* Thu mẫu: mẫu cây cúc mui gồm rễ, thân, lá được lấy từ thành phố Cần Thơ.
Trước khi thực hiện đề tài cần lấy mẫu đất đem về phòng thí nghiệm Vi sinh vật để đo độ pH đất.
* Khử trùng bề mặt và phân lập mẫu:
- Rửa thật sạch bùn đất bám ở rễ, thân, lá dưới vòi nước chảy mạnh, để ráo tự nhiên. Dùng kéo cắt rời rễ, thân, lá thành để riêng từng bộ phận trong bọc nylon sạch, buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh (- 5oC) nếu chưa phân lập ngay.
- Khử trùng nước cất, bình tam giác (để đựng mẫu khử), eppendorf, đầu col xanh, col vàng, môi trường PDA, cối, chày. Việc khử trùng mẫu được thực hiện trong
điều kiện vô trùng.
- Cắt các bộ phận thành những khúc nhỏ 2 - 3cm (để riêng từng bộ phận). Sau đó cho từng bộ phận mẫu vào các cốc thủy tinh riêng biệt để tiến hành khử trùng bề mặt mẫu: cho ethanol 70o vào cốc cho vừa ngập mẫu, lắc nhẹ (để mẫu không bị dập) khoảng 30 giây, rửa sạch bằng nước cất, tiếp tục cho dung dịch H2O2 3% vào cốc và ngâm trong khoảng từ 3 - 5 phút, sau đó rửa thật sạch bằng nước cất vô trùng (4 lần) để tẩy rửa hóa chất còn thừa.
- Hút 50µl nước rửa mẫu lần cuối cùng trải trên môi trường PDA đặc (Bảng 1) và ủ ở 30o
C. Sau 2-3 ngày kiểm tra xem có vi sinh vật nào phát triển không. Nếu không có vi sinh vật nào phát triển, chứng tỏ mẫu đã được khử trùng bề mặt sạch và những vi khuẩn phân lập được sau này là VKNS trong cây.
- Gắp khoảng 2g mẫu rễ (hoặc thân, hoặc lá) cho vào cối vô trùng giã nhuyễn rồi thêm 0,5 - 2ml nước cất vô trùng vào cối, để yên 10 phút, trộn và hút lấy phần dịch trích cho vào tube eppendorf 1,5 ml, để yên 10 phút cho dịch mẫu lắng xuống và hút 100µl phần trong cho vào 900µl nước cất ; có nghĩa là đã pha loãng 10 lần, tiến hành pha loãng 100, 10-1,10-2. Sau đó, hút 100µl dịch mẫu đã pha loãng cho vào môi trường Nfb bán đặc (Bảng 2) trong ống nghiệm, đậy nắp lại cho vào tủ ủ, ủ ở 30oC. Sau 2 - 4 ngày, ta thấy xuất hiện vòng màu sáng (vòng pellicle), cách bề mặt môi trường 2 - 5cm (Tran Van Van et al., 1997), đó là chứng tỏ có sự hiện diện của VKNS.
- Chuyển vi khuẩn từ môi trường bán đặc sang môi trường đặc: hút 50 µl từ lớp màng mỏng để lấy vi khuẩn trải lên bề mặt đĩa chứa môi trường PDA đặc, trải đều và đậy nắp lại cho vào tủ ủ, ủ ở 30o
C. Sau 2 - 3 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, nhỏ, tròn và phải nằm trên đường cấy cấy chuyển sang những đĩa khác cho tới khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng, chuyển mẫu đã ròng vào ống nghiệm chứa môi trường đặc trữ ở - 5oC và được xem là một dòng vi khuẩn.
Bảng 1. Thành phần môi trường PDA
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Khoai tây 200
Dextrose 20
Nước cất 1000 ml
Kháng sinh 1 ml
pH 5,6 0,2
(*Ghi chú: Môi trường đặc thêm 20g agar/ l môi trường; môi trường bán đặc thêm 2g agar/ l môi trường).
Bảng 2. Thành phần môi trường Nfb (Kireg và Dobereiner, 1984)
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Malic acid 5 K2HPO4 5 MgSO4.7H2 0,2 CaCl2 0,02 NaCl 0,1 KOH 4,5 FeEDTA (1,64%) 4 ml/l
Dung dịch nguyên tố vi lượng (a)
2 ml/l
Dung dịch vitamin (b) 1 ml/l
Bromothymol blue 0,5% trong KOH 0,2N 2 ml/l
pH 5,5
(*Ghi chú: Môi trường đặc thêm 20g agar/ l môi trường; môi trường bán đặc thêm 2g agar/ l môi trường).