3.1.1 Thời gian nghiên cứu
- Từ tháng 06 đến tháng 07 năm 2013 tìm tài liệu và viết đề cương luận văn. - Từ tháng 08 đến tháng 11 năm 2013 chuẩn bị vật liệu, vật dụng và thực hiện đề tài.
- Cuối tháng 11 đến đầu tháng 12 năm 2013 hoàn thành và báo cáo luận văn tốt nghiệp.
3.1.2 Địa điểm thực hiện
- Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, phòng Sinh hóa, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
3.1.3 Vật liệu thí nghiệm
- Mẫu cây cúc mui (Tridax procumbens) gồm toàn bộ rễ, thân, lá và đất mọc hoang ở khuôn viên trường Đại học Cần Thơ.
3.1.4 Dụng cụ và thiết bị
Sử dụng dụng cụ và thiết bị của phòng thí nghiệm Vi sinh vật có tại Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ:
- Micropipet
- Đĩa petri, ống nghiệm - Ống trữ mẫu
- Ống đong 10ml, 100ml
- Cốc thủy tinh 10ml, 100ml, 200ml - Kẹp, kim cấy, que trải mẫu, đèn cồn - Lame, Lacmelle
- Máy Vortex
- Tủ cấy vi sinh vật Airstream Biosafe II - ESCO (Pháp) - Tủ ủ vi sinh vật Binder (Đức)
- Máy PCR - Bộ điện di - Cân điện tử.
- Nồi khử trùng nhiệt ướt - Máy ly tâm
- Sổ tay ghi chép số và một số dụng cụ cần thiết khác.
3.1.5 Hóa chất
- Hóa chất dùng khử mẫu: nước cất vô trùng, cồn 70o, dung dịch H2O2 3%. - Môi trường agar PDA.
- Hóa chất dùng nhuộm Gram vi khuẩn: Iod, Fushin, Crystal violet, cồn 70o, nước cất vô trùng.
- Hóa chất để đo IAA: FeCl3, H2SO4, K2HPO4, KH2PO4, IAA thương mại.
- Hóa chất để đo lượng đạm vi khuẩn cố định được: KCl 2M, (NH4)2SO4, phenol nitroprusside, sodium hypochloride.
- Hóa chất dùng để trích DNA vi khuẩn đã phân lập: TE pH (8), SDS 10%, isopropanol, ethanol (cồn) 70%, CTAB 10%/NaCl 0,7M, Proteinase K (20 mg/ml), nước cất hai lần vô trùng, Chloroform: isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1). Dung dịch TE gồm các thành phần sau: 1% Triton X - 100, 1M Tris HCl - 8,5, 0,5 M EDTA - 8,0, nước cất vô trùng.
- Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng PCR nhận diện vi khuẩn đã phân lập : PCR buffer, Taq polymerase, DNA vi khuẩn đã phân lập, nước cất hai lần vô trùng, dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng điện di gel chứa sản phẩm phản ứng PCR: Agarose 1,2%, TBE buffer 1X, loading buffer, thang chuẩn PstI, ethidium bromide (EtBr).
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây cúc mui
* Thu mẫu: mẫu cây cúc mui gồm rễ, thân, lá được lấy từ thành phố Cần Thơ.
Trước khi thực hiện đề tài cần lấy mẫu đất đem về phòng thí nghiệm Vi sinh vật để đo độ pH đất.
* Khử trùng bề mặt và phân lập mẫu:
- Rửa thật sạch bùn đất bám ở rễ, thân, lá dưới vòi nước chảy mạnh, để ráo tự nhiên. Dùng kéo cắt rời rễ, thân, lá thành để riêng từng bộ phận trong bọc nylon sạch, buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh (- 5oC) nếu chưa phân lập ngay.
- Khử trùng nước cất, bình tam giác (để đựng mẫu khử), eppendorf, đầu col xanh, col vàng, môi trường PDA, cối, chày. Việc khử trùng mẫu được thực hiện trong
điều kiện vô trùng.
