Sau khi kiểm tra khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn đã phân lập được, chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA cao nhất để thực hiện phản ứng PCR với mồi 16S - rRNA và so sánh với dữ liệu trên ngân hàng gene NCBI để định danh vi khuẩn.
Quy trình trích DNA nhanh theo phương pháp của (Barberio et al., 1998).
Cấy vi khuẩn từ ống trữ ròng lên đĩa Petri chứa môi trường PDA. Ủ 1 - 2 ngày trong tủ ủ ở 30o C. Khi khuẩn lạc vi khuẩn hình thành, dùng que cấy chọn 1 - 2 khuẩn lạc rời và đều nhau cho vào tuýp Eppendorf có chứa 20 μl nước cất hai lần.
Đun cách thủy các tuýp ở 95oC trong 10 phút. Sau đó làm lạnh các tuýp trong nước đá xay nhuyễn thời gian 10 phút để phá vỡ tế bào vi khuẩn.
Ly tâm nhẹ hai lần, thu được dịch trích DNA của vi khuẩn. Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm có ba bước:
Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94oC - 95oC trong 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation).
Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi (primers) bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn bắt cặp (annealing).
Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation).
Sau khi ly trích DNA từ các dòng VKNS trong cây cúc mui, phản ứng PCR gen 16S-rDNA (Lane, 1985) sử dụng đoạn mồi:
27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’
1492R 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’
Sau khi trích DNA các dòng vi khuẩn, sẽ tiến hành phản ứng PCR bằng máy PCR Bio-Rad DNA Engine.
Bảng 5. Thành phần các chất trong phản ứng PCR Thành phần Thể tích (μl) Nước cất hai lần 11,75 Buffer 10X 2,5 MgCl2 2,0 dNTP 4,0 DMSO 2,0 Primer F 0,25 Primer R 0,25 Taq 0,25 DNA vi khuẩn 2 Tổng thể tích 25
Bảng 6. Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen của vi khuẩn nội sinh Bước phản ứng Tên bước Số lượng chu kỳ Nhiệt độ ( o C) Thời gian 1 Biến tính 95 5 phút 2 Biến tính Gắn mồi Kéo dài 35 35 35 95 55 72 30 giây 30 giây 1 phút 3 Kéo dài 72 10 phút
Chuẩn bị gel agarose 1% với thể tích 40 ml. Cân 0,4 g agarose cho vào chai nắp xanh. Đong 40 ml dung dịch TE 1X cho vào chai và lắc nhẹ cho agarose tan đều. Đặt chai vào lò vi sóng, đun khoảng 5 phút để cho agarose tan hoàn toàn và tạo thành dung dịch trong suốt. Lấy chai ra để nguội khoảng 55o - 60oC rồi bổ sung 0,8 μl Ethium bromide, lắc nhẹ đều. Rót dung dịch vào góc dưới của khuôn gel đã được chuẩn bị, tránh tạo bọt khí. Để khoảng 45 phút cho gel nguội và đặc lại rồi lấy lược ra khỏi khuôn.
Hình 9: Gel trước khi chụp hình DNA
Đặt khuôn gel vào bể điện di dung dịch TE buffer 1X cho ngập gel. Load các mẫu sản phẩm PCR vào mỗi giếng với thể tích 10 μl bao gồm 8 μl mẫu trộn với 2 μl loading buffer. Sau cùng, load 4 μl DNA thang chuẩn 100 bp vào giếng. Mở nguồn điện, cài đặt cho thiết bị ở 95 Vol trong 80 - 90 phút. Quan sát thấy chất chỉ thị màu xanh di chuyển gần cuối gel, tắt nguồn điện, lấy khuôn gel ra để chụp hình. Chụp hình gel đã điện di sản phẩm PCR.
Sau khi điện di, chụp hình DNA bằng hệ thống máy Bio-Rad Universal Hood II (Mỹ). Nếu các dòng vi khuẩn có band ở vị trí trùng với kích thước và vị trí của đối chứng dương thì đó là dòng vi khuẩn cùng loài với đối chứng dương. Chọn 3 dòng triển vọng nhất để giải trình tự và định danh tại Công ty Macrogen, Korea.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN