được từ rễ, thân và lá của cây cúc mui đem khảo sát thì thấy có 6 dòng R2, T2, T4, L2, L3 và L5 đều có khả năng kháng lại vi khuẩn gây bệnh, cả 6 dòng này đều phân lập được ở rễ, thân và lá cây cúc mui. Trong đó, dòng R2 và dòng T2 vừa có khả năng kháng lại 2 loại vi khuẩn gây bệnh E.coli và Aeromonas hydrophila, tuy nhiên khả năng kháng khuẩn rất yếu so các dòng còn lại. Dòng T4 cho khả năng đối kháng cao nhất đối với vi khuẩn E. coli nhưng lại không thể kháng lại vi khuẩn Aeromonas hydrophila. Ngược lại, 3 dòng L2, L3, L5 kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila mạnh nhất nhưng lại không kháng E. coli. Bên cạnh đó, hiệu quả kháng khuẩn với Aeromonas hydrophila ở hầu hết các dòng vi khuẩn trên cao hơn nhiều so với E. coli (bề rộng vòng vô khuẩn lớn nhất của dòng T4 với E. coli là 3,3 mm của dòng L2 đối với Aeromonas hydrophila là 4,75 mm). Điều này cho thấy các dòng vi khuẩn này có tiềm năng kháng lại vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá hiệu quả hơn so với vi khuẩn E. coli. Nhìn chung, hoạt động kháng khuẩn ở các loài vi khuẩn nội sinh đã và đang là vấn đề đáng được quan tâm trên toàn thế giới. Theo nghiên cứu của Vachees et al. (1997), các chủng Pseudomonas có khả năng ức chế sự phát triển của Staphylococcus, Escherichia coli và Aeromonas hydrophila lên đến 96,7%. Một nghiên cứu mới đây cho thấy chủng vi khuẩn nội sinh Pseudomonas aeruginosa được phân lập từ cải bắp dại (Brassica oleracea) đã được báo cáo về hoạt động kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh như Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi (vòng vô khuẩn dao động từ 12 mm - 25 mm) (Swetha sunkar, 2013). Arundhati và Paul (2013) cũng đã phân lập được các dòng vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân và lá của cây đình lịch (Hygrophila spinosa) có khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh, trong đó khả năng kháng lại vi khuẩn E. coli là cao nhất (vòng vô khuẩn lên đến 20 mm). 4.6 Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR Sau khi kiểm tra các đặc tính sinh hóa của 17 dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA. Chọn 3 dòng vi khuẩn triển vọng nhất đó là dòng R2, dòng T2 và dòng L5 thực hiện phương pháp PCR với đoạn mồi 16S-rDNA (Hình 20). Chuyên ngành Vi sinh vật học 69 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 1 2 Trường ĐHCT 3 4 5 6 7 1500 bp Hình 20: Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S-rDNA (*Ghi chú: Giếng 7: Thang chuẩn 100bp. Giếng 3 - 5: Các mẫu thí nghiệm. Kích thước mẫu là 1.500bp.) Sau khi đã khuếch đại DNA của các dòng vi khuẩn, chọn 3 dòng vi khuẩn R2, T2, L5 gửi giải trình tự và định danh tại Công ty Macrogen, Korea. Sử dụng công cụ Blast của NCBI để so sánh trình tự tương đồng với các trính tự trên ngân hàng gen kết quả đã cho thấy trình tự của dòng R2 có mức đồng hình 99% với 16s-rRNA của dòng vi khuẩn Bacillus subtilis, dòng T2 có mức đồng hình 95% với 16s-rRNA của dòng vi khuẩn Bacillus subtilis, dòng L5 có mức đồng hình 99% với 16s-rRNA của dòng vi khuẩn Bacillus subtilis. 4.6.1 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng R2: TAGGCGAGGCGGACAGCCAAGACTGCAAGTTCGAGCGGACAGATGG GAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAA CCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGAT GGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACT TACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC AAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGAC TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGC AATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTC GGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGG CGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAG CAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGT AAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAA CCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGT Chuyên ngành Vi sinh vật học 70 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT GGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAG TGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGT GGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA GTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTA AGCACTCCGCCTGGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATT GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACG CGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGAC GTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT GTCGTGAGATGTTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTA GTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAACCCGA GAAAAGTTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGGTAC ACACTGGTTCAATGGACAGAAAAAAGGGGGCGAAACCCCCAGGTTAACCA ATCCCACAAACTGTTTCCCTTTCGGA Hình 21: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng R2 Đoạn DNA của dòng R2 dài 1195 bp có tỉ lệ đồng hình 99% với trình tự DNA của KC443084.1 Bacillus subtilis dòng BAB - 244. 4.6.2 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng T2: GGGAGACGGGTGCCAACATAGTATGAGAGTCGCGCGGATTTATAGG GAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAA CCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGAT GGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACT TACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC AAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGAC Chuyên ngành Vi sinh vật học 71 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGC AATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTC GGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGG CGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAG CAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGT AAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAA CCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGT GGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAG TGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAAGAACCAAAGCGT GGGGAACCGAACAGGATTAGATACCCTGGGTAGTCCACCGCCGTAAAACG ATGAATTGCTAAGTTGTTAGGGGGGTTTCCCCCCCCTTTAGTGCTGCAAGC TAACGCATTAAACCACTCCGCCCTGGGGAATTACGGTCCCAAAAACTGAA AACTCAAAGGGAATTTGACGGGGGGCCCCCCACAAGCGGGTGGAAGCATT GTGGTTTTAATTTCGAAACCAACCGCGAAAAAACCTTTACCAGGGTCTTGA ACTTCCTTCTGAACAATCCTAAAAAATAGGAACGTTCCCCTTTCCGGGGGC CAAAATTAACAAGGTGGGTGCAATGGTTTGTCCCTCCAGCTCCTGTTCCTT GGAAATTGTTTGGGTTTAAGTTCCCGGAAACCGAAGCCCCAACCCTTTGGA TCTTTAGGTTGGCCAGCCATTTCCAGTTGGGGGCCCCTTCCAAGGGTGGAC CTGGCCGGGTTGCCAAAACCGGGAAGGAAAGGGGTGGGGGGATTAACGCC TCCAAATTTTCACTT Hình 22: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng T2 Chuyên ngành Vi sinh vật học 72 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Đoạn DNA của dòng T2 dài 1029 bp có tỉ lệ đồng hình 95% với trình tự DNA của KC465726.1 Bacillus subtilis dòng 14. 4.6.3 Trình tự gene mã hóa 16S-rDNA của dòng L5: GGAGGCCCGGTGCCGACAAAGAATTGCATGTCGCGCGGACTGATGG GAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAA CCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGAT GGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACT TACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC AAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGAC TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGC AATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTC GGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGG CGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAG CAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGT AAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAA CCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGT GGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAG TGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGT GGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA GTGCTAAGTGTTAGGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATT AAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATT GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACG CGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGAC GTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAG TTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGA AGAAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTAT Chuyên ngành Vi sinh vật học 73 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hình 23: Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA của dòng L5 Đoạn DNA của dòng L5 dài 1168 bp có tỉ lệ đồng hình 99% với trình tự DNA của KC182058.1 Bacillus subtilis dòng M1. Nhìn chung, kết quả giải trình tự cho thấy rằng cả 3 dòng vi khuẩn R2, T2 và L5 được tuyển chọn đều có trình tự DNA tương đồng với chủng Bacillus subtilis với tỉ lệ đồng hình lần lượt là 99%. Trong đó, tỉ lệ đồng hình của dòng T2 với chủng Bacillus subtilis chỉ có 95%, điều này chứng tỏ dòng T2 có thể là một chủng mới có quan hệ gần gũi với chủng Bacillus subtilis. Cả 3 dòng này đều có khả năng tổng hợp đạm, IAA và tạo vòng kháng khuẩn. Khi so sánh kết quả nghiên cứu về một số đặc tính tiềm năng của chủng Bacillus subtilis, Satapute và Kaliwal (2012) đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus subtilis AS-4 từ đất nông nghiệp và dòng vi khuẩn này sống tự do có khả năng cố định đạm trong đất và thân thiện với môi trường. Bên cạnh đó, Maheswar và Sathiyavani (2012) đã phân lập dòng vi khuẩn Bacillus SPS từ rễ cây lạc (Arachishypogaea L) và dòng vi khuẩn này có khả năng hòa tan lân. Các vi sinh vật hòa tan lân được phân lập từ đất vùng rễ cây lạc được xác định là vi khuẩn Bacillus subtilis và Bacillus cereus. Về khả năng đối kháng, trong báo cáo của Wang et al (2009) dòng Bacillus subtilis EB-28 một vi khuẩn nội sinh được phân lập từ Speranskia tuberculata có tác dụng kháng nấm Botrytis cinerea Pers, gây sự thối rữa một cách mạnh mẽ, đạt hiệu quả đến 71,1% trong điều kiện in vitro và 52,4% trong thí nghiệm ngoài đồng. Bacillus subtilis được phân lập từ cây nho, có tác dụng ức chế bệnh Pierce (Kirkpatrick và Wilhelm, 2007). Hoạt động kháng khuẩn của hai chủng Bacillus được phân lập từ đường ruột tôm càng xanh có khả năng chống lại Aeromonas hydrophila đã được xác Chuyên ngành Vi sinh vật học 74 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT định là Bacillus subtilis P32 và P72 (Mongkol Thirabunyanon và Ananthaya Sansawat, 2009). Bên cạnh đó, theo kết quả nghiên cứu của Hadi Zokaeifar et al (2012), 2 chủng B. subtilis L10 và G1 đều cho kết quả chống lại Virio haveyi và Virio parahaemoliticus (hai loài vi khuẩn gây bệnh trên tôm). Một nghiên cứu khác của Rengpipat et al., (2000) trên đối tượng tôm sú cũng cho rằng sử dụng Bacillus sp. (S11) giúp vật nuôi ít nhiễm bệnh do vi khuẩn Bacillus đã tiết ra các chất làm tăng đáp ứng cả miễn dịch tế bào lẫn miễn dịch dịch thể. Balcázar (2003) chứng minh Bacillus làm tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng của tôm thẻ do khống chế V. harveyi và virus đốm trắng. Một nghiên cứu khác của Hadi et al. (2009) trộn B. subtilis vào thức ăn tôm thẻ chân trắng làm tôm tăng trưởng nhanh và tỉ lệ sống cao hơn so với đối chứng, mặt khác mật độ B. subtilis cũng tăng nhanh trong hệ tiêu hóa của tôm và mật độ Vibrio giảm. Ngoài ra, Bacillus subtilis B20.1 cũng có khả năng ức chế vi khuẩn Ewardseilla ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra một cách hiệu quả (Hồ Thị Trường Thy et al., 2011). Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các chủng Bacillus subtilis có phổ hoạt động rất rộng, ngoài khả năng được biết đến như một loại probiotic - là vi sinh vật sống, khi được sử dụng với lượng thích hợp sẽ mang lại lợi ích cho sức khỏe của vật chủ (Araya et al., 2002), B. subtilis vừa có khả năng tổng hợp đạm, IAA, hòa tan lân và đặc biệt là khả năng kháng khuẩn đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh trên cá. Điều này chứng tỏ B. subtilis là một ứng cử viên sáng giá trong ngành công nghiệp dược, hứa hẹn sẽ trở thành một loại kháng sinh vi sinh vật tiềm năng, có thể thay thế một số loại thuốc kháng sinh tổng hợp trong việc chống lại các tác nhân gây bệnh, đặc biệt là các mầm bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Chuyên ngành Vi sinh vật học 75 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Mười bảy dòng vi khuẩn đã được phân lập từ rễ, thân và lá của cây cúc mui. Tất cả 17 dòng vi khuẩn này đều có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, chỉ có 11 dòng vi khuẩn là tạo được vòng halo, trong đó 4 dòng được phân lập từ rễ, 1 dòng được phân lập từ thân và 6 dòng được phân lập từ lá thể hiện hiệu quả hòa tan lân và 6 dòng có khả năng tạo vòng kháng khuẩn đều phân lập được từ rễ thân, lá. Ba dòng vi khuẩn triển vọng nhất ở cả rễ, thân và lá là dòng L5 (tổng hợp NH4+, tổng hợp IAA, hòa tan lân và tạo vòng kháng khuẩn), dòng R2 (tổng hợp NH4+, tổng hợp IAA, tạo vòng kháng khuẩn) và dòng T2 (tổng hợp NH4+, tổng hợp IAA, và tạo vòng kháng khuẩn). Kết quả giải trình tự gen 16S-rDNA và so sánh với dữ liệu của ngân hàng gene NCBI. Dòng R2, T2 và R5 được nhận diện là Bacillus sp, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis với tỉ lệ đồng hình là 99%, 95%, 99%. 5.2 Kiến nghị Khảo sát thêm những đặc tính kháng khuẩn và nghiên cứu cơ chế tạo kháng sinh của những dòng vi khuẩn phân lập với những dòng vi khuẩn hoặc nấm gây bệnh khác. Chuyên ngành Vi sinh vật học 76 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Ái Chi. 2009. Phân lập và đặc tính vi khuẩn nội sinh trong cây khóm (Ananas comosus L.) trồng trên đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An. Tuyển tập hội nghị Công nghệ sinh học phía Nam năm 2009, tại thành phố Hồ Chí Minh từ ngày 23-24 tháng 10, năm 2009. Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002. Bài giảng thực tập Vi sinh vật đại cương. Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh Học. Trường Đại học Cần Thơ. Cao Ngọc Điệp và Phan Thị Nhã. 2011. Phân lập và xác định đặc tính vi khuẩn nội sinh trong cây khóm (Ananas comosus [L.]) trồng trên đất phèn thị xã Vị Thanh, Tỉnh Hậu Giang. Tạp chí Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ 9(2): 243-250. Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Hữu Hiệp, 2011. Giáo trình Vi sinh vật học đại cương. Nhà xuất bản Đại học Cần Thơ, trang 1; 149 - 151. Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Hữu Hiệp, 2012. Giáo trình Vi sinh vật học môi trường. Nhà xuất bản Đại học Cần Thơ, trang 12 - 24. Cao Ngọc Điệp, Nguyễn Thanh Tùng, Võ Văn Phước Quệ và Nguyễn Vân Anh, 2011. Hiệu quả của vi khuẩn cố định đạm Gluconacetobacter diazotrophicus và vi khuẩn hòa tan lân Pseudomonas stutzeri trên cây mía đường (Saccharum officinalis L.) trồng trên đất phèn tỉnh Long An. Tạp chí khoa học, Trường Đại học Cần Thơ 18b: 29-35. Cao Ngọc Điệp. 2011. Vi khuẩn nội sinh thực vật. Nxb. Trường Đại học Cần Thơ, trang 1 - 32. Đỗ Tất Lợi. 2006. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học. Hồ Thị Trường Thy, Nguyễn Nữ Trang Thùy và Võ Minh Sơn. 2011. Khảo sát một số đặc tính chủng Bacillus subtilis B20.1 làm cơ sở cho việc sản xuất probiotic phòng bệnh gan thận mủ do Edwardseilla ictaluti trên cá tra (Pangasius hypophthamus) nuôi thâm canh. Hội nghị Khoa học Thủy sản Toàn quốc lần thứ IV, 225-233. Chuyên ngành Vi sinh vật học 77 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Huỳnh Kim Diệu và Lê Thị Loan Em, 2011. Sự thuần chủng và hoạt tính kháng khuẩn của cây sống đời (Kalanchoe pinnata) và cây rau mương (Ludwigia hyssopifolia) ở đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí khoa học, Trường Đại học Cần Thơ 17b: 289-296. Huỳnh Kim Diệu, 2010. Hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh trên cá của một số cây thuốc nam ở đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí khoa học, Trường Đại học Cần Thơ 15b: 222-229. Lăng Ngọc Dậu, Nguyễn Thị Xuân Mỵ và Cao Ngọc Điệp. 2007. Khả năng cố định đạm , hòa tan lân và sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn Azospirillum lipoferum. Tuyển tập báo cáo Khoa học Hội nghị toàn Quốc 2007 Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Quy Nhơn 10-08-2007, NXB KH-KT, trang 445-448. Lê Thị Thanh Ren, 2010. Phân lập và định danh một số dòng vi khuẩn nội sinh trên cây mía trồng tại huyện Bình Đại - Tỉnh Bến Tre. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ chuyên ngành Sinh Thái học. Trường Đại học Cần Thơ. Lương Đức Phẩm. 2007. Chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản. NXB Nông nghiệp. Lương Mỹ Thuận. 2009. Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthamus). Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Bệnh học Thủy sản. Trường Đại học Cần Thơ. Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp. 2011. Phân lập và nhận diện vi khuẩn nội sinh trong cây cúc xuyên chi (Wedelia trilobata (L.) Hitche.). Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ 18a: 168-176. Ngô Minh Toàn. 2010. Phân lập và định danh một số dòng vi khuẩn nội sinh trên cây chuối trồng tại Vĩnh Long. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ chuyên ngành Sinh Thái học, Trường Đại học Cần Thơ. Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Thị Yến Ly và Huỳnh Xuân Phong, 2011. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn. Tạp chí khoa học, Trường Đại học Cần Thơ 19a: 176 - 184. Chuyên ngành Vi sinh vật học 78 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Nguyễn Hữu Hiệp, Phạm Thị Khánh Vân, Trần Văn Chiêu, Đào Thanh Hoàng và Nguyễn Khắc Minh Loan, 2005. Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn Azospirillum bằng kỹ thuật PCR. Tạp chí nghiên cứu khoa học, Trường Đại học Cần Thơ 4: 119-126. Nguyễn Hữu Hiệp. 2007. Giáo trình Cố Định Đạm Sinh Học. Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Lân Dũng (dịch). 1983. Thực hành vi sinh vật học. NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. Nguyễn Lân Dũng và Bùi Thị Việt Hà. 2009. Vi sinh vật học. Nxb. Giáo Dục, trang 50-65. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến và Phạm Văn Ty. 2007. Vi sinh vật học. Nxb. Giáo Dục, trang 8 - 9, 320 - 345. Nguyễn Như Thành. 1990. Vi sinh học công nghiệp. Nxb. Giáo Dục. Nguyễn Như Thanh. 2004. Vi sinh vật học đại cương. Nxb. Nông nghiệp, trang 93-98. Nguyễn Quỳnh Nam. 2006. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo. Luận văn Kỹ sư chuyên ngành Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Nông Lâm. Nguyễn Thanh Bình. 2013. Phân lập, tuyển chọn và nhận diện dòng vi khuẩn nội sinh ở cây dưa hấu trồng tại huyện Vũng Liêm – Tỉnh Vĩnh Long. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Thành Dũng, 2009. Phân lập những dòng vi khuẩn nội sinh trong cây khóm trồng ở huyện Vĩnh Thuận tỉnh Kiên Giang. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Thị Phương Tâm. 2006. Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn Azospirillum lipoferum trên cây bắp. Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Thị Thu Hà, Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp. 2009. Phân lập và đặc tính của những dòng vi khuẩn nội sinh trong một số cây cỏ chăn nuôi. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 7 (2): 241-250. Chuyên ngành Vi sinh vật học 79 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Nguyễn Trọng Thể. 2004. Chọn lọc và sử dụng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens để phòng trừ bệnh do nấm Rhizoctonia solani và Sclerotium rolfsii gây hại trên cây bông vải và cây cà chua. Luận văn thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, Đại học Nông lâm, TP. Hồ Chí Minh. Trần Cẩm Vân. 2004. Giáo trình vi sinh vật học môi trường. Nxb. Đại học Quốc gia Hà Nội. Trần Mỹ Xuyên. 2010. Phân lập và Nhận diện một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm có trong rễ, thân, lá hẹ và cây ngò gai trồng tại Vĩnh Long và Cần Thơ. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ chuyên ngành Sinh Thái học. Đại học Cần Thơ. Trương Thị Mỹ Duyên. 2009. Nghiên cứu kiểu plasmid và tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthamus). Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Bệnh học Thủy sản. Trường Đại học Cần Thơ. Tiếng Anh Ahmad F, Ahmad I and Khan MS. 2005. Indole acetic acid production by the indigenous isolates of Azotobacter and florescent Pseudomonas in the presence and absence of tryptophan. Turk J Bio 29:29-34. Ali M.S and Jahangir MA. 2002. Bis-bithiophene from Tridax procumbens L. (Asteraceae). Nat Prod Lett. 16(4):217-221. Ali M.S, Jahangir M, Hussain S and Choudhary M. 2002. Inhibition of a-glucosidase by oleanolic acid and its synthetic derivatives. Phytochemistry 60:295-299. Andrews JH. 1992. Biologycal control in the phyllosphere. Ann. Rev. Phytopathol. 30:603-635. Aniel Kumar O. and L. Mutyala Naidu. 2011. Antibacterial potential of Tridax procumbens agaisnt human pathogens. International Journal of Pharmaceutical Sciences 2:21-30. Arash Rafat, Koshy Philip and Sekaran Muniandy, 2011. A novel source of bioactive compounds: Endophytic bacteria isolated from Centella asiatica. Journal of Pure and Applied Microbiology 6: 1-9. Chuyên ngành Vi sinh vật học 80 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Aravind.R.A, Kumar.S.J, Eapen and K.V. Ramana, 2009. Endophytic bacterial flora in root and stem tissues of black pepper (Piper nigrum L.) genotype isolation identification and evaluation against Phytophthora capsici. Letters in Applied Microbiology 48: 58-64. Artidtaya Bhoonobtong, Sasiphimol Sawadsitang, Sirirath Sodngam and Wiyada Mongkolthanaruk. 