lập được.
- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb lỏng (không Tryptophan).
- Cho 15 ml môi trường NFb vào các ống nghiệm nắp đen khử trùng nhiệt ước 121o C trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại 3 lần.
- Nuôi các dòng trên máy lắc 200 vòng/phút, trùm kín các ống nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA sinh ra bị phân hủy bởi ánh sáng.
Định lượng IAA trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng).
- Chuẩn bị thuốc thử Salkowski R2: 4,5 g FeCl3 trong 1lít H2SO4 10,8 M. - Chuẩn bị phosphat buffer 200ml:
A: KH2PO4 0,136g/100ml nước cất B: K2HPO4 0,174g/100ml nước cất
- Lấy 39 ml A, 61 ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, chỉnh pH 7.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút cẩn thận 1ml phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào các ống Durham. - Thêm 2ml thuốc thử Salkowski R2 vào các ống Durham trên.
- Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn sau đó đo quang phổ OD ở bước sóng 530 nm.
- Chuẩn bị đường chuẩn IAA: cân 0,0016g IAA tổng hợp hòa tan với 10 ml phosphat buffer được nồng độ là 160 µg/l. Sau đó pha loãng ra các nồng độ 0; 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 80 µg/ml.
Hình 8: Xây dựng đường chuẩn đo nồng độ IAA
(*Ghi chú: Từ trái qua phải của hình là 0, 2,5, 5, 10, 20, 30, 40 và 80 µg/ml)
- Kết quả đo phổ OD được vẽ thành đồ thị đường chuẩn IAA trên excel với trục tung là phổ OD có giá trị từ 0 đến 3, trục hoành là nồng độ IAA có giá trị từ 0 đến 80 µg/ml.
- Kết quả đo OD của các dòng phân lập được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ đó suy ra được nồng độ IAA đã được vi khuẩn tổng hợp.
- Các số liệu thu thập được được xử lý bằng Excel và phần mềm thống kê Statgraphics plus 4.0.