3.2.2.1 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc
Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập ta đồng thời tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Tuy nhiên, đối với những khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát.
3.2.2.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002).
Quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học: nhỏ 20µl nước cất vô trùng lên kính mang vật, dùng kim cấy đã được hơ nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội lấy một ít mẫu vi khuẩn từ khuẩn lạc trải đều lên giọt nước, đậy kính đậy vật lại và quan sát ở độ phóng đại 400 lần, ghi nhận sự chuyển động của vi khuẩn (nếu có), quan sát và ghi nhận hình dạng.
3.2.2.3 Nhuộm Gram
Khi mẫu đã ròng, nhuộm Gram mẫu theo các bước sau: - Lấy 10 µl nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật.
- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
- Nhỏ từ một đến hai giọt Crytal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều Crystal violet bằng que cấy và để 2 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước.
- Nhỏ từ 1 - 2 giọt dung dịch Iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong một phút. - Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Rửa lại bằng cồn 70o thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sao cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô. - Nhỏ từ 1 - 2 giọt Fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của Fushin.
- Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước.
Gram dương, có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm và tiến hành đo kích thước tế bào vi khuẩn.
3.2.2.4 Đo kích thước vi khuẩn
Phương pháp đo kích thước vi khuẩn: đặt thước trắc vi vật kính (miếng kính đặc biệt dài 2 cm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng 10 µm) vào bàn kính, chỉnh cho thấy rõ ảnh của thước. Dịch chuyển thước trắc vi vật kính và thước trắc vi thị kính (miếng kính tròn có khắc 100 vạch đặt giữa hai thấu kính của thị kính) sao cho 2 thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho 1 vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và một vạch thứ 2 nào đó của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch khác của thước trắc vi thị kính. Đếm số khoảng của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính. Trị số mỗi khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thức sau: x= 10µm*N/n.
Trong đó: N là số khoảng của thước trắc vi vật kính, N= 6 n là số khoảng của thước trắc vi thị kính, n= 35
x là trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính. Ta có: x = 1,7143 µm. Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh để thấy rõ ảnh của vi mẫu. Di chuyển mẫu vật để một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, tìm vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo. Đếm số khoảng thước trắc vi nằm trong khoảng giữa 2 vạch này. Suy ra kích thước vi mẫu bằng trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính nhân với số khoảng đếm được.