nghiên cứu thành phần hóa học của lá cóc kèn (derris trifoliata lour.)

Từ lá của cây cóc kèn trồng tại huyện Đầm Dơi, tỉnh Cà Mau, đã phân lập được chất β-Sitosterol C29H50O và lupeol C30H50O từ dịch chiết cao petroleum ether bằng phương pháp sắc ký cột Cấu

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA HỌC

- -

TRẦN NHƯ THÙY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA LÁ CÓC KÈN (Derris trifoliata Lour.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: HÓA DƯỢC

Cần Thơ – 2013

BỘ MÔN HÓA HỌC

- -

TRẦN NHƯ THÙY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA LÁ CÓC KÈN (Derris trifoliata Lour.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: HÓA DƯỢC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS LÊ THANH PHƯỚC

Cần Thơ – 2013

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Độc lập  Tự do  Hạnh phúc

BỘ MÔN HÓA HỌC - -

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: TS Lê Thanh Phước

2 Đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cóc kèn (Derris trifoliata

Lour.)

3 Sinh viên thực hiện: Trần Như Thùy

MSSV: 2102484 Lớp: Hóa Dược  Khóa 36

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

b Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:

c Nhận xét đối với sinh viện thực hiện đề tài:

d Kết luận, đề nghị, điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 Cán bộ hướng dẫn

TS Lê Thanh Phước

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Độc lập  Tự do  Hạnh phúc

2 Sinh viên thực hiện: Trần Như Thùy

MSSV: 2102484 Lớp: Hóa Dược  Khóa 36

4 Nội dung nhận xét:

e Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

f Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:

g Nhận xét đối với sinh viện thực hiện đề tài:

h Kết luận, đề nghị, điểm:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 Cán bộ phản biện

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trưởng Chuyên ngành Cán bộ hướng dẫn

TS Lê Thanh Phước

LỜI CẢM ƠN



Để hoàn thành luận văn này em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Toàn thể quý thầy cô Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ

đã dạy dỗ, truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian em học tập ở trường

Thầy Lê Thanh Phước đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho em những lời khuyên bổ ích trong quá trình làm luận văn

Quý thầy cô trong Bộ môn Hóa, Khoa Khoa học Tự Nhiên, trường Đại học Cần Thơ đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em về trang thiết bị, dụng cụ để thực hiện luận văn

Thầy Lê Hoàng Ngoan đã quan tâm và cho em những lời khuyên bổ ích để hoàn thành luận văn

Các bạn lớp Hóa Dược K36 và các anh chị đã sát cánh bên tôi, quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng, gia đình luôn là chỗ dựa vững chắc cho con để vượt qua mọi khó khăn, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cha mẹ đã luôn ủng hộ, động viên và chăm lo cho con về vật chất lẫn tinh thần

Chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, tháng 11 năm 2013

Trần Như Thùy

TÓM TẮT LUẬN VĂN



Luận văn này được tiến hành với mục tiêu tìm hiểu về thành phần hóa học của cây Cóc kèn Điều chế cao ethanol bằng phương pháp ngâm dầm Tiến hành định tính sơ bộ thành phần hóa học của cao ethanol Điều chế cao petroleum ether và cao ethyl acetate bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng

Từ lá của cây cóc kèn trồng tại huyện Đầm Dơi, tỉnh Cà Mau, đã phân lập được chất β-Sitosterol (C29H50O) và lupeol (C30H50O) từ dịch chiết cao petroleum ether bằng phương pháp sắc ký cột

Cấu trúc hóa học của hai hợp chất này được xác định bằng phổ NMR và

so sánh với các tài liệu đã được công bố

ABSTRACT



This thesis was carried out to learn about the chemical compositions of

the Derris trifoliata Lour Prepared ethanol extract by maceration method

Ethanol extract was carried out qualitative analysis Using liquid-liquid exraction method to prepared petroleum extract and ethyl acetate extract

Isolation of the chemical components from leaves of Derris trifoliata

Lour plant in Dam Doi district, Ca Mau province found β-Sitosterol (C29H50O) and lupeol (C30H50O) from petroleum ether extract by column chromatography method