- Cắt các bộ phận thành những khúc nhỏ 2 - 3cm (để riêng từng bộ phận). Sau đó cho từng bộ phận mẫu vào các cốc thủy tinh riêng biệt để tiến hành khử trùng bề mặt mẫu: cho ethanol 70o vào cốc cho vừa ngập mẫu, lắc nhẹ (để mẫu không bị dập) khoảng 30 giây, rửa sạch bằng nước cất, tiếp tục cho dung dịch H2O2 3% vào cốc và ngâm trong khoảng từ 3 - 5 phút, sau đó rửa thật sạch bằng nước cất vô trùng (4 lần) để tẩy rửa hóa chất còn thừa.
- Hút 50µl nước rửa mẫu lần cuối cùng trải trên môi trường PDA đặc (Bảng 1) và ủ ở 30o
C. Sau 2-3 ngày kiểm tra xem có vi sinh vật nào phát triển không. Nếu không có vi sinh vật nào phát triển, chứng tỏ mẫu đã được khử trùng bề mặt sạch và những vi khuẩn phân lập được sau này là VKNS trong cây.
- Gắp khoảng 2g mẫu rễ (hoặc thân, hoặc lá) cho vào cối vô trùng giã nhuyễn rồi thêm 0,5 - 2ml nước cất vô trùng vào cối, để yên 10 phút, trộn và hút lấy phần dịch trích cho vào tube eppendorf 1,5 ml, để yên 10 phút cho dịch mẫu lắng xuống và hút 100µl phần trong cho vào 900µl nước cất ; có nghĩa là đã pha loãng 10 lần, tiến hành pha loãng 100, 10-1,10-2. Sau đó, hút 100µl dịch mẫu đã pha loãng cho vào môi trường Nfb bán đặc (Bảng 2) trong ống nghiệm, đậy nắp lại cho vào tủ ủ, ủ ở 30oC. Sau 2 - 4 ngày, ta thấy xuất hiện vòng màu sáng (vòng pellicle), cách bề mặt môi trường 2 - 5cm (Tran Van Van et al., 1997), đó là chứng tỏ có sự hiện diện của VKNS.
- Chuyển vi khuẩn từ môi trường bán đặc sang môi trường đặc: hút 50 µl từ lớp màng mỏng để lấy vi khuẩn trải lên bề mặt đĩa chứa môi trường PDA đặc, trải đều và đậy nắp lại cho vào tủ ủ, ủ ở 30o
C. Sau 2 - 3 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, nhỏ, tròn và phải nằm trên đường cấy cấy chuyển sang những đĩa khác cho tới khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng, chuyển mẫu đã ròng vào ống nghiệm chứa môi trường đặc trữ ở - 5oC và được xem là một dòng vi khuẩn.
Bảng 1. Thành phần môi trường PDA
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Khoai tây 200
Dextrose 20
Nước cất 1000 ml
Kháng sinh 1 ml
pH 5,6 0,2
(*Ghi chú: Môi trường đặc thêm 20g agar/ l môi trường; môi trường bán đặc thêm 2g agar/ l môi trường).
Bảng 2. Thành phần môi trường Nfb (Kireg và Dobereiner, 1984)
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Malic acid 5 K2HPO4 5 MgSO4.7H2 0,2 CaCl2 0,02 NaCl 0,1 KOH 4,5 FeEDTA (1,64%) 4 ml/l
Dung dịch nguyên tố vi lượng (a)
2 ml/l
Dung dịch vitamin (b) 1 ml/l
Bromothymol blue 0,5% trong KOH 0,2N 2 ml/l
pH 5,5
(*Ghi chú: Môi trường đặc thêm 20g agar/ l môi trường; môi trường bán đặc thêm 2g agar/ l môi trường).
3.2.2 Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn.
