Trong đất, vi khuẩn thường tập trung xung quanh rễ cây. Rễ cây tác động đến sự phát triển của vi khuẩn, ngược lại vi khuẩn vùng rễ cũng tác động đến hoạt động thực vật. Kết quả phân tích cho thấy dịch rễ cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn đất, kích thích sự gia tăng của một số vi khuẩn vùng rễ, dịch rễ có tỉ lệ C/N cao, làm tăng dồi dào vi khuẩn cố định đạm vùng rễ, còn những loại vi khuẩn này có khả năng cố định đạm cho cây hấp thụ, thúc đẩy sự kéo dài của rễ, giải phóng chất khoáng qua việc tiết acid, làm tăng hòa tan của lân và những nguyên tố dinh dưỡng khác cho cây hấp thụ, có vai trò quan trọng trong phân hủy sinh học (Kloepper, 1994).
Vi khuẩn bám vào mặt rễ, xâm nhập vào bên trong rễ, phát triển trên hệ thống rễ và nhân mật số do sự điều khiển của gen chuyên biệt. Khi mật số vi khuẩn có ích đưa vào đủ lớn, chúng sẽ phát huy hiệu quả tích cực như cung cấp dinh dưỡng cho cây, quan trọng nhất là đạm (Kloepper, 1994). Việc xâm nhập vào rễ là yếu tố quyết định sự thành công trong mối quan hệ giữa thực vật và vi khuẩn, mật số của vi khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, nhất là môi trường vùng rễ (Elmerich và New, 2007).
2.3.5.1 Khả năng cố định đạm của vi khuẩn nội sinh a. Vai trò của vi khuẩn trong chu trình nitơ
Nitơ là nguyên tố dinh dưỡng rất quan trọng đối với sinh vật bậc cao và cả vi sinh vật. Trong không khí nitơ chiếm khoảng 78,16% thể tích của không khí, với số lượng lớn như vậy nhưng cây trồng không thể đồng hóa được. Tuy nhiên, nhờ có hệ vi sinh vật nên cây trồng có thể hấp thu nitơ ở dạng này. Vì vậy, chu trình nitơ là một trong các quá trình hóa học quan trọng nhất trong đất, gồm các quá trình cơ bản sau:
- Quá trình amon hóa: Quá trình phân hủy chuyển hóa các hợp chất hữu cơ dưới tác dụng của vi sinh vật để hình thành các hợp chất hữu cơ giản đơn là NH4+ hoặc NH3 được gọi là quá trình amon hóa.
- Quá trình nitrate hóa: NH4+ được hình thành từ quá trình amon hóa hoặc NH4+ có ở các loại phân hóa học sẽ được tiếp tục chuyển hóa thành nitrite (NO2-) và sau đó thành nitrate (NO3-) dưới tác dụng hệ vi khuẩn nitrite (Nitrosomonas, Nitrocystis,
Nitrosobobus, Nitrosopira) và vi khuẩn nitrate hóa (Nitrobacter, Nitrospira,
Nitrococcus).
NH4+ + 3/2 O2 → NO2- + H2O + 2H + năng lượng NO2- + ½ O2 → NO3- + năng lượng
- Quá trình phản nitrate hóa: Trong điều kiện có rất ít hoặc không có oxy, các dạng nitơ hợp chất (NO3- , NO2- ) bị chuyển hóa thành nitơ phân tử dưới tác dụng vi khuẩn khử nitrate (Pseudomonas denitrificans, Ps.acruginosa, Ps.stutzeri,…) (Nguyễn Như Thanh, 2004).
b. Cấu tạo enzyme nitrogenase và cơ chế cố định nitơ
Những tổn thất về nitơ do quá trình phản nitrate hóa gây nên, được bù đắp lại nhờ một quá trình sinh học đặc biệt được gọi là quá trình cố định nitơ. Nhóm vi sinh vật có khả năng thực hiện quá trình này được gọi là các vi sinh vật cố định nitơ, chúng có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử trong không khí thành các hợp chất chứa nitơ và làm giàu thêm nguồn dự trữ thức ăn chứa nitơ trong đất (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007). Nitrogenase là một phức hợp gồm hai thành phần là protein: Protein nhỏ chứa sắt (Fe - Pro), protein lớn chứa Fe và Mo (MoFe - Pro) (Trần Cẩm Vân, 2004).
- MoFe - Pro (thành phần I), gồm có bốn đơn vị phụ với khối lượng phân tử tổng cộng khoảng 180.000 - 235.000 Da. Có hai nguyên tử Mo cho mỗi phân tử trong hai cụm Mo - Fe - S và có một cụm Fe - S thay đổi.