Structures of these compounds have been elucidated by NMR spectroscopic and comparedwith published data

MỤC LỤC



Tóm tắt ii

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vii

Danh mục các phụ lục viii

Danh mục những từ viết tắt ix

Chương 1: Giới thiệu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 1

Chương 2: Tổng quan 2

2.1 Khái quát về chi Derris 2

2.2 Tổng quan về cây Cóc kèn Derris trifoliata Lour 2

2.2.1 Danh pháp và phân loại 2

2.2.2 Đặc điểm hình thái 2

2.2.3 Phân bố sinh thái 3

2.2.4 Thành phần hóa học 3

2.2.5 Tác dụng dược lý 3

2.3 Tổng quan về một số nhóm chức 4

2.3.1 Alkaloid 4

2.3.2 Flavonoid 5

2.3.3 Terpenoid 6

2.3.4 Steroid 7

2.3.5 Glycoside 7

2.3.6 Tanin 8

2.4 Phương pháp tách chiết hợp chất tự nhiên 8

2.4.1 Dung môi để chiết tách 8

2.4.2 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất ra khỏi nguyên liệu 11

2.5 Một số kỹ thuật sắc ký 14

2.5.1 Sắc ký cột (Column Chromatography) 14

2.5.2 Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC) 17

2.5.3 Một số kỹ thuật khác 20

Chương 3: Phương pháp và phương tiện nghiên cứu 22

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

3.2 Phương tiện nghiên cứu 22

3.2.1 Dụng cụ, thiết bị 22

3.2.2 Hóa chất 22

3.3 Phương pháp nghiên cứu 23

3.3.1 Điều chế cao 23

3.3.2 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của cao ethanol 24

3.3.3 Phương pháp phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc 24

Chương 4: Kết quả thực nghiệm và thảo luận 25

4.1 Điều chế các loại cao 25

4.1.1 Xử lý nguyên liệu 25

4.1.2 Điều chế cao tổng 25

4.1.3 Điều chế các cao có độ phân cực khác nhau từ cao alcol tổng 26

4.2 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học cao ethanol 27

4.2.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid 27

4.2.2 Khảo sát sự hiện diện của flavonoid 28

4.2.3 Khảo sát sự hiện diện của steroid-triterpenoid 30

4.2.4 Khảo sát sự hiện diện của tanin 31

4.2.5 Khảo sát sự hiện diện của saponin 32

4.2.6 Khảo sát sự hiện diện của glycoside 33

4.2.7 Khảo sát sự hiện diện của iridoid 33

4.3 Khảo sát cao petroleum ether 34

4.3.1 Sắc ký cột thường cao PE 34

4.3.2 Khảo sát phân đoạn PE VI 37

4.3.3 Khảo sát phân đoạn PE V 38

4.3.4 Biện luận phổ của hợp chất T1 40

4.3.5 Biện luận phổ của hợp chất T3 41

Chương 5: Kết luận và kiến nghị 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Kiến nghị 44

Tài liệu tham khảo 45

Phụ lục 46

DANH MỤC CÁC BẢNG



Bảng 1 Kết quả định tính một số nhóm hợp chất có trong

lá cóc kèn 34

Bảng 2 Kết quả sắc ký cột thường cao PE 35

Bảng 3 Kết quả sắc ký cột thường phân đoạn PE VI 37

Bảng 4 Kết quả sắc ký cột thường phân đoạn PE V 39

Bảng 5 Số liệu so sánh kết quả phổ 1H-NMR của hợp chất T1 và β-sitosterol đã được công bố 41

Bảng 6 Số liệu so sánh kết quả phổ 1H-NMR của hợp chất T3 và lupeol đã được công bố 42