3.2.2.1 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc
Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập ta đồng thời tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Tuy nhiên, đối với những khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát.
3.2.2.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002).
Quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học: nhỏ 20µl nước cất vô trùng lên kính mang vật, dùng kim cấy đã được hơ nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội lấy một ít mẫu vi khuẩn từ khuẩn lạc trải đều lên giọt nước, đậy kính đậy vật lại và quan sát ở độ phóng đại 400 lần, ghi nhận sự chuyển động của vi khuẩn (nếu có), quan sát và ghi nhận hình dạng.
3.2.2.3 Nhuộm Gram
Khi mẫu đã ròng, nhuộm Gram mẫu theo các bước sau: - Lấy 10 µl nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật.
- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
- Nhỏ từ một đến hai giọt Crytal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều Crystal violet bằng que cấy và để 2 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước.
- Nhỏ từ 1 - 2 giọt dung dịch Iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong một phút. - Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Rửa lại bằng cồn 70o thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sao cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô. - Nhỏ từ 1 - 2 giọt Fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của Fushin.
- Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước.
Gram dương, có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm và tiến hành đo kích thước tế bào vi khuẩn.
3.2.2.4 Đo kích thước vi khuẩn
Phương pháp đo kích thước vi khuẩn: đặt thước trắc vi vật kính (miếng kính đặc biệt dài 2 cm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng 10 µm) vào bàn kính, chỉnh cho thấy rõ ảnh của thước. Dịch chuyển thước trắc vi vật kính và thước trắc vi thị kính (miếng kính tròn có khắc 100 vạch đặt giữa hai thấu kính của thị kính) sao cho 2 thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho 1 vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và một vạch thứ 2 nào đó của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch khác của thước trắc vi thị kính. Đếm số khoảng của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính. Trị số mỗi khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thức sau: x= 10µm*N/n.
Trong đó: N là số khoảng của thước trắc vi vật kính, N= 6 n là số khoảng của thước trắc vi thị kính, n= 35
x là trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính. Ta có: x = 1,7143 µm. Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh để thấy rõ ảnh của vi mẫu. Di chuyển mẫu vật để một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, tìm vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo. Đếm số khoảng thước trắc vi nằm trong khoảng giữa 2 vạch này. Suy ra kích thước vi mẫu bằng trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính nhân với số khoảng đếm được.
3.2.3 Khảo sát khả năng cố định đạm của một số dòng vi khuẩn đã phân lập. lập.
Nguyên tắc: xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng giữa phenol và NH3 với sự hiện diện của tác nhân oxy hoá là hypochlorite hình thành phức có màu xanh, dưới pH kiềm. Sự hiện diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3 phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982).
Hóa chất:
- Chuẩn bị dung dịch KCl 2M :Hòa tan 15g KCl trong 100ml nước cất.
- Stock (NH4+): hoà tan 0,4717g (NH4)2S04 vào 1lít nước. Trữ dung dịch ở tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 40ml stock NH4+ để được 200ml, sau cùng được dung dịch chứa 2µg/ml.
- Thuốc thử phenol nitroprusside: Hoà tan 5g phenol và 0.025g nitroprusside trong nước được 0,5 l.
- Hypocloride buffer: Hoà tan 15ml NaOCl +5g NaOH vào nước được 0,5 l. - Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường Nfb lỏng (không N). Cho 15 ml môi trường NFb vào các ống nghiệm nắp đen khử trùng nhiệt ướt 120oC trong 20 phút. Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại 3 lần. Nuôi các dòng trên máy lắc 200 vòng/phút. Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 0, 2, 4, 6 (sau khi chủng).
Phương pháp định lượng:
Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hoà tan và nửa lít nước cất.
Pha buffer: Cho 15ml NaOCl có nồng độ thường (5 - 5,25%) và 5g NaOH vào 0,5 lit nước cất.
Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm.
Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 5ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 0 ml NH4+ Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 4ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 1 ml NH4+ Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 3ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 2 ml NH4+ Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 2ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 3 ml NH4+ Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 1ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 4ml NH4+ Đường chuẩn 5 ppm gồm có: 0ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử và 5 ml NH4+ Đo nồng độ NH4+
trong dịch vi khuẩn:
- Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào các eppendorf. - Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
Hút 1 ml dịch vi khuẩn đã ly tâm và 4ml H2O; 5 ml buffer, 5ml thuốc thử. Tiến hành đo phổ OD.
Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+, đo phổ OD ở bước sóng 636nm, sau đó vẽ trên đồ thị Excel có thể tính ra được nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn.
Hình 7: Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ NH4+
(*Ghi chú: Từ trái qua phải của hình là 0, 1, 2, 3, 4 và 5 ppm).
3.2.4 Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn đã phân lập. phân lập.
Dùng micropipette hút lần lượt 5µl dd VKNS từ mỗi ống nghiệm môi trường tăng sinh PDA lỏng có bổ sung yeast extract 1% nhỏ lên đĩa môi trường chứa lân khó tan (NBRIP) đặc (Bảng 3), mỗi đĩa 1 dòng, 3 lần lặp lại. Sau đó ủ ở 30oC, theo dõi sự phát triển của chúng từ 1 - 2 ngày, dòng nào phát triển được trên môi trường NBRIP thì có khả năng hòa tan lân khó tan. Quan sát và đo đường kính vòng halo, khuẩn lạc mỗi ngày.
Độ hữu hiệu của các dòng vi khuẩn hòa tan lân khó tan
Hiệu quả hòa tan lân E được tính theo công thức: Đường kính halo
E = x 100 (C. NGUYEN và ctv, 1992) Đường kính khuẩn lạc
Bảng 3. Công thức môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999)
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Glucose 10 Ca3(PO4)2 5 MgCl2.6H2O 5 MgSO4.7H2O 0,25 KCl 0,2 Bromo 3 ml (NH4)2SO4 0,1 pH 7,0
(*Ghi chú: Môi trường đặc thêm 20g agar/ l môi trường; môi trường bán đặc thêm 2g agar/ l môi trường).
3.2.5 Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn đã phân lập được. lập được.
- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb lỏng (không Tryptophan).
- Cho 15 ml môi trường NFb vào các ống nghiệm nắp đen khử trùng nhiệt ước 121o C trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại 3 lần.
- Nuôi các dòng trên máy lắc 200 vòng/phút, trùm kín các ống nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA sinh ra bị phân hủy bởi ánh sáng.
Định lượng IAA trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng).
- Chuẩn bị thuốc thử Salkowski R2: 4,5 g FeCl3 trong 1lít H2SO4 10,8 M. - Chuẩn bị phosphat buffer 200ml:
A: KH2PO4 0,136g/100ml nước cất B: K2HPO4 0,174g/100ml nước cất
- Lấy 39 ml A, 61 ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, chỉnh pH 7.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút cẩn thận 1ml phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào các ống Durham. - Thêm 2ml thuốc thử Salkowski R2 vào các ống Durham trên.
- Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn sau đó đo quang phổ OD ở bước sóng 530 nm.
- Chuẩn bị đường chuẩn IAA: cân 0,0016g IAA tổng hợp hòa tan với 10 ml phosphat buffer được nồng độ là 160 µg/l. Sau đó pha loãng ra các nồng độ 0; 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 80 µg/ml.
Hình 8: Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ IAA
(*Ghi chú: Từ trái qua phải của hình là 0, 2,5, 5, 10, 20, 30, 40 và 80 µg/ml)
- Kết quả đo phổ OD được vẽ thành đồ thị đường chuẩn IAA trên excel với trục tung là phổ OD có giá trị từ 0 đến 3, trục hoành là nồng độ IAA có giá trị từ 0 đến 80