2012. Characterization of Endophytic Bacteria, Bacillus amiloliquefaciens for antimicrobial Agents Production. International Proceedings of Chemical, Biological and Environmenta 40:6-11. Bashan Y. 1986. Significance of timing and level of inoculation with rhizosphere bacteria on wheat plants. Soil Biol Biochem 18:297-301. Becking JH. 1963. Fixation of molecular nitrogen by an aerobic Vibrio or Spirillum. Antonie Van Leeuwenhoek 29:326. Benhamou N, Kloepper JW and Quadi-Hallman A. 1996. Induction of defence ralated ultrastructural modifications in pea root tissues inoculated with endophytic bacteria. Plant Physiol 112:919-929. Berg G, Elbert L and Hartmann A. 2005. The rhizosphere as a resevoir for oppturnistic human pathogenic bacteria. Environ Microbiol 7:1673-1685. Berg.Howard R..Max E. Tyler. Norman J.Novick. Vimla Vasil. and Indra K. Vasil, 1980. Biology of Azospirillum-sugarcane association: enhancement of nitrogenase Activity. Appl Environ Microbiol, 39: 642-649. Biswas.J.C..J. K. Ladha. and F.B. Dazzo, 2000. Rhizobia inoculation improves nutrient uptake and growth of lowland rice. Soil Science Society of America Journal 64: 1644-1650. Boddey RM, Oliveira OCD, Urquiaga S, Reis VM, Olivares FL, Baldani VLD and Dobereiner J. 1995. Biological nitrogen fixation associated with sugar cane and rice: Contributions and prospects for improvement. Plant and Soil 174:17091713. Broek.A.Vande and Vanderleyden J., 1995. Genetics of the Azospirillum –plant root association. Critical Reviews in Plant Sciences 14: 445-466. Chuyên ngành Vi sinh vật học 81 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Brown ME. 1976. Role of Azotobacter paspali in association with Paspalum notatum. J Appl Bacteriol 40:341-348. Caballero-Mellado J, Martinez-Aguilar L, Paredes-Valdez G and Estrada PDLS. 2004. Burkholderia unamae sp. nov., an N2-fixing rhizospheric and endophytic. Int J Syst Evol Microbiol 54:1165-1172. Caballero-Mellado MJ, Lemus JO, Santos PE and Aguilar LM. 2007. The tomato rhizosphere, an enviroment rich in nitrogen-fixing Burkholderia species with capabilities of interest for agriculture and bioremediation. Appl Environ Microbiol 73:5308-5319. Chaintreuil C, Giraud E, Prin Y, Lorquin J, Bâ A, Gillis M, de Lajudie P and Dreyfus B. 2000. Photosynthetic bradyrhizobia are natural endophytes of the African wild rice Oryza breviligulata. Appl Environ Microbiol 66:5437-5447. Chauhan B S and Germination D E. 2008. Ecology of Two Troublesome Asteraceae Spieces of Rainfed Rice: Siam Weed (Chromolaena odorata) and Coat Buttons (Tridax procumbens). Johnson Weed Science 56:567-573. Chen C, Bauske EM, Musson G, Rodriguezkabana R and Kloepper JW. 1995. Biological control of Fusarium Wilt on cotton by use of endophytic bacteria. Bio. Control 5:83-91. Chen, Wen-Hao, Ma, Xing-Ming, Wu, Quan-Xiang, Shi and Yan-Ping. 2008. Chemical constituent diversity of Tridax procumbens. Canadian Journal of Chemistry 86(9):892-898 (7). Cleidson Valgas, Simone Machado de Souza, Elza FA Smânia and Artur Smânia Jr. 2007. Screening methods to determine antibacterial activity of natural products. Brazillian Journal of Microbiology 38:369-380. Coenye T and Vandamme P. 2003. Diversity and significance of Burkholderia species occupying diverse ecological niches. Environ Microbiol 5:719-129. Cui L, Sun Z, Sun F, Yuan J, Tian H, Wang L and Xu H. 2003. Isolation of endophytic bacteria from potato and selection of antagonistic bacteria to potato ring rot disease. Acta Phytopathol. Sinica 33:353-358. Chuyên ngành Vi sinh vật học 82 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Döbereiner J and Day J.M. 1976. Associative symbiosis in tropical grasses: characterization of Microorganisms and dinitrogen fixing sites. In: Proceedings of the First International Symposium on Nitrogen Fixation. Edited by W.E Newton and C.J Nyman. Washington State University Press, Pullman, Wash. pp:518-538. Döbereiner J. 1974. History and new perspectives of diazotrophs in association with non-leguminous plants. Symbosis 13:1-13. Dowler WM and Weaver DJ. 1974. Isolation and characterization of flourescent Pseudomonas from apparently healthy peach trees. Phytopathology 65:233-236. Duijff BJ, Gianinazzi-Pearsonad V and Lemanceau P. 1997. Involvement of the outer membrane lipopolysaccharides in the endophytic colonization of tomato roots by biocontrol Pseudomonas fluorescens strain WC417r. New Phytol 135:325-334. Elbeltagy, A., Nishioka, K., Sato, T., Suzuki, H., Ye, B., Hamada, T., Isawa, T. and Mitsui, H., 2001. Endophytic Colonization and In Planta Nitrogen Fixation by Herbaspirillum sp. Isolated from Wild Rice Species. Applied and Environmental Microbiology 67 (11):5285-5293. Elberltagy A, Nishioka K, Sato T, Suzuki H, Ye B, Hamada T, Isawa T, Mitsui H and Minamisawa K. 2001. Endophytic colonization and in planta nitrogen fixation by a Herbaspirillum sp. isolation from wide rice species. Appl Environ Microbiol 38:5285-5293. Elmerich C. 2007. Historical perspective: From bacterization to endophytes. In Associative and Endophytic Nitrogen-fixing Bacteria and Cyanobacterial Associations, 1-20. G.M Nazeruddin, Shirish S. Pingale and Samir S. Shaikh. 2011. Pharmacologycal review of Tridax procumbens L. Der Pharmacia Sinica 2(4):172-175. Ganju Kuldeep and Pathak A.K. 2013. Pharmacognostic and Phytochemical Evaluation of Tridax procumbens Linn. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 1(5):42-46. Chuyên ngành Vi sinh vật học 83 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Glickmann E, Gardan L, Jacquet S, Hussain S, Elasri M, Petit A and Desseaux Y. 1998. Auxin Production is a common feature of most pathovars of Pseudomonas syringae. Molecular Plant-Microbe Interactions 11:156-162. Hallmann J, Quadt- Hallmann A, Mahaffee WF, Kloepper JW. 1997. Bacterial endophytes in agricultural crops. Can J Microbiol 43:895-914. Hallmann J. 2001. Plant Interactions with Endophytic bacteria, In: Biotic Interaction in Plant Pathogen, Jerger, Spence, pp. 80-120. Harari A, Kigel J and Okon Y. 1988. Involvement of IAA in the interaction between Azospirillum brasilense and Panicum miliaceum roots. Plant and Soil 110:275282. Hardoim, PR., van Overbeek, LS., van Elsas, JD. 2008. Properties of bacterial endophytes and their proposed role in plant growth. Trends Microbiol 16:463471. Harris GH, Hesterman OB, Paul EA, Peters SE and Jahnke RR. 1994. Fate of Legume and Fertilizer Nitrogen-15 in a Long-Term Cropping Systems Experiment. Agron. J. 86:910-915. Hill S, Drozd JW and Postgate JR. 1972. Enviromental effects on the growth of nitrogen-fixing bacteria. J App Chem Biotechnol 22:54-58. Hira Muzzamal, Rabbia Sarwar, Imran Sajid and Shahida Hasnain, 2012. Isolation, Identification and Screening of Endophytic Bacteria Antagonistic to Biofilm Formers. Deparment of Microbiology and Molecular Genetics 44 (1):249 -257. Hung PQ and Annapurna K. 2004. Isolation and characterization of endophytic bacteria in soybean (Glycine sp.). Omonrice 12:92-101. Hurek T, Burgagraf S, Woese CR and Reinhold-Hurek B. 1993. 16S rRNA-targeted polymerase chain reaction and oligonucleotide hybridization to screen for Azoarcus spp., grass-associated diazotrophs. Appl Environ Microbiol 59:38163824. Chuyên ngành Vi sinh vật học 84 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hurek T, Reinhold-Hurek B, Montagu MV and Kellenberger E. 1994. Root colonization and systemic spreding of Azoarcus sp. BH72 in grasses. J of Bacteriol 176:1913-1923. Hwangbo H, Park RD, Kim YW, Rim YS, Park KH, Kim TH, Suh JS and Kim KY. 2003. 2-ketogluconic acid production and phosphate solubilization by Enterobacter intermedium. Cur Microbiol 47:87-92. I.E. Luis- Villaseñor, A. L. Campa- Córdova and F.J. Ascencio-Valle. 2012. Probiotic in Larvae and Juvenile Whiteleg Shrimp Litopenaeus vannamei. Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste S.C 27: 601-622. Jain Ankita and Amita Jain. 2012. Tridax procumbens (L.): A weed with icmense medicinal importance: A review. International Journal of Pharma and Bio Sciences 3(1):544-552. Jha PN and Kumar A. 2007. Endophytic colonization of Typha australis by a plant growth-promoting bacterium Klebsiella oxytoca strain GR-3’’. JI of Appl Microbiol 25:1364-5072. Jude C. lkeuwunchi, Catherine C. lkeuwunchi and Ngozi gboh M. I. 2009. Chemical profile of Tridax procumbens Linn. Pakistan Journal of Nutrition 8(5):548-550. Khalil S and Mandurah HM. 1989. Growth and metabolic changes of cowpea plants as effected by water deficiency and indole acetic acid. Agro Crop Sci 163:160-166. Kloepper JW and Beauchamp CJ. 1992. A review of issues related to measuring colonization of plant roots by bacteria. Can J Microbiol 38: 1219-1232. Kloepper JW, Schippers B and Bakker PAM. 1992. Proposed elimination of the term endozhizosphere. Phytophathology 82:726-727. Kobayashi DY and Palumbo JD. 2000. Bacterial endophytes and their effects on plants and uses in agriculture. Microbial Endophytes 3:199-213. Koga J, Adachi T and Hidaka H. 1991. Molecular cloning of the gene for indolepyruvate decarboxylase from Enterobacteria cloacae. Mol Gen Genet 226:10-16. Chuyên ngành Vi sinh vật học 85 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Kuiper I, Lagendijk EL, Bloemberg GV and Lutenberg BJ. 2004. Rhizoremediation: a beneficial plant-microbe interaction. Mol Plant Microbe Interact 17:6-15. Lata H, Lil XC and Siva B. 2006. Identification of IAA - producing endophytic bacteria from micropropagated Echinacea plants using 16S rRNA sequencing. Tissue and Organ Culture 85:353-9. Lindow SE and Brandt MT. 2003. Microbiology of phyllosphere. Appl Environ Microbiol 69:1875-1883. Lodewyckx C, Vangronsveld I, Porteous F, Moore ERB, Taghavi S, Mazgeay M, and van der Lelie D. 2002. Endophytic bacteria and their potential application. Crit Rev Plant Sci 21:583-606. Lü ZX and Song W. 2011. Research of indole-3-acetic acid biosynthetic pathway of Klebsialla oxytoca SG-11 by HPLC and GC-MS. Se Pu 18(4):328. M. K. Oladunmoye. 2006. Immunodulatory effects of ethanolic extract of Tridax procumbens on swiss Albino rats orogastrically dosed with Pseudomonas aeruginosa (NCBI 950). International Journal of Tropical Medicine 1(4):152155. Mahafee WF and Kloepper JW. 1997. Bacterial communication of the rhizosphere and endorhiza associated with field-grown cucumber plants inoculated with a plant growth-promoting rhizobacterium of its genetically modified derivative. Can J Microbiol 43:344-353. Mahato R.B. and Chaudhary R.P. 2005. Ethnomedicinal study and antibacterial activities of selected plants of Palpa district, Nepal. Scientific World 3(3):26-31. Mano H and Morisaki H. 2008. Endophytic Bacteria in the Rice Pkant (Minireview). Microbes Environ 23(2):109-117. Martinez-Aguilar L, Diaz R, Pena-Cabriales JJ, Estrada PDLS, Dunn MF, CaballeroMellado J. 2008. Multichromosomal genome structure and confirmation of diazotrophy in novel plant-associated Burkholderia Species. Environ Microbiol 74:4574-4579. Chuyên ngành Vi sinh vật học 86 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Mirac Yilmaz, Haluk Soran and Yavuz Beyalti. 