DANH MỤC CÁC HÌNH



Hình 1 Cây và quả cóc kèn 3

Hình 2 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng 12

Hình 3 Giải ly bản mỏng 18

Hình 4 Cách tính giá trị Rf 19

Hình 5 Chiết ngâm dầm mẫu lá cóc kèn 24

Hình 6 Các loại cao chiết 26

Hình 7 Sơ đồ điều chế các loại cao 27

Hình 8 Định tính alkaloid bằng thuốc thử Mayer 28

Hình 9 Định tính alkaloid bằng thuốc thử Dragendorff 28

Hình 10 Định tính flavonoid bằng dung dịch FeCl3 29

Hình 11 Định tính flavonoid bằng H2SO4 đậm đặc 29

Hình 12 Định tính flavonoid bằng thuốc thử 1% NaOH/ethanol 30

Hình 13 Định tính steroid-triterpenoid bằng thuốc thử Liebermann-Burchard 30

Hình 14 Định tính steroid-triterpenoid bằng thuốc thử Salkowski 31

Hình 15 Định tính tanin bằng thuốc thử Stiasny 31

Hình 16 Định tính tanin bằng Pb(CH3COO)2 bão hòa 32

Hình 17 Định tính saponin dựa vào tính chất tạo bọt 32

Hình 18 Định tính saponin bằng Pb(CH3COO)2 bão hòa 33

Hình 19 Định tính glycoside bằng thuốc thử Fehling 33

Hình 20 Định tính iridoid bằng thuốc thử Trim-Hill 34

Hình 21 Sắc ký cột thường cao PE 36

Hình 22 Tinh thể chất T1 36

Hình 23 Kết quả TLC chất T1 trong 3 hệ dung môi khác nhau 36

Hình 24 Chất sạch T2 38

Hình 25 Kết quả TLC chất T2 trong 3 hệ dung môi khác nhau 38

Hình 26 Sắc ký cột thường phân đoạn PE V 39

Hình 27 Tinh thể hợp chất T3 40

Hình 28 Kết quả TLC chất T3 trong 3 hệ dung môi khác nhau 40

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC



Phụ lục 1 Phổ 1H-NMR của T1 trong CDCl3 46

Phụ lục 2 Phổ 1H-NMR (exl) của T1 trong CDCl3 47

Phụ lục 3 Phổ 1H-NMR (exl) của T1 trong CDCl3 48

Phụ lục 4 Phổ 1H-NMR của T3 trong CDCl3 49

Phụ lục 5 Phổ 1H-NMR (exl) của T3 trong CDCl3 50

Phụ lục 6 Phổ 1H-NMR (exl) của T3 trong CDCl3 51

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT



NMR Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

Chương 1: GIỚI THIỆU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cóc kèn (hay còn gọi là Cóc kèn nước) tên khoa học Derris trifoliata

Lour.là loài có thân dây leo mọc cao, sống phổ biến ở những vùng ngập mặn, sông lớn hay ven biển Theo y học dân gian cóc kèn được dùng chữa sốt rét kinh niên, huyết ứ, trị ho, sát trùng vết thương,… Ngoài ra trong một số bài thuốc dân gian về chữa bệnh gan và ung thư được lưu truyền cũng có thành phần lá cóc kèn Tuy nhiên, việc sử dụng loài cây này trong các bài thuốc nam như trên dựa vào kinh nghiệm dân gian chứ không có cơ sở khoa học Do đó

đề tài “NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ CÓC KÈN

(Derris trifoliata Lour.)” được thực hiện với mong muốn tìm hiểu về thành

phần hóa học của lá cóc kèn để tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng chúng trong y học dân tộc

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục đích nghiên cứu chính của đề tàilà góp phần nghiên cứu thành phần hóa học của lá cóc kèn để giải thích cho những công dụng của chúng trong y học dân gian

1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung chính của đề tài là ly trích và phân lập một số hợp chất có trong

Cô lập và tinh chế các chất từ một cao phân đoạn bằng sắc ký cột

Gửi mẫu chất phân lập được đi đo phổ (phổ NMR) để xác định cấu trúc hóa học

Chương 2: TỔNG QUAN

2.1 KHÁI QUÁT VỀ CHI DERRIS

Chi Derris còn gọi là chi thuốc cá, gồm các loài dây leo thuộc họ Đậu (Fabaceae) sinh sống chủ