- Fe - Pro (thành phần thứ II), gồm hai tiểu phần đồng nhất có khối lượng phân tử khoảng 30.000 - 70.000 Da. Nó chứa một cụm sắt - sulfure (4Fe - 4S) tham gia các phản ứng oxy hóa khử bao hàm sự biến đổi nitơ sang NH3.
Cả thành phần I và II đều mẫn cảm với oxy. Vì vậy việc chiết xuất và phân tích Nitrogenase đều phải tiến hành trong điều kiện kỵ khí (Nguyễn Như Thành, 1990).
Phản ứng cố định đạm sinh học xảy ra được ở một số vi sinh vật là nhờ sự xúc tác riêng biệt enzyme nitrogenase. Enzyme nitrogenase xúc tác biến đổi đạm ở thể khí (N2) thành NH3. Đầu tiên, các loài vi khuẩn cố định đạm phá vỡ dần liên kết cộng hóa trị bậc III của nitơ (dạng rất bền) bằng cách gắn thêm dần dần những proton [H+] vào chúng (David et al., 2003).
Phản ứng khử nitơ dưới tác dụng của enzyme nitrogenase có thể biểu thị qua phương trình.
N2 + 8e- + 8H+ + 16ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP +16P
Phương trình khử này gồm nhiều phương trình phản ứng kế tiếp nhau:
NH3 sẽ kết hợp với acid hữu cơ tạo thành protein NH3 + acid hữu cơ → amino acid → protein
2.3.5.2 Khả năng hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh
Lân là nguyên tố dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng, là thành phần cấu trúc nên các phân tử đa lượng, hiện diện nhiều trong các bộ phận non của cây và trong hạt giống. Phân lân giúp cây phân chia tế bào nhanh hơn, cung cấp nguồn năng lượng cho cây sử dụng. Rất cần thiết ở giai đoạn đầu, lân giúp bộ rễ phát triển mạnh, cây đâm cành mạnh, mau ra hoa, dễ đậu trái. Lân còn giúp cải thiện phẩm chất trái làm cho thịt trái chắc hơn. Thiếu lân bộ rễ của cây sẽ kém phát triển, tốc độ sinh trưởng của cây giảm, cây cho nhánh ít, lá mỏng, năng suất trái giảm. Cây trồng
2[H+] 2[H+]
2[H+]
ATP ATP ATP
chỉ có thể sử dụng được lân từ đất dưới dạng hòa tan trong dung dịch đất. Vì vậy, cây trồng chỉ có thể hút được lân ở dạng dễ tiêu trong đất.
Hầu hết đất nông nghiệp chứa lượng lớn lân, một phần đáng kể trong đó được tích tụ là kết quả của việc bón phân lân thường xuyên. Tuy nhiên, một lượng lớn phosphate vô cơ hòa tan cung cấp cho đất dưới dạng phân bón hóa học thì nhanh chóng bị cố định và trở thành dạng khó sử dụng đối với cây.
Nhiều loài vi khuẩn có khả năng chuyển hóa dạng lân khó tan trong đất như calcium monohydrogen phosphate (CaHPO4)2, calcium monohydrogen dihydrate phosphate (CaHPO4.2H2O), calcium orthophosphate (Ca3(PO4)2) thành dạng lân dễ tan để cây trồng sử dụng. Đặng Thị Huỳnh Mai và Cao Ngọc Điệp (2002) đã phân lập được vi khuẩn và nấm có khả năng chuyển hóa lân dạng khó tan trong các loại đất ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Kucey et al. (1989), Rasid et al. (2004) giải thích sự hòa tan lân dạng khó tan trong đất là do sự bài tiết các acid hữu cơ và xác định tác nhân này làm giảm pH đất, điều này rất quan trọng trong cơ chế hòa tan lân dạng khó tan trong đất. Sự có mặt của các acid hữu cơ như: acid lactic, acid citric, acid gluconic, acid succinic, acid fumaric, acid acetic, acid oxalic…trong đất cao cũng là nguyên nhân làm giảm pH đất.