2006. Antimicrobial activities of some Bacillus spp. Strains isolated from the soil. Microbial. Res. 161: 127-131. Mounlin L, Munive A, Dreyfus B and Biovin-Masson C. 2001. Nodulation of legumes by members of the β-subclass of proteobacteria. Nature 411:948-950. Muthukumarasamy RI, Revathi G, Seshadri S and Lakshminarasimhan C. 2002b. Gluconacetobacter diazotrophicus (syn. Acetobacter diazotrophicus), a promising diazotrophic endophyte in tropics. Current Science 83:137-145. N. E. Welker and L. Leon Campbell. 1967. Unrelatedness of Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology 94(4):11241130. Okon Y and Labandera-Gonzalez CA. 1994. Agonomic applicationstion of Azospirillum an evaluation of 20 years worldwide field inoculation. Soils Bio Biochem 26:1591-1601. Osullivan LA, Mahenthiralingam E. 2005. Biotechnological potential within the genus Burkholderia. Lett Appl Microbial 41:8-11. Paulsen IT, Press CM, Ravel J, Kobayashi DY, Myers GS, Mavrodi DV, DeBoy RT, Seshadri R, Ren Q, Madupu R, Dodson RJ, Durkin AS, Brinkac LM, Daugherty SC, Sullivan SA, Rosovitz MJ, Gwinn ML, Zhou L, Schneider DJ, Cartinhour SW, Nelson WC, Weidman J, Watkins K, Tran K, Khouri H, Pierson EA, Pierson LS 3rd, Thomashow LS and Loper JE. 2005. Complete genome sequence of the plant commensal Pseudomonas fluorescens Pf-5. Nat Biotechnol 23(7):873-878. Persello-Cartieaux F, Nusaume L and Robaglia C. 2003. Tales from the underground: molecular plantrhizobacteria interactions. Plant Cell and Environment 26:189199. Pillay VK and Norwak J. 1997. Inoculum density, temperature, and gennotype effects on in vitro growth promotion and epiphytic and endophytic colonization of tomato (Lycospersicon esculentum L.) seedlings inoculated with a pseudomonad bacterium. Can J Microbiol 43:354-361. Chuyên ngành Vi sinh vật học 87 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Quispel A. 1992. A search of signal in endophytic microorganisms, In: Verma, DPS (Eds.) Molecular Signals in Plant-Microbe Communication, CRS Press, Boca Raton, FL, 457-491. Raddadi N, Cherif A and Boudabous A. 2008. Screening of plant growth promoting traist of Bacillus thuringensis. Ann Microbiol 58:47-52. Raju T S and Davidson E A. 1994. Structural feature of water soluble novel polysaccharide components from leaves of Tridax procumbens Linn 258:243254. Rangarajan S, Saleena LM, Vasudevan P and Nair S. 2003. Biological suppression of rice diseases by Azospirillum under saline soil condition. Plant Soil 251:73-82. Reddy Setharami TVV, Prasanthi S and Naidu Ramarao BVA. 2006. Traditional phytherapy for jaundice in Herbal Medicine (Ed). PC Trivedi Aavishkar Publishers, 30-68. Reinhold B, Hurek T, Fendrik I, Pots B, Gillis M, Kersters M, Thielemans S and Deley J. 1987. Azospirillum halopraleferens sp. nov., a nitrogen-fixing organism associated with the roots of Kallar grass (Leptochloa fusca L.Kurth). Int J Syst Bacteriol 37:43-51. Reinhold B, Hurek T, Neimann EG and Fendrik K. 1986. Close association of Azospirillum and diazotrophic rods with different root zones of Kallar grass. Appl Environ Microbiol 52:520-526. Reinhold-Hurek B and Hurek T. 1988. Life in grasses: Diazotrophic endophytes. Trend Microbiol 6:139-144. Reva O. N., Dixelius C., Meijer J. and Friest F. G. 2004. Taxonomic characterization and plant colonizing abilities of some bacteria related to Bacillus amylolyquefaciens and Bacillus subtilis. FEMS Microbio. Eco. 48(2):249-259. Rong-lin He, Guo-ping Wang, Xiao-Hong Liu, Chu-long Zhang and Fu-cheng Lin. 2009. Antagonistic bioactivity of an endophytic bacterium isolated from Epimedium brevicornu Maxim. African Journal of Biotechnology 8 (2):191-195. Chuyên ngành Vi sinh vật học 88 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Roos LCM and Hattingh MJ, 1983. Scanning electron microscopy of Pseudomonas syringae Pv. Morspunorum on sweet cherry leaves. Phytopathol Z 108: 18-25. Roos LMM, Hattingh MJ. 1983. Scanning electron microscopy of Pseudomonas syringae pv. morsprunorum on sweet cherry leaves. Phytopathol Z 108:18-25. Rovira A.D, Graham R.D and Ascher J.S. 1983. Reduction in infection of wheat roots by Gaeumanomyces graminis var. tritici with application of manganese to soil. In: Parker C.A., Rovira A.D, Moore K.J, Wong P.T.W, Kollmorgen J.F (Eds.), Ecology and Management of Soilborne Plant Pathogens. APS, Minneapolis, USA. Runsheg Xu, Jing Zhang and Ke Yuan. 2010. Two flavones from Tridax procumbens Linn. Molecules 15:6357-6364. Ryan, RP, Germaine K, Franks A, Ryan DJ, Dowling DN. 2008. Bacterial endophytes: recent development and applications. MEMS Microbiol. Lett., 1-9. Saini A, Wadhwani C, Kaur B and Malik C P. 2008. Tissue cuture studies in Tridax procumbens. Journal Plant Sciences 24:85-88. Salme Timmusk, Nina Grantcharova, E. Gerhart and H. Wagner. 2005. Paenibacillus polymyxa Invades Plant Roots and Forms Biofilms. Applied and Environmental Microbiology, 71 (11): 7292- 7300. Scarpella E, Rueb S and Meijer AH. 2003. The Radicleless gene is required for vascular pattern formation in rice. Development 130:645-658. Schultz B and Boyle C. 2005. The endophytic continuum, Mycol Res 109:661-686. Seshadri S, Muthurumarasamy R, Laksminarasimha C and Ignacirunthu S. 2000. Solubilization of inorganic phosohates by Azospirillum halopraeferans. Current Science 79:565-567. Sheng Qin, Jie Li, Hua Hong Chen, Guo Zhen Zhao, Wen Yong Zhu, Cheng Lin Jiang, Li Hua Xu and Wen Jun Li. 2009. Isolation, Diversity, and Antimicrobial Activity of Rare Actinobacteria from Medicinal Plants of Tropical Rain Forests in Xishuangbanna, China. Applied and Environmental Microbiology, 75 (19): 6176- 6186. Chuyên ngành Vi sinh vật học 89 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Siciliano SD, Fortin N, Mihoc A, Wisse G, Labelle S, Beaumier D, Oulettette D, Roy R, Whyte LG, Banks MK, Schwab P, Lee K and Greer CW. 2001. Selection of specific endophytic bacterial genotypes by plants in response to soil contamination. Appl Environ Microbiol 67:2469-2475. Singh K and Ahirwar V. 2010. Acute and chronic toxicity study of Tridax procumbens on haemoglobin percent and blood sugar level of sprague dawley rats. IJPI’s Journal of Pharmacology and Toxicology 1(1):1-6. Sneha Mundada and Ruchi Shivhare. 2010. Pharmacology of Tridax procumbens a Weed: Review. International Journal of PharmTech Research 2(2):1391-1394. Somers E, Patcek D, Gysegom P, Srinivasan M and Vanderleyden J. 2005. Azospirillum brasilense produces the auxin-like phenylacetic acid by using the key enzyme for indole-3-acetic acid biosynthesis. Appl Environ Microbiol 71:1803-1810. Sprent JI and James EK. 1995. N2-fixation by endophytic bacteria, Springer-Verlag, Berlin, 15-30. Stein T, Heinzmann S, Düsterhus S, Borchert S and Entian K.D. 2005. Expression and functional analysis of subtilin immunity genes spalFEG in the subtilin-sensitive host Bacillus subtillis MO1099. J Bacteriol 187:822-828. Strauch M. A., Bobay B. G., Cavanagh J., Yao F., Wilson A. and Breton Y. L. 2007. Abh and AbrB Control of Bacillus subtilis antimicrobial gene expression. J. Bacteriol 189(21):7720-7732. Strobel G. 2003. Endophytes as source of bioactive products. Microbes and Infection 5: 535-544. Sturz AV, Christie BR, Nowak J. 2000. Bacterial endophytes: potential role in developing sustainable systems of crop production. Crit. Rev. Plant. Sci. 19:1-30. Subramanian SS, Ramakrishnan S and Nair AGR. 1968. Isolation of luteolin and glucolutyeolin from the flowers of Tridax procumbens. Curr. Sci. 37:465-469. Chuyên ngành Vi sinh vật học 90 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Sudipta Roy and Debdulal Banerjee. 2010. Isolation of antimicrobial compound by endophytic bacteria from Vinca rosea. International Journal of Current Research 5:47-51. Swetha Sunkar and C Valli Nachiyar. 2012. Biogenesis of antibacterial silver nanoparticles using the endophytic bacterium Bacillus cereus isolated from Garcinia xanthochymus. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 2 (12): 953- 959. Syed Baker and Sreedharamurthy Satish. 2013. Bioprospecting of endophytic bacterial plethora from medicinal plants, Plants Sciences Feed 3(3): 42 - 45. Syed Mohd. Danish Rizvi, Mohd. Zeeshan, Salman Khan, Deboshree Biswas, Othman A. Al-Sagair and Jamal M. Arif. 2011. Evaluation and distribution of antibacterial potential in the aerial part of wild Tridax procumbens. J. Chem. Pharm. Res. 3(2): 80-87. Taddei A and Rosas-Romero AJ. 2000. Bioactivity studies of extracts from Tridax procumbens. International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology 7(3):235-238. Tan Z, Hurek T, Reinhold-Hurek B. 2003. Effect of N-fertilizer, plant genotype and environmental conditions on nifH gene pools in roots of rice. Environ Microbiol 5:1009-1015. Tarrand JJ, Krieg NR and Dobereiner J. 1978. A taxonomy study of Spirillum lipoferum group with descriptions of a new genus. Azospirillum lipoferum (Beijerinck) comb. nov. and Azospirillum brasilense sp. nov. Canadian J Microbiol 24:967-980. U. Tiwari, B. Rastogi, P. Singh, D. K. Saraf and S. P. Vyas. 2004. Immunodulatory effects of aqueous extract of Tridax procumbens in experimental animals. Journal of Ethnopharmacology 92:113-119. V. Bharathi, B. Varalakshmi, S. Gomathi, A. Shanmuga Priya and T. Karpagam. 2012. Antibacteria activity of Tridax procumbens Linn. International Journal of Pharma Sciences and Research 3(4):364-367. Chuyên ngành Vi sinh vật học 91 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT V. Bharathi, B. Varalakshmi, S. Gomathi, A. ShanmugaPriya, T. Karpagam. 2012. Antibacterial activity of Tridax procumbens Linn. International Journal of Pharma Sciences and Research 3(4):364-367. Van, T.V., S. Ngoke, O. Berge, D. Faure, R. Bally, P. Hebbar and T. Heulin. 1997. Isolation of Azospirilium lipoferum from the rhizosphere of rice by a new, simple method. Can. J. Microbiol 43: 486-490. Vande Broek A, Lambrecht M, Eggermont K and Vanderleyden J. 1999. Auxins upregulate expression of the indole-3-pyruvate decarboxylase gene in Azospirillum brasilense. J Bacteriol 181:1338-1342. Vasuvat, Y., B. Fangcham, S. Siripin, D. Fusang and P. Chanaram.1986. Yield maximization of feed grain by associative N2-fixing bacteria. In: Proceedings of International Serminar on Yield Maximization of Feed Grains Through Soil and Fertilizer Management 12-16. Verma R.k and Gupta M.M. 1998. Lipid constituents of Tridax procumbens. Phytochemistry 27(2):459-163. Vichai Domrongpokkaphan and Penkhae Wanchaitanawong. 2006. In vitro Antimicrobial Activity of Bacillus spp. Agaisnt Pathogenic Vibrio spp. In Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon). Kasetsart J. (Nat. Sci.) 40(4): 949-957. Wellington B, Marcela TB. 2004. Delivery methods for introducing endophytic bacteria into maize. Bio. Control 49:315-322. Yoga Latha L, Darah I, Sasidharan S and Jain K, 2009. Antimicrobial Activity of Emilia sonchifolia DC., Tridax procumpens L. and Vernonia cinerea L. of Astera Familly: Potential as Food Preservatives. Mal J Nutr 15 (2): 223-231. Zinniel KD, Lambrecht P, Haris NB, Feng Z, Kuczmarski D, Higley P, Ishimaru C, Arunakumari A, Barletta GR and Vidaver AK. 2002. Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants. Appl Environ Microbiol 59:2198-2208. Zinniel KD, Lambrecht P, Haris NB, Feng Z, Kuczmarski D, Higley P, Ishimaru C, Arunakumari A, Barlertta GR, Vidaver AK. 2002. Isolation and characterization Chuyên ngành Vi sinh vật học 92 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants. Appl Environ Microbiol 59:2198-2208. Trang Web http://duybiotech.wordpress.com/2010/12/22/vi-khu%E1%BA%A9nn%E1%BB%99i-sinh-th%E1%BB%B1c-v%E1%BA%ADt-endophytic-bacteria%E1%BB%A9ng-d%E1%BB%A5ng-va-d%E1%BB%8Bnhh%C6%B0%E1%BB%9Bng-phat-tri%E1%BB%83n-trong-th%E1%BB%9Did%E1%BA%A1i-ngay-nay/ (ngày 9/7/2013) http://duoclieu.net/caythuocvn2.html (ngày 9/7/2013) http://sieuphanbon.com/detail.php?id=108&lg=1 (ngày 9/7/2013) http://vi.wikipedia.org/wiki/C%E1%BA%A7n_Th%C6%A1 (ngày 26/7/2013) http://125.235.10.97/opacdigital/wpDetail.aspx?Id=3971 (ngày 02/08/2013) http://www.journalcra.com/?q=node/198 (ngày 03/8/2013) http://forum.bacsi.com/cay-thuoc-nam/cuc-mui-94144.html (ngày 03/8/2013) http://www.freshfromflorida.com/pi/weed-of-the-month/0509-tridax-procumbens.html (ngày 03/8/2013) https://en.wikipedia.org/wiki/Tridax_procumbens (ngày 03/8/2013) http://www.sciencedomain.org/abstract.php?iid=234&id=14&aid=1608#.UfIK5IVPTn (ngày 03/8/2013) http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_amyloliquefaciens (ngày 03/8/2013) http://en.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli (ngày 03/8/2013) http://duoclieu.net/caythuocvn2.html (ngày 20/8/2113) http://cantho.gov.vn (ngày 23/11/2013) http://danhydatviet.vn/vi/news/Duoc-lieu/Cuc-mui-5441/( ngày 24/11/2013) http://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas (ngày 24/11/2013) http://microbewiki. kenyon.edu/index.php/Pseudomonas_fluorescens (ngày 24/11/2013). http://en.wikipedia.org/wiki/Klebsiella (ngày 24/11/2013) http://en.wikipedia.org/wiki/Enterobacter (ngày 24/11/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 93 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bacillus_amyloliquefaciens (ngày 25/11/2013) http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=1691 (ngày 25/11/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 94 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết quả thí nghiệm. 1. Kết quả khảo sát hàm lượng ammonium được tạo ra do các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA. Bảng 15. Giá trị OD và lượng đạm của vi khuẩn trên môi trường NFb sau 1 giờ chủng Dòng vi khuẩn R1 R2 R5 R6 R7 R8 T1 T2 T3 T4 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 OD 1 0,021 0,024 0,022 0,029 0,023 0,03 0,025 0,024 0,027 0,029 0,03 0,024 0,03 0,023 0,02 0,032 0,021 Đạm 1 (µg/ml) 0,006 0,026 0,013 0,058 0,019 0,065 0,032 0,026 0,045 0,058 0,065 0,026 0,065 0,019 0 0,077 0,006 OD 2 0,02 0,022 0,021 0,027 0,025 0,028 0,025 0,023 0,027 0,03 0,03 0,026 0,027 0,024 0,022 0,032 0,022 Đạm 2 (µg/ml) 0 0,013 0,006 0,045 0,032 0,052 0,032 0,019 0,045 0,065 0,065 0,039 0,045 0,026 0,013 0,077 0,013 OD 3 0,02 0,025 0,021 0,028 0,026 0,028 0,026 0,022 0,03 0,029 0,03 0,024 0,028 0,023 0,022 0,032 0,022 Đạm 3 (µg/ml) 0 0,032 0,006 0,052 0,039 0,052 0,039 0,013 0,065 0,058 0,065 0,026 0,052 0,019 0,013 0,077 0,013 Bảng 16. Giá trị OD và lượng đạm của vi khuẩn trên môi trường NFb ở ngày 2 sau khi chủng Dòng vi khuẩn R1 R2 R5 R6 R7 R8 T1 T2 T3 T4 L1 L2 L3 L4 L5 OD 1 0,019 0,016 0,018 0,022 0,017 0,02 0,017 0,018 0,021 0,017 0,018 0,02 0,02 0,019 0,019 Chuyên ngành Vi sinh vật học Đạm 1(µg/ml) 0,105 0,081 0,097 0,129 0,089 0,113 0,089 0,097 0,121 0,089 0,097 0,113 0,113 0,105 0,105 OD 2 0,022 0,017 0,017 0,021 0,016 0,019 0,017 0,02 0,022 0,017 0,022 0,022 0,022 0,022 0,023 Đạm 2 (µg/ml) 0,129 0,089 0,089 0,121 0,081 0,105 0,089 0,113 0,129 0,089 0,129 0,129 0,129 0,129 0,137 OD 3 0,021 0,016 0,018 0,023 0,018 0,018 0,017 0,02 0,023 0,016 0,02 0,02 0,021 0,019 0,021 Đạm 3 (µg/ml) 0,121 0,081 0,097 0,137 0,097 0,097 0,089 0,113 0,137 0,081 0,113 0,113 0,121 0,105 0,121 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 L6 L7 0,02 0,022 0,113 0,129 Trường ĐHCT 0,024 0,019 0,145 0,105 0,024 0,021 0,145 0,121 Bảng 17. Giá trị OD và lượng đạm của vi khuẩn trên môi trường NFb ở ngày 4 sau khi chủng Dòng vi khuẩn R1 R2 R5 R6 R7 R8 T1 T2 T3 T4 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 OD 1 0,017 0,017 0,018 0,027 0,02 0,024 0,023 0,022 0,027 0,018 0,022 0,023 0,024 0,027 0,027 0,028 0,026 Đạm 1 (µg/ml) 0,143 0,143 0,15 0,218 0,165 0,195 0,188 0,18 0,218 0,15 0,18 0,188 0,195 0,218 0,218 0,226 0,211 OD 2 0,019 0,018 0,02 0,026 0,021 0,023 0,026 0,021 0,028 0,018 0,024 0,024 0,025 0,026 0,026 0,026 0,026 Đạm 2 (µg/ml) 0,158 0,15 0,165 0,211 0,173 0,188 0,211 0,173 0,226 0,15 0,195 0,195 0,203 0,211 0,211 0,211 0,211 OD 3 0,018 0,018 0,018 0,027 0,02 0,025 0,025 0,024 0,027 0,019 0,022 0,025 0,028 0,027 0,026 0,028 0,025 Đạm 3 (µg/ml) 0,15 0,15 0,15 0,218 0,165 0,203 0,203 0,195 0,218 0,158 0,18 0,203 0,226 0,218 0,211 0,226 0,203 Bảng 18. Giá trị OD và lượng đạm của vi khuẩn trên môi trường NFb ở ngày 6 sau khi chủng Dòng vi khuẩn R1 R2 R5 R6 R7 R8 T1 T2 T3 T4 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 OD 1 Đạm 1 (µg/ml) OD 2 Đạm 2 (µg/ml) OD 3 Đạm 3 (µg/ml) 0,026 0,015 0,016 0,025 0,018 0,017 0,023 0,025 0,027 0,015 0,02 0,021 0,022 0,028 0,029 0,024 0,021 0,128 0,028 0,037 0,119 0,055 0,046 0,101 0,119 0,138 0,028 0,073 0,083 0,092 0,147 0,156 0,11 0,083 0,025 0,016 0,017 0,024 0,02 0,018 0,023 0,024 0,026 0,015 0,023 0,019 0,019 0,031 0,026 0,026 0,023 0,119 0,037 0,046 0,11 0,073 0,055 0,101 0,11 0,128 0,028 0,101 0,064 0,064 0,174 0,128 0,128 0,101 0,026 0,015 0,017 0,026 0,018 0,021 0,021 0,024 0,03 0,017 0,023 0,022 0,022 0,029 0,024 0,026 0,021 0,128 0,028 0,046 0,128 0,055 0,083 0,083 0,11 0,165 0,046 0,101 0,092 0,092 0,156 0,11 0,128 0,083 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2. Kết quả khảo sát hàm lượng IAA được tạo ra do các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA. Bảng 19. Giá trị OD và lượng IAA của vi khuẩn trên môi trường NFb khi không bổ sung Tryptophane ở ngày 2 Dòng vi khuẩn OD 1 IAA 1 (µg/ml) OD 2 IAA 2 (µg/ml) OD 3 IAA 3 (µg/ml) R1 0,047 8,25 0,049 8,75 0,047 8,25 R2 R5 0,05 0,065 9 12,75 0,05 0,062 9 12 0,052 0,064 9,5 12,5 R6 R7 0,04 0,042 6,5 7 0,038 0,042 6 7 0,04 0,043 6,5 7,25 R8 T1 0,053 0,051 9,75 9,25 0,05 0,052 9 9,5 0,054 0,049 10 8,75 T2 T3 0,052 0,043 9,5 7,25 0,053 0,046 9,75 8 0,053 0,043 9,75 7,25 T4 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 0,039 0,038 0,045 0,038 0,032 0,045 0,029 0,04 6,25 6 7,75 6 4,5 7,75 3,75 6,5 0,035 0,034 0,042 0,041 0,036 0,041 0,03 0,04 5,25 5 7 6,75 5,5 6,75 4 6,5 0,038 0,039 0,041 0,043 0,035 0,045 0,03 0,038 6 6,25 6,75 7,25 5,25 7,75 4 6 Bảng 20. Giá trị OD và lượng IAA của vi khuẩn trên môi trường NFb khi không bổ sung Tryptophane ở ngày 4 Dòng vi khuẩn OD 1 IAA 1 (µg/ml) OD 2 IAA 2 (µg/ml) OD 3 IAA 3 (µg/ml) R1 R2 R5 R6 R7 R8 T1 T2 T3 T4 L1 L2 L3 L4 0,09 0,089 0,087 0,085 0,083 0,079 0,078 0,081 0,072 0,076 0,083 0,061 0,083 0,059 14,33 14,17 13,83 13,5 13,17 12,5 12,33 12,83 11,33 12 13,17 9,5 13,17 9,17 0,09 0,085 0,085 0,081 0,08 0,081 0,077 0,081 0,075 0,08 0,08 0,064 0,085 0,061 14,33 13,5 13,5 12,83 12,67 12,83 12,17 12,83 11,83 12,67 12,67 10 13,5 9,5 0,093 0,084 0,092 0,089 0,079 0,079 0,076 0,085 0,077 0,078 0,079 0,061 0,093 0,058 14,83 13,33 14,67 14,17 12,5 12,5 12 13,5 12,17 12,33 12,5 9,5 14,83 9 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT L5 0,08 12,67 0,079 12,5 0,076 12 L6 L7 0,098 0,087 15,67 13,83 0,095 0,086 15,17 13,67 0,087 0,09 13,83 14,33 Bảng 21. Giá trị OD và lượng IAA của vi khuẩn trên môi trường NFb khi không bổ sung Tryptophane ở ngày 6 Dòng vi khuẩn OD 1 IAA 1(µg/ml) OD 2 IAA 2 (µg/ml) OD 3 IAA 3 (µg/ml) R1 R2 R5 R6 0,04 0,04 0,052 0,015 12,33 12,33 16,33 4 0,036 0,035 0,053 0,019 11 10,67 16,67 5,33 0,035 0,03 0,054 0,018 10,67 9 17 5 R7 R8 0,04 0,032 12,33 9,67 0,045 0,031 14 9,33 0,043 0,027 13,33 8 T1 T2 T3 T4 L1 L2 L3 L4 0,013 0,031 0,02 0,013 0,029 0,025 0,028 0,03 3,33 9,33 5,67 3,33 8,67 7,33 8,33 9 0,016 0,027 0,018 0,012 0,032 0,023 0,026 0,028 4,33 8 5 3 9,67 6,67 7,67 8,33 0,015 0,03 0,018 0,01 0,031 0,02 0,029 0,026 4 9 5 2,33 9,33 5,67 8,67 7,67 L5 L6 L7 0,022 0,04 0,041 6,33 12,33 12,67 0,024 0,039 0,037 7 12 11,33 0,024 0,039 0,04 7 12 12,33 3. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA. Bảng 22. Đường kính vòng halo, đường kính khuẩn lạc và hiệu quả hòa tan lân ở ngày 1 sau khi ủ Dòng Halo ngày 1 (cm) Khuẩn lạc ngày 1 (cm) Hiệu quả ngày 1 (E) R5 R5 R5 R6 R6 R6 R7 R7 R7 R8 R8 0,6 0,55 0,6 0,7 0,7 0,6 0,6 0,65 0,65 0,7 0,8 0,5 0,5 0,5 0,6 0,6 0,5 0,5 0,6 0,5 0,6 0,65 120 110 120 116,7 116,7 120 120 108,3 130 116,7 123,1 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 R8 T4 T4 T4 L1 L1 L1 L2 L2 L2 L3 L3 L3 L5 L5 L5 L6 L6 L6 L7 L7 L7 Trường ĐHCT 0,7 1 1 0,9 0,6 0,55 0,55 0,7 0,8 0,8 0,6 0,65 0,6 0,9 1 1 0,8 0,8 0,85 0,6 0,65 0,65 0,6 0,7 0,8 0,8 0,5 0,5 0,5 0,6 0,65 0,65 0,5 0,5 0,55 0,7 0,8 0,7 0,6 0,65 0,6 0,5 0,6 0,5 116,7 142,9 125 112,5 120 110 110 116,7 123,1 123,1 120 130 109,1 128,6 125 142,9 133,3 123,1 141,7 120 108,3 130 Bảng 23. Đường kính vòng halo, đường kính khuẩn lạc và hiệu quả hòa tan lân ở ngày 3 sau khi ủ Dòng Halo ngày 3 (cm) Khuẩn lạc ngày 3 (cm) Hiệu quả ngày 3 (E) R5 R5 R5 R6 R6 R6 R7 R7 R7 R8 R8 R8 T4 T4 T4 L1 L1 L1 L2 L2 0,7 0,8 0,7 1,3 1,4 1,3 1 1,2 1 1 1,1 1,1 1,5 1,5 1,6 0,9 0,95 1 1,2 1,3 0,6 0,6 0,65 1,2 1 1,2 0,9 0,9 0,8 0,9 0,7 1 1,2 1,1 1,3 0,7 0,8 0,85 0,95 1,1 116,7 133,3 107,7 108,3 140 108,3 111,1 133,3 125 111,1 157,1 110 125 136,4 123,1 128,6 118,8 117,6 126,3 118,2 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 L2 L3 L3 L3 L5 L5 L5 L6 L6 L6 L7 L7 L7 1,4 1,3 1,35 1,3 1,6 1,8 2 1,2 1,3 1,2 1,2 1,2 1,1 Trường ĐHCT 1,1 1 1,1 0,9 1 1,2 1,5 0,9 1,1 0,8 1 0,9 0,9 127,3 130 122,7 144,4 160 150 133,3 133,3 118,2 150 120 133,3 122,2 Bảng 24. Đường kính vòng halo, đường kính khuẩn lạc và hiệu quả hòa tan lân ở ngày 5 sau khi ủ. Dòng Halo ngày 5 (cm) Khuẩn lạc ngày 5 (cm) Hiệu quả ngày 5 (E) R5 R5 R5 R6 R6 R6 R7 R7 R7 R8 R8 R8 T4 T4 T4 L1 L1 L1 L2 L2 L2 L3 L3 L3 L5 L5 L5 L6 L6 1,1 1,1 1,3 1,8 1,7 1,7 1,5 1,7 1,5 1,8 1,8 1,7 1 1,2 1,4 1,2 1,3 1,2 1,3 1,4 1,2 1,7 1,6 1,6 2,5 2,1 2,1 1,5 1,65 0,9 1 0,9 1,4 1,5 1,4 1,1 1,2 1,1 