Sự khoáng hóa của những hợp chất này được thực hiện bới hoạt động của nhiều phosphatase (còn được gọi là phosphohydrolase). Những phản ứng khử phosphoryl này liên quan đến sự thủy phân cầu nối phosphoanhydride. Phosphohydrolase acid, không giống phosphatase kiềm, hoạt động xúc tác tối ưu ở giá trị pH từ acid đến trung tính. Hơn thế nữa, chúng còn được phân nhóm thành phosphatase acid đặc hiệu hoặc không đặc hiệu, liên quan đến tính đặc hiệu cơ chất của chúng. Phosphohydrolase đặc hiệu với những hoạt tính khác nhau bao gồm 3’- nucleotidase, 5’- nucleotidase, hexose phosphate và phytase. Một nhóm đặc hiệu của enzyme giải phóng P có thể cắt cầu nối C-P từ phosphonate hữu cơ (Rossosilini et al., 1998).
2.3.5.3 Khả năng tổng hợp indole - 3 - acetic acid (IAA) của vi khuẩn nội sinh.
Indole -3- acetic acid (IAA) hay còn gọi là auxin, là chất điều hòa chủ yếu của sự sinh trưởng thực vật. IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, phân hóa sinh mô, phát triển trái và hạt, chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng.
Vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật như việc cố định đạm VKNS. Ngoài ra, vi khuẩn còn sản sinh tổng hợp auxin, cytokinin tác động đến quá trình tổng hợp ethylene của cây, có vai trò trung tâm trong sự tăng trưởng thực vật, chất điều hòa quá trình sinh học từ phân chia tế bào, kéo dài, phân hóa sinh mô, phát triển trái và hạt. Nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng tổng hợp IAA (Glick, 1995).
IAA kích thích mạnh mẽ quá trình tăng trưởng và các hoạt động sinh lý trong cây, đặc trưng nhất là quá trình sinh trưởng của cây thông qua sự tăng trưởng của các loại tế bào. Tác động của auxin phụ thuộc vào dạng tế bào, ở các nồng độ khác nhau như IAA kích thích đồng thời sự giãn dài trục lá mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự khởi đầu của rễ bên và thành lập lông rễ (Theologis và Ray, 1982; Gray et al., 2001).
Trong tự nhiên, IAA có hai dạng: IAA liên kết (CH2-COO-R) và IAA tự do (R- CH2COOH). Chỉ có IAA tự do điều khiển các hoạt động sinh lý của thực vật, đặc trưng là sự tăng trưởng của cây qua sự tăng trưởng của tế bào (Suzuki et al., 2003).
Xét cơ chế tổng hợp IAA của vi khuẩn Pseudomonas cho thấy L-Tryptophan đóng vai trò quan trọng, được xem là tiền chất trong lộ trình tổng hợp IAA của các thực vật lẫn vi sinh vật. Có 3 lộ trình tiêu biểu nhất cho sự biến đổi của L- tryptophan thành IAA đã được Koga et al., (1991) mô tả chi tiết như sau:
Lộ trình indole -3- pyruvic acid
Tryptophan indole -3- pyruvic acid indole -3- acetaldehyde IAA Lộ trình tryptamine
Tryptophan tryptamine indole -3- acetaldehyde IAA Lộ trình indole -3- acetamide
Tryptophan indole -3- acetamine IAA
2.3.5.4 Khả năng đối kháng sinh học của vi khuẩn nội sinh với một số vi sinh vật gây bệnh
a. Khả năng đối kháng sinh học (biocontrol)
Vi khuẩn nội sinh có thể có khả năng làm yếu đi hay ngăn cản tác hại của các vi sinh vật gây hại. Một trong những sự đóng góp của vi khuẩn nội sinh từ thực vật là một vài vi khuẩn nội sinh từ những thực vật khác nhau đã cho thấy hoạt tính sinh học tiềm năng như hoạt động kháng khuẩn (Ravikumar et al., 2010), kháng nấm (Cho et
al., 2007) và chống ung thư (Taechowisan et al., 2007). Một Vi khuẩn nội sinh tổng hợp các chất hóa học có trong thực vật, nhiều loài có khả năng tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật để bảo vệ chống lại các tác nhân gây bệnh và một số các hợp chất này đã được chứng minh bằng việc khám phá ra các loại thuốc kháng sinh hữu ích. Sự đa dạng của các hợp chất được tạo ra bởi các vi khuẩn nội sinh đã được chứng minh để chống lại tác nhân gây bệnh và thậm chí cả bệnh ung thư ở động vật bao gồm cả con người. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh vai trò của vi khuẩn nội sinh trong việc ngăn chặn sự tác hại của nấm Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum
trên bông vải (Chen et el., 1995); nấm Fusarium oxysporum f. sp. pisi trên đậu pea (Benhamou et al., 1996), Verticillium albo-atrum và Rhizoctonia solani trên khoai tây (Nowak et al., 1995), Rhizoctonia solani trên khoai tây (Pleban et al., 1995) và lúa (Krishnamurthy và Gnanamanickam, 1997)…Một nghiên cứu gần đây của Swetha Sunkar et al. (2013), một loại vi khuẩn nội sinh đã được xác định là vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa được phân lập từ có khả năng chống lại một số vi khuẩn gây bệnh như Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli và
Salmonella typhi.
Nhiều giống VKNS như Pseudomonas, Burkholderia và Bacillus (Lodewyckx et al., 2002) được biết là những loài trong những giống vi khuẩn tổng hợp ra nhiều sản phẩm thứ cấp bao gồm các kháng sinh, chất kháng ung thư, hợp chất hữu cơ thơm, kháng nấm, kháng virus, kháng sâu... và những sản phẩm thứ cấp này được trích ly từ sự lên men của những loài vi khuẩn này (Ryan et al., 2008).
b. Một số vi khuẩn gây bệnh phổ biến
* Escheriachia coli (E. coli)
Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) thuộc họ Enterobacteriaceae, họ vi khuẩn thường trực ở trong ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh ở đường ruột và ở các cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997). Theo Nguyễn Như Thanh et al. (1997), E. coli
là một trực khuẩn ngắn 2 đầu tròn, kích thước 2 - 3 µm. Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Trong môi trường nuôi cấy, có khi quan sát thấy những trực khuẩn dài 4 - 8 µm. Phần lớn vi khuẩn E. coli có khả năng di động do có tiên mao ở xung quanh thân, nhưng cũng có một số chủng không có khả
Trong điều kiện bình thường E. coli khu trú thường xuyên ở phần sau của ruột, ít khi có ở dạ dày hay đoạn đầu ruột non của động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát triển nhanh về số lượng, độc lực, gây loạn khuẩn, bội nhiễm đường tiêu hóa và trở thành nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978).
Hình 5: Vi khuẩn Escherichia coli
(*Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/File:EscherichiaColi_NIAID.jpg, ngày 17/11/2013)
*Aeromonas hydrophila
Trước đây, Aeromonas thuộc họ Vibrionaceae do chúng có một vài đặc điểm tương tự Vibrio. Nhưng đến giữa thập niên 80 Aeromonas được tách ra một họ riêng là Aeromonadaceae (Honerman và Moris, 2007), bởi có các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa khác biệt như không mẫn cảm với phản ứng O/129 (150µg) ngoại trừ A. caviae (Trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008).
Theo Barrow và Feltham (1993), Aeromonas chia thành 2 nhóm dựa trên khả năng di động và ngưỡng nhiệt độ phát triển của chúng. Nhóm thứ nhất gồm: A. hydrophila, A. sobria và A. caviae có các đặc điểm là có khả năng di động, hai đầu hơi tròn, Gram âm, hình que ngắn, hiếu khí không bắt buộc, phát triển được ở 37oC… nhóm thứ hai là A. salmonicida (có ba loài phụ gồm: A. salmonicada, A.
achromogenes và A. nova) có đặc điểm tương tự nhưng chúng chỉ phát triển tốt nhất ở
22oC hoặc thấp hơn và không có tiêm mao cũng như chúng không có khả năng di động (Trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008).
Shotts và Rimler (1973), Aeromonas hydrophila có những đặc trưng sau: Gram âm, que thẳng, kích thước khoảng 0,5x1,4 - 4,0 µm, có roi ở 2 cực cơ thể, kỵ khí, lên men carbonate hình thành acid hoặc khí gas, oxydase dương tính, khử nitrate.
Aeromonas hydrophila khi phát triển trên môi trường đặc trưng SA sẽ cho các khuẩn lạc có dạng tròn, hơi lồi, nhẵn và có màu vàng nhạt (Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005).
B. Austin và D. Austin (1986), cho rằng A. hydrophila là nguyên nhân của một vài tình trạng bệnh khác nhau như thối vây, bệnh đốm đỏ và thường liên kết với mầm bệnh khác như A. salmonicida. Theo Lewis và Plumb (1979) cho rằng trong các chủng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophila được xem là chủng gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất, gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết ở những loài cá nuôi và cá tự nhiên, theo Angka (1990), A. hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java-Indonesia và gây tỷ lệ chết từ 80-90%. Bên cạnh đó, trong báo cáo của Saitanu et al. (1982) đã tìm thấy vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết do bệnh nhiễm trùng máu trên cá chép.
Hình 6: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila
(*Nguồn:http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%ADptin:Aeromonas_hydrophila.jpg, ngày 17/11/2013)
2.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật cố định đạm trên thế giới và trong nước