1,5 1,3 1,3 0,6 0,7 0,7 0,9 1 1 1,1 1 1 1,2 1,1 1,2 1,5 0,9 0,8 1 1,3 122,2 110 144,4 128,6 113,3 121,4 136,4 141,7 136,4 120 138,5 130,8 166,7 171,4 200 133,3 130 120 118,2 140 120 141,7 145,5 133,3 166,7 233,3 262,5 150 126,9 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 L6 L7 L7 L7 1,6 1,4 1,6 1,4 Trường ĐHCT 1,1 1,1 1,1 1.1 145,5 127,3 145,5 127,3 4. Khả năng kháng E. coli của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA. Bảng 25. Đường kính vòng sáng, đường kính khuẩn lạc và vòng vô khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được ở ngày 1 sau khi ủ với E. coli Dòng R2 R2 T2 T2 T4 T4 Vòng sáng ngày 1 (mm) 6,5 7 7 8 8 9 Khuẩn lạc ngày 1 (m) 6 6 6 6,2 6 6 Vòng vô khuẩn ngày 1 (mm) 0,5 1 1 1,8 2 3 Bảng 26. Đường kính vòng sáng, đường kính khuẩn lạc và vòng vô khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được ở ngày 2 sau khi ủ với E. coli Dòng R2 R2 T2 T2 T4 T4 Vòng sáng ngày 2 (mm) 7 7,5 8 8,5 9,5 9 Khuẩn lạc ngày 2 (mm) 6,5 6 6,5 6,2 6 6,2 Vòng vô khuẩn ngày 2 (mm) 0,5 1,5 1,5 2,3 3,5 2,8 Bảng 27. Đường kính vòng sáng, đường kính khuẩn lạc và vòng vô khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được ở ngày 3 sau khi ủ với E. coli Dòng R2 R2 T2 T2 T4 T4 Vòng sáng ngày 3 (mm) 8 7,5 8,5 8,5 9,5 9,4 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khuẩn lạc ngày 3 (mm) 6,5 6 6,5 6,5 6 6,3 Vòng vô khuẩn ngày 3 (mm) 1,5 1,5 2 2 3,5 3,1 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 5. Khả năng kháng Aeromonas hydrophila của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA. Bảng 27. Đường kính vòng sáng, đường kính khuẩn lạc và vòng vô khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được ở ngày 1 sau khi ủ với A. hydrophila. Dòng R2 R2 T2 T2 L2 L2 L3 L3 L5 L5 Vòng sáng ngày 1 (mm) 7,5 7 7,5 8 11 11 8,5 9,5 7,5 8 Khuẩn lạc ngày 1 (mm) 6 6 6 6 7 6 6,5 6,5 6 6 Vòng vô khuẩn ngày 1 (mm) 1,5 1 1,5 2 4 5 2 3 1,5 2 Bảng 28. Đường kính vòng sáng, đường kính khuẩn lạc và vòng vô khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được ở ngày 2 sau khi ủ với A. hydrophila. Dòng R2 R2 T2 T2 L2 L2 L3 L3 L5 L5 Vòng sáng ngày 2 (mm) 8 7 8,5 9 12 12 9,5 9,5 8 8 Khuẩn lạc ngày 2 (mm) 6,5 6 7 7 8 7 6,5 6,5 6 6,5 Vòng vô khuẩn ngày 2 (mm) 1,5 1 1,5 2 4 5 3 3 2 1,5 Bảng 29. Đường kính vòng sáng, đường kính khuẩn lạc và vòng vô khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được ở ngày 3 sau khi ủ với A. hydrophila. Dòng R2 R2 T2 T2 L2 L2 L3 L3 L5 L5 Vòng sáng ngày 3 (mm) 8 7,5 9 9 13 12 10 11 10 9 Chuyên ngành Vi sinh vật học Khuẩn lạc ngày 3 (mm) 6,5 6,5 7 7 8,5 7 6,5 6,5 7 7 Vòng vô khuẩn ngày 3 (mm) 1,5 1 2 2 4,5 5 3,5 4,5 3 2 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Phụ lục 2: Hình biểu đồ đường chuẩn NH4+ và IAA 1. Đường chuẩn đo đạm. Hình 24: Đường chuẩn NH4+ ngày 0 Hình 2: Đường chuẩn NH4+ ngày 2. Hình 25: Đường chuẩn NH4+ ngày 2 Hình 26: Đường chuẩn NH4+ ngày 4. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hình 27: Đường chuẩn NH4+ ngày 6 2. Đường chuẩn đo IAA. Hình 28: Đường chuẩn IAA ngày 2 Hình 29: Đường chuẩn IAA ngày 4 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hình 30: Đường chuẩn IAA ngày 6 Phụ lục 3: Kết quả thống kê. 1. Kết quả thống kê khảo sát lượng Ammonium của 17 dòng vi khuẩn tạo ra. a) Kết quả khảo sát lượng Ammonium do dòng vi khuẩn nhóm tạo ra. Ngày 0 Sucmary Statistics for ngay 0 dong R1 R2 R5 R6 R7 R8 T1 T2 T3 T4 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 30 Average 0,002 0,0236667 0,00833333 0,0516667 0,03 0,0563333 0,0343333 0,0193333 0,0516667 0,0603333 0,0337667 Median 0 0,026 0,006 0,052 0,032 0,052 0,032 0,019 0,045 0,058 0,032 Standard deviation 0,0034641 0,00971253 0,00404145 0,00650641 0,0101489 0,00750555 0,00404145 0,00650641 0,011547 0,00404145 0,0208239 ANOVA Table for ngay 0 by dong Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,01151 0,00106533 0,0125754 Df 9 20 29 Mean Square 0,00127889 0,0000532667 F-Ratio 24,01 P-Value 0,0000 CV= 21,61% Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Multiple Range Tests for dam ngay 0 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong vi khuan R1 R5 T2 R2 R7 T1 T3 R6 R8 T4 Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 0,002 0,00833333 0,0193333 0,0236667 0,03 0,0343333 0,0516667 0,0516667 0,0563333 0,0603333 Homogeneous Groups X XX XX XX XX X X X X X Ngày 2 Sucmary Statistics for dam ngay 2 by dong vi khuan dong vi khuan R1 R2 R5 R6 R7 R8 T1 T2 T3 T4 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 30 Average 0,118333 0,0836667 0,0943333 0,129 0,089 0,105 0,089 0,107667 0,129 0,0863333 0,103133 Median 0,121 0,081 0,097 0,129 0,089 0,105 0,089 0,113 0,129 0,089 0,097 Standard deviation 0,0122202 0,0046188 0,0046188 0,008 0,008 0,008 0 0,0092376 0,008 0,0046188 0,0179111 ANOVA Table for dam ngay 2 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,00819413 0,00110933 0,00930347 Df 9 20 29 Mean Square 0,000910459 0,0000554667 F-Ratio 16,41 P-Value 0,0000 CV= 7,22% Multiple Range Tests for dam ngay 2 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong vi khuan Count R2 3 T4 3 T1 3 R7 3 R5 3 R8 3 T2 3 R1 3 T3 3 R6 3 Chuyên ngành Vi sinh vật học Mean 0,0836667 0,0863333 0,089 0,089 0,0943333 0,105 0,107667 0,118333 0,129 0.129 Homogeneous Groups X X X X XX XX XX XX X X Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Ngày 4 Sucmary Statistics for dam ngay 4 dong vi khuan R1 R2 R5 R6 R7 R8 T1 T2 T3 T4 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 30 Average 0,150333 0,147667 0,155 0,215667 0,167667 0,195333 0,200667 0,182667 0,220667 0,152667 0,178833 Median 0,15 0,15 0,15 0,218 0,165 0,195 0,203 0,18 0,218 0,15 0,173 Standard deviation 0,00750555 0,00404145 0,00866025 0,00404145 0,0046188 0,00750555 0,0116762 0,0112398 0,0046188 0,0046188 0,0276606 ANOVA Table for dam ngay 4 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,0210942 0,001094 0,0221882 Df 9 20 29 Mean Square 0,0023438 0,0000547 F-Ratio 42,85 P-Value 0,0000 CV= 4,14% Multiple Range Tests for dam ngay 4 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong Count R2 3 R1 3 T4 3 R5 3 R7 3 T2 3 R8 3 T1 3 R6 3 T3 3 Mean 0,147667 0,150333 0,152667 0,155 0,167667 0,182667 0,195333 0,200667 0,215667 0,220667 Homogeneous Groups X X X X X X X X X X Ngày 6 Sucmary Statistics for dam ngay 6 dong vi khuan R1 R2 R5 R6 R7 R8 T1 T2 Count 3 3 3 3 3 3 3 3 Chuyên ngành Vi sinh vật học Average 0,125 0,031 0,043 0,119 0,061 0,0613333 0,095 0,113 Median 0,128 0,028 0,046 0,119 0,055 0,055 0,101 0,11 Standard deviation 0,00519615 0,00519615 0,00519615 0,009 0,0103923 0,0192959 0,0103923 0,00519615 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 T3 T4 Total 3 3 30 Trường ĐHCT 0.143667 0.034 0.0826 0.138 0.028 0.083 0.0191398 0.0103923 0.0410329 ANOVA Table for dam ngay 6 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,0463239 0,00250333 0,0488272 Df 9 20 29 Mean Square 0,0051471 0,000125167 F-Ratio 41,12 P-Value 0,0000 CV= 13,54% Multiple Range Tests for dam ngay 6 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong vi khuan Count R2 3 T4 3 R5 3 R7 3 R8 3 T1 3 T2 3 R6 3 R1 3 T3 3 Mean 0,031 0,034 0,043 0,061 0,0613333 0,095 0,113 0,119 0,125 0,143667 Homogeneous Groups X X XX X X X XX X XX X b) Kết quả khảo sát lượng Ammonium do dòng vi khuẩn nhóm 2 tạo ra. Ngày 0 Sucmary Statistics for dam ngay 0 dong L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 21 Average 0,065 0,0303333 0,054 0,0213333 0,00866667 0,077 0,0106667 0,0381429 Median 0,065 0,026 0,052 0,019 0,013 0,077 0,013 0,026 Standard deviation 0 0,00750555 0,0101489 0,00404145 0,00750555 0 0,00404145 0,0263121 Coeff. of variation 0% 24,7436% 18,7942% 18,9443% 86,6025% 0% 37,8886% 68,9831% ANOVA Table for dam ngay 0 by dong Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,0133499 0,000496667 0,0138466 Df 6 14 20 Mean Square 0,00222498 0,0000354762 F-Ratio 62,72 P-Value 0,0000 CV= 15,6% Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Multiple Range Tests for dam ngay 0 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong Count L5 3 L7 3 L4 3 L2 3 L3 3 L1 3 L6 3 Mean 0,00866667 0,0106667 0,0213333 0,0303333 0,054 0,065 0,077 Homogeneous Groups X X X X X X X Ngày 2 Sucmary Statistics for dam ngay 2 dong L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 21 Average 0,113 0,118333 0,121 0,113 0,121 0,134333 0,118333 0,119857 Median 0,113 0,113 0,121 0,105 0,121 0,145 0,121 0,121 Standard deviation 0,016 0,0092376 0,008 0,0138564 0,016 0,0184752 0,0122202 0,0134547 ANOVA Table for dam ngay 2 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,000932571 0,002688 0,00362057 Df 6 14 20 Mean Square 0,000155429 0,000192 F-Ratio 0,81 P-Value 0,5794 CV= 11,56% Multiple Range Tests for dam ngay 2 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong Count L4 3 L1 3 L7 3 L2 3 L3 3 L5 3 L6 3 Chuyên ngành Vi sinh vật học Mean 0.113 0.113 0.118333 0.118333 0.121 0.121 0.134333 Homogeneous Groups X X X X X X X Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Ngày 4 Sucmary Statistics for dam ngay 4 dong L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 21 Average 0,185 0,195333 0,208 0,215667 0,213333 0,221 0,208333 0,206667 Median 0,18 0,195 0,203 0,218 0,211 0,226 0,211 0,211 Standard deviation 0,00866025 0,00750555 0,0160935 0,00404145 0,00404145 0,00866025 0,0046188 0,013854 ANOVA Table for dam ngay 4 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,0028 0,00103867 0,00383867 Df 6 14 20 Mean Square 0,000466667 0,0000741905 F-Ratio 6,29 P-Value 0,0022 CV= 4,17 % Multiple Range Tests for dam ngay 4 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong Count L1 3 L2 3 L3 3 L7 3 L5 3 L4 3 L6 3 Mean 0,185 0,195333 0,208 0,208333 0,213333 0,215667 0,221 Homogeneous Groups X XX XX XX X X X Ngày 6 Sucmary Statistics for dam ngay 6 dong L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 21 Average 0,0916667 0,0796667 0,0826667 0,159 0,131333 0,122 0,089 0,107905 Chuyên ngành Vi sinh vật học Median 0,101 0,083 0,092 0,156 0,128 0,128 0,083 0,101 Standard deviation 0,0161658 0,0142945 0,0161658 0,0137477 0,0231805 0,0103923 0,0103923 0,0312888 Coeff. of variation 17,6354% 17,9429% 19,5554% 8,64637% 17,6501% 8,51828% 11,6767% 28,9967% Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT ANOVA Table for dam ngay 6 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) . CV= 14,3% Sum of Squares 0,0162411 0,00333867 0,0195798 Df 6 14 20 Mean Square 0,00270686 0,000238476 F-Ratio 11,35 P-Value 0,0001 Multiple Range Tests for dam ngay 6 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong Count L2 3 L3 3 L7 3 L1 3 L6 3 L5 3 L4 3 Mean 0,0796667 0,0826667 0,089 0,0916667 0,122 0,131333 0,159 Homogeneous Groups X X X X X X X c) Kết quả khảo sát lượng Ammonium do dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra. Ngày 0 Sucmary Statistics for dam ngay 0 dong vi khuan L4 L5 L6 L7 R6 T2 T3 T4 Total Count 3 3 6 3 3 3 6 3 30 Average 0,0213333 0,00866667 0,077 0,0106667 0,0516667 0,0193333 0,0516667 0,0603333 0,0429333 Median 0,019 0,013 0,077 0,013 0,052 0,019 0,045 0,058 0,045 Standard deviation 0,00404145 0,00750555 0 0,00404145 0,00650641 0,00650641 0,010328 0,00404145 0,0257226 ANOVA Table for dam ngay 0 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,0182745 0,000913333 0,0191879 Df 7 22 29 Mean Square 0,00261065 0,0000415152 F-Ratio 62,88 P-Value 0,0000 CV= 15% Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Multiple Range Tests for dam ngay 0 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong vi khuan Count L5 3 L7 3 T2 3 L4 3 T3 6 R6 3 T4 3 L6 6 Mean 0,00866667 0,0106667 0,0193333 0,0213333 0,0516667 0,0516667 0,0603333 0,077 Homogeneous Groups X XX XX X X X X X Ngày 2 Sucmary Statistics for dam ngay 2 dong vi khuan L4 L5 L6 L7 R6 T2 T3 T4 Total Count 3 3 6 3 3 3 6 3 30 Average 0.113 0.121 0.134333 0.118333 0.129 0.107667 0.129 0.0863333 0.1202 Median 0,105 0,121 0,145 0,121 0,129 0,113 0,129 0,089 0,121 Standard deviation 0,0138564 0,016 0,0165247 0,0122202 0,008 0,0092376 0,00715542 0,0046188 0,0177461 ANOVA Table for dam ngay 2 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,00597547 0,00315733 0,0091328 Df 7 22 29 Mean Square 0,000853638 0,000143515 F-Ratio 5,95 P-Value 0,0006 CV= 9,97% Multiple Range Tests for dam ngay 2 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong vi khuan Count T4 3 T2 3 L4 3 L7 3 L5 3 T3 6 R6 3 L6 6 Chuyên ngành Vi sinh vật học Mean 0,0863333 0,107667 0,113 0,118333 0,121 0,129 0,129 0,134333 Homogeneous Groups X X XX XXX XXX XX XX X Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Ngày 4 Sucmary Statistics for dam ngay 4 dong vi khuan L4 L5 L6 L7 R6 T2 T3 T4 Total Count 3 3 6 3 3 3 6 3 30 Average 0,215667 0,213333 0,221 0,208333 0,215667 0,182667 0,220667 0,152667 0,207167 Median 0,218 0,211 0,226 0,211 0,218 0,18 0,218 0,15 0,2145 Standard deviation 0,00404145 0,00404145 0,00774597 0,0046188 0,00404145 0,0112398 0,00413118 0,0046188 0,0222262 ANOVA Table for dam ngay 4 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,0135048 0,000821333 0.0143262 Df 7 22 29 Mean Square 0,00192926 0,0000373333 F-Ratio 51,68 P-Value 0,0000 CV= 2,95% Multiple Range Tests for dam ngay 4 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong vi khuan Count T4 3 T2 3 L7 3 L5 3 L4 3 R6 3 T3 6 L6 6 Mean 0,152667 0,182667 0,208333 0,213333 0,215667 0,215667 0,220667 0,221 Homogeneous Groups X X X XX XX XX X X Ngày 6 Sucmary Statistics for dam ngay 6 dong vi khuan L4 L5 L6 L7 R6 T2 T3 T4 Total Chuyên ngành Vi sinh vật học Count 3 3 6 3 3 3 6 3 30 Average 0,159 0,131333 0,122 0,089 0,119 0,113 0,143667 0,034 0,117667 Median 0,156 0,128 0,128 0,083 0,119 0,11 0,138 0,028 0,128 Standard deviation 0,0137477 0,0231805 0,00929516 0,0103923 0,009 0,00519615 0,0171192 0,0103923 0,0359063 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT ANOVA Table for dam ngay 6 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,0333907 0,003998 0,0373887 Df 7 22 29 Mean Square 0,0047701 0,000181727 F-Ratio 26,25 P-Value 0,0000 CV= 11,46% Multiple Range Tests for dam ngay 6 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong vi khuan Count T4 3 L7 3 T2 3 R6 3 L6 6 L5 3 T3 6 L4 3 Mean 0,034 0,089 0,113 0,119 0,122 0,131333 0,143667 0,159 Homogeneous Groups X X X X X XX XX X 2. Kết quả khảo sát lượng IAA do 17 dòng vi khuẩn tạo ra a) Kết quả khảo sát lượng IAA do dòng vi khuẩn nhóm 1 tạo ra. Ngày 2 Sucmary Statistics for IAA NGAY 2 dong vi khuan R1 R2 R5 R6 R7 R8 T1 T2 T3 T4 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 30 Average 8,41667 9,16667 12,4167 6,33333 7,08333 9,58333 9,16667 9,66667 7,5 5,83333 8,51667 Median 8,25 9,0 12,5 6,5 7,0 9,75 9,25 9,75 7,25 6,0 8,75 Standard deviation 0,288675 0,288675 0,381881 0,288675 0,144338 0,520416 0,381881 0,144338 0,433013 0,520416 1,88795 ANOVA Table for IAA NGAY 2 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 100,742 2,625 103,367 Df 9 20 29 Mean Square 11,1935 0,13125 F-Ratio 85,28 P-Value 0,0000 CV= 4,25% Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Multiple Range Tests for IAA NGAY 2 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong vi khuan T4 R6 R7 T3 R1 T1 R2 R8 T2 R5 Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 5,83333 6,33333 7,08333 7,5 8,41667 9,16667 9,16667 9,58333 9,66667 12,4167 Homogeneous Groups X X X X X X X X X X Ngày 4 Sucmary Statistics for IAA NGAY 4 dong vi khuan R1 R2 R5 R6 R7 R8 T1 T2 T3 T4 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 30 Average 14,4967 13,6667 14,0 13,5 12,78 12,61 12,1667 13,0533 11,7767 12,3333 13,0383 Median 14,33 13,5 13,83 13,5 12,67 12,5 12,17 12,83 11,83 12,33 12,83 Standard deviation 0,288675 0,44411 0,603241 0,67 0,348281 0,190526 0,165025 0,386825 0,422532 0,335012 0,904258 ANOVA Table for IAA NGAY 4 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 20,2756 3,4372 23,7128 Df 9 20 29 Mean Square 2,25285 0,17186 F-Ratio 13,11 P-Value 0,0000 CV= 3,18% Multiple Range Tests for IAA NGAY 4 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong vi khuan T3 T1 T4 R8 R7 T2 R6 R2 R5 R1 Chuyên ngành Vi sinh vật học Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 11,7767 12,1667 12,3333 12,61 12,78 13,0533 13,5 13,6667 14,0 14,4967 Homogeneous Groups X XX XX XX XX XX XX XX XX X Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Ngày 6 Sucmary Statistics for IAA NGAY 6 dong vi khuan R1 R2 R5 R6 R7 R8 T1 T2 T3 T4 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 30 Average 11,3333 10,6667 16,6667 4,77667 13,22 9,0 3,88667 8,77667 5,22333 2,88667 8,64367 Median 11,0 10,67 16,67 5,0 13,33 9,33 4,0 9,0 5,0 3,0 9,0 Standard deviation 0,878768 1,665 0,335012 0,692556 0,840417 0,882553 0,509542 0,692556 0,386825 0,509542 4,35954 ANOVA Table for IAA NGAY 6 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 537,622 13,5401 551,162 Df 9 20 29 Mean Square 59,7358 0,677007 F-Ratio 88,24 P-Value 0,0000 CV= 9,52% b) Kết quả khảo sát lượng IAA do dòng vi khuẩn nhóm 2 tạo ra. Ngày 2 Sucmary Statistics for IAA NGAY 2 dong vi khuan L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 21 Average 5,75 7,16667 6,66667 5,08333 7,41667 3,91667 6,33333 6,04762 Median 6,0 7,0 6,75 5,25 7,75 4,0 6,5 6,25 Standard deviation 0,661438 0,520416 0,629153 0,520416 0,57735 0,144338 0,288675 1,24654 ANOVA Table for IAA NGAY 2 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 27,4524 3,625 31,0774 Df 6 14 20 Mean Square 4,5754 0,258929 F-Ratio 17,67 P-Value 0,0000 CV = 8,41% Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Multiple Range Tests for IAA NGAY 2 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong vi khuan L6 L4 L1 L7 L3 L2 L5 Count 3 3 3 3 3 3 3 Mean 3,91667 5,08333 5,75 6,33333 6,66667 7,16667 7,41667 Homogeneous Groups X X XX XX XX XX X Ngày 4 Sucmary Statistics for IAA NGAY 4 dong vi khuan L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 21 Average 12,78 9,66667 13,8333 9,22333 12,39 14,89 13,9433 12,3895 Median 12,67 9,5 13,5 9,17 12,5 15,17 13,83 12,67 Standard deviation 0,348281 0,288675 0,878768 0,254231 0,348281 0,95142 0,344287 2,11424 ANOVA Table for IAA NGAY 4 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 85,0274 4,37307 89,4005 Df 6 14 20 Mean Square 14,1712 0,312362 F-Ratio 45,37 P-Value 0,0000 CV= 4,51% Multiple Range Tests for IAA NGAY 4 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong vi khuan L4 L2 L5 L1 L3 L7 L6 Chuyên ngành Vi sinh vật học Count 3 3 3 3 3 3 3 Mean 9,22333 9,66667 12,39 12,78 13,8333 13,9433 14,89 Homogeneous Groups X X X X X XX X Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Ngày 6 Sucmary Statistics for IAA NGAY 6 dong vi khuan L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 21 Average 9,22333 6,55667 8,22333 8,33333 6,77667 12,11 12,11 9,04762 Median 9,33 6,67 8,33 8,33 7,0 12,0 12,33 8,67 Standard deviation 0,508462 0,835783 0,508462 0,665006 0,386825 0,190526 0,696563 2,2212 ANOVA Table for IAA NGAY 6 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 94.0168 4.65793 98.6748 Df 6 14 20 Mean Square 15.6695 0.33271 F-Ratio 47.10 P-Value 0.0000 CV= 6,38% Multiple Range Tests for IAA NGAY 6 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong vi khuan L2 L5 L3 L4 L1 L7 L6 Count 3 3 3 3 3 3 3 Mean 6,55667 6,77667 8,22333 8,33333 9,22333 12,11 12,11 Homogeneous Groups X X X X X X X b) Kết quả khảo sát lượng IAA do dòng vi khuẩn triển vọng tạo ra. Ngày 2 Summary Statistics for IAA ngay 2 dòng vi khuan L3 L6 L7 R1 R5 Total Count 3 3 3 3 3 15 Average 6,66667 3,91667 6,33333 8,41667 12,4167 7,55 Median 6,75 4,0 6,5 8,25 12,5 6,75 Standard deviation 0,629153 0,144338 0,288675 0,288675 0,381881 2,9417 ANOVA Table for IAA ngay 2 by dòng vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 119,692 1,45833 121,15 Chuyên ngành Vi sinh vật học Df 4 10 14 Mean Square 29,9229 0,145833 F-Ratio 205,19 P-Value 0,0000 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CV= 5,06% Multiple Range Tests for IAA ngay 2 by dòng vi khuan Method: 95.0 percent LSD dòng vi khuan L6 L7 L3 R1 R5 Count 3 3 3 3 3 Mean 3,91667 6,33333 6,66667 8,41667 12,4167 Homogeneous Groups X X X X X Ngày 4 Summary Statistics for IAA ngay 4 dòng vi khuan L3 L6 L7 R1 R5 Total Count 3 3 3 3 3 15 Average 13,8333 14,89 13,9433 14,4967 14,0 14,2327 Median 13,5 15,17 13,83 14,33 13,83 14,33 Standard deviation 0,878768 0,95142 0,344287 0,288675 0,603241 0,701208 ANOVA Table for IAA ngay 4 by dòng vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 2.39729 4.4864 6.88369 Df 4 10 14 Mean Square 0,599323 0,44864 F-Ratio 1,34 P-Value 0,3224 CV= 4,71% Multiple Range Tests for IAA NGAY 4 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dòng vi khuan L3 L7 R5 R1 L6 Count 3 3 3 3 3 Mean 13,8333 13,9433 14,0 14,4967 14,89 Homogeneous Groups X X X X X Ngày 6 Summary Statistics for IAA ngay 6 dòng vi khuan L3 L6 L7 R1 R5 Total Chuyên ngành Vi sinh vật học Count 3 3 3 3 3 15 Average 8,22333 12,11 12,11 11,3333 16,6667 12,0887 Median 8,33 12,0 12,33 11,0 16,67 12,0 Standard deviation 0,508462 0,190526 0,696563 0,878768 0,335012 2,83776 Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT ANOVA Table for IAA ngay 6 by dòng vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 109,411 3,329 112,74 Df 4 10 14 Mean Square 27,3527 0,3329 F-Ratio 82,17 P-Value 0,0000 CV= 4,77% Multiple Range Tests for IAA NGAY 6 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dòng vi khuan L3 R1 L7 L6 R5 Count 3 3 3 3 3 Mean 8,22333 11,3333 12,11 12,11 16,6667 Homogeneous Groups X X X X X 3. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân. Ngày 1 Sucmary Statistics for ngay 1 dong vi khuan L1 L2 L3 L5 L6 L7 R5 R6 R7 R8 T4 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 33 Average 113,333 120,967 119,7 132,167 132,7 119,433 116,667 117,8 119,433 118,833 126,8 121,621 Median 110,0 123,1 120,0 128,6 133,3 120,0 120,0 116,7 120,0 116,7 125,0 120,0 Standard deviation 5,7735 3,69504 10,4532 9,46802 9,3145 10,8611 5,7735 1,90526 10,8611 3,69504 15,2797 9,47951 ANOVA Table for ngay 1 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 1170.21 1705.35 2875.56 Df 10 22 32 Mean Square 117,021 77,5158 F-Ratio 1,51 P-Value 0,2015 CV = 7,24% Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Multiple Range Tests for ngay 1 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong vi khuan L1 R5 R6 R8 L7 R7 L3 L2 T4 L5 L6 Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 113,333 116,667 117,8 118,833 119,433 119,433 119,7 120,967 126,8 132,167 132,7 Homogeneous Groups X X XX XX XX XX XX XX XX X X Ngày 3 Sucmary Statistics for ngay 3 dong vi khuan L1 L2 L3 L5 L6 L7 R5 R6 R7 R8 T4 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 33 Average 121,667 123,933 132,367 147,767 133,833 125,167 119,233 118,867 123,133 126,067 128,167 127,291 Median 118,8 126,3 130,0 150,0 133,3 122,2 116,7 108,3 125,0 111,1 125,0 125,0 Standard deviation 6,03435 4,99032 11,0419 13,4894 15,9067 7,12905 12,9867 18,302 11,2171 26,8813 7,19328 13,9393 ANOVA Table for ngay 3 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 2072,05 4145,67 6217,73 Df 10 22 32 Mean Square 207,205 188,44 F-Ratio 1,10 P-Value 0,4043 CV = 10,78% Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Multiple Range Tests for ngay 3 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong vi khuan R6 R5 L1 R7 L2 L7 R8 T4 L3 L6 L5 Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 118.867 119.233 121.667 123.133 123.933 125.167 126.067 128.167 132.367 133.833 147.767 Homogeneous Groups X X X X X XX XX XX XX XX X Ngày 5 Sucmary Statistics for ngay 5 dong vi khuan L1 L2 L3 L5 L6 L7 R5 R6 R7 R8 T4 Total Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 33 Average 127,767 126,067 140,167 220,833 140,8 133,367 125,533 121,1 138,167 129,767 179,367 143,903 Median 130,0 120,0 141,7 233,3 145,5 127,3 122,2 121,4 136,4 130,8 171,4 136,4 Standard deviation 6,92556 12,1001 6,24286 49,1017 12,2462 10,5078 17,4406 7,65441 3,05996 9,29319 18,0229 32,7461 ANOVA Table for ngay 5 by dong vi khuan Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 26937,7 7376,04 34313,7 Df 10 22 32 Mean Square 2693,77 335,275 F-Ratio 8,03 P-Value 0,0000 CV= 12,7% Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Multiple Range Tests for ngay 5 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong vi khuan R6 R5 L2 L1 R8 L7 R7 L3 L6 T4 L5 Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 121,1 125,533 126,067 127,767 129,767 133,367 138,167 140,167 140,8 179,367 220,833 Homogeneous Groups X X X X X X X X X X X 4. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh của một số dòng vi khuẩn phân lập được. a) Khả năng kháng E. coli Ngày 1 Sucmary Statistics for ngay 1 dong R2 T2 T4 Total Count 2 2 2 6 Average 0,075 0,14 0,25 0,155 Median 0,075 0,14 0,25 0,14 Standard deviation 0,0353553 0,0565685 0,0707107 0,0902774 Mean Square 0,01565 0,00315 F-Ratio 4,97 ANOVA Table for ngay 1 by dong Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,0313 0,00945 0,04075 Df 2 3 5 P-Value 0,1117 CV= 36,2% Multiple Range Tests for ngay 1 by dong Method: 95.0 percent LSD dong Count R2 2 T2 2 T4 2 Chuyên ngành Vi sinh vật học Mean 0,075 0,14 0,25 Homogeneous Groups X X X Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Ngày 2 Sucmary Statistics for ngay 2 dong R2 T2 T4 Total Count 2 2 2 6 Average 0,1 0,19 0,315 0,201667 Median 0,1 0,19 0,315 0,19 Standard deviation 0,0707107 0,0565685 0,0494975 0,107036 ANOVA Table for ngay 2 by dong Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,0466333 0,01065 0,0572833 Df 2 3 5 Mean Square 0,0233167 0,00355 F-Ratio 6,57 P-Value 0,0802 CV= 29,54% Multiple Range Tests for ngay 2 by dong Method: 95.0 percent LSD dong Count R2 2 T2 2 T4 2 Mean 0,1 0,19 0,315 Homogeneous Groups X XX X Ngày 3 Sucmary Statistics for ngay 3 dong R2 T2 T4 Total Count 2 2 2 6 Average 0,15 0,2 0,33 0,226667 Median 0,15 0,2 0,33 0,2 Standard deviation 0 0 0,0282843 0,0840635 ANOVA Table for ngay 3 by dong Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,0345333 0,0008 0,0353333 Df 2 3 5 Mean Square 0,0172667 0,000266667 F-Ratio 64,75 P-Value 0,0034 CV= 7, 2% Multiple Range Tests for ngay 3 by dong Method: 95.0 percent LSD dong Count R2 2 T2 2 T4 2 Chuyên ngành Vi sinh vật học Mean 0,15 0,2 0,33 Homogeneous Groups X X X Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT b) Khả năng kháng Aeromonas hydrophila của các dòng vi khuẩn phân lập được. Ngày 1 Sucmary Statistics for ngay 1 dong L2 L3 L5 R2 T2 Total Count 2 2 2 2 2 10 Average 0,45 0,25 0,175 0,125 0,175 0,235 Median 0,45 0,25 0,175 0,125 0,175 0,2 Standard deviation 0,0707107 0,0707107 0,0353553 0,0353553 0,0353553 0,127039 ANOVA Table for ngay 1 by dong Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,1315 0,01375 0,14525 Df 4 5 9 Mean Square 0,032875 0,00275 F-Ratio 11,95 P-Value 0,0090 CV= 22,3% Multiple Range Tests for ngay 1 by dong Method: 95.0 percent LSD dong Count R2 2 L5 2 T2 2 L3 2 L2 2 Mean 0,125 0,175 0,175 0,25 0,45 Homogeneous Groups X X X X X Ngày 2 Sucmary Statistics for ngay 2 dong L2 L3 L5 R2 T2 Total Count 2 2 2 2 2 10 Average 0,45 0,3 0,175 0,125 0,175 0,245 Median 0,45 0,3 0,175 0,125 0,175 0,2 Standard deviation 0,0707107 0 0,0353553 0,0353553 0,0353553 0,127911 ANOVA Table for ngay 2 by dong Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,1385 0,00875 0,14725 Df 4 5 9 Mean Square 0,034625 0,00175 F-Ratio 19,79 P-Value 0,0029 CV = 17,07% Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Multiple Range Tests for ngay 2 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong Count R2 2 L5 2 T2 2 L3 2 L2 2 Mean 0,125 0,175 0,175 0,3 0,45 Homogeneous Groups X X X X X Ngày 3 Sucmary Statistics for ngay 3 dong L2 L3 L5 R2 T2 Total Count 2 2 2 2 2 10 Average 0,475 0,4 0,25 0,125 0,2 0,29 Median 0,475 0,4 0,25 0,125 0,2 0,25 Standard deviation 0,0353553 0,0707107 0,0707107 0,0353553 0 0,141028 ANOVA Table for ngay 3 by dong Source Between groups Within groups Total (Corr.) Sum of Squares 0,1665 0,0125 0,179 Df 4 5 9 Mean Square 0,041625 0,0025 F-Ratio 16,65 P-Value 0,0043 CV = 17,24% Multiple Range Tests for ngay 3 by dong vi khuan Method: 95.0 percent LSD dong Count R2 2 T2 2 L5 2 L3 2 L2 2 Chuyên ngành Vi sinh vật học Mean 0,125 0,2 0,25 0,4 0,475 Homogeneous Groups X X X X X Viện NC &PT Công nghệ Sinh học [...]... kháng thuốc Vì vậy, đề tài: Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui (Tridax procumbens) ở Cần Thơ nhằm nghiên cứu các tác động có ích và khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội trong cây dược liệu nói chung và cây cúc mui nói riêng ở thành phố Cần Thơ 1.2 Mục tiêu của đề tài Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui (Tridax procumbens) có khả năng cố định... năng kháng khuẩn Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Vi n NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Thành phố Cần Thơ 2.1.1 Sơ lược về thành phố Cần Thơ Cần Thơ là một thành phố trực thuộc trung ương, nằm bên hữu ngạn của sông Hậu, thuộc vùng đồng bằng sông Cửu Long Đây là một trong 5 thành phố trực thuộc trung ương của Vi t Nam Ngày... (chi): Tridax Loài: Tridax procumbens (L.) Tên khác: Cúc mui, Sài lan, Sài lông, Thu thảo Hình 2: Cây cúc mui (Tridax procumbens) (*Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Tridax _procumbens, ngày 01/08/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Vi n NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.2.2 Mô tả cây cúc mui (Amita et al., 2012) Cây cúc mui là cây thân thảo sống lâu... sắc nước uống (http://danhydatviet.vn /vi/ news/Duoc-lieu/Cucmui-5441/, ngày 24/11/2013) Chuyên ngành Vi sinh vật học 9 Vi n NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.3 Giới thiệu về vi khuẩn nội sinh 2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh Endophytes, theo định nghĩa là các vi sinh vật (VSV) (chủ yếu là nấm và vi khuẩn) sống trong mô của cây còn tươi cả đời hoặc một... trú ở trong nội mô của thực vật ký chủ và giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh Hầu hết các dạng nội sinh này bắt đầu xuất hiện từ vùng rễ hay bề mặt lá, tuy nhiên, một số loại có thể ký sinh trên hạt Vi khuẩn nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng vai trò là một tác nhân điều hòa sinh học Vi khuẩn nội sinh. .. 2004; Berg et al., 2005) Vi khuẩn nội sinh có Chuyên ngành Vi sinh vật học 10 Vi n NC &PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT thể được xem như là vi khuẩn tập trung trong mô thực vật mà có những dấu hiệu nhiễm bệnh hay hậu quả tiêu cực đối với cây chủ (Schulz và Boyle, 2005) Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trong cây trồng (Quispel, 1992)... Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh Trong đất, vi khuẩn thường tập trung xung quanh rễ cây Rễ cây tác động đến sự phát triển của vi khuẩn, ngược lại vi khuẩn vùng rễ cũng tác động đến hoạt động thực vật Kết quả phân tích cho thấy dịch rễ cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn đất, kích thích sự gia tăng của một số vi khuẩn vùng rễ, dịch rễ có tỉ lệ C/N cao, làm tăng dồi dào vi khuẩn cố định đạm vùng... cho các cây chủ (Sturz et al., 2000; Wellington và Marcela, 2004) Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào các hoạt động sinh học của nấm nội sinh và vi khuẩn nội sinh (Strobel, 2003) Bởi vì sống trong một môi trường tương đối ổn định - trong mô thực vật, endophytes có thể sản xuất được nhiều hoạt tính sinh học hơn các vi khuẩn vùng rễ hoặc bất kỳ vi khuẩn khác mà được phân lập từ... Hoa cây cúc mui ở Hyderabad, Ấn Độ (*Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Tridax _procumbens, ngày 01/08/2013) Bộ phận dùng: Toàn cây - Herba Tridacis Procumbentis 2.2.3 Vùng phân bố, thu hái và nhân giống cây cúc mui Cây gốc ở Trung Mỹ được truyền vào nước ta, nay mọc hoang ở bờ đường, bãi cỏ, đất hoang, đồi núi Để làm thuốc, thu hái toàn cây quanh năm, dùng tươi hay phơi khô (http://danhydatviet.vn /vi/ news/Duoc-lieu/Cuc -mui- 5441/,... dài rễ ở Panicum miliaceum (Harari et al., 1988) Vi khuẩn nốt rễ sống trong rễ lúa giúp cây hấp thu nhiều nitơ, lân, kali và sắt tăng từ 10 - 64% (Biswas et al., 2000) Chaintreuil et al (2000) đã phát hiện những vi khuẩn nốt rễ còn sống trong rễ lúa hoang (Oryza breviligulata) ở vùng Châu Phi và chúng có nguồn gốc từ những cây điên điển (Sesbania sp.) mọc chen lẫn với cây lúa hoang Như vậy vi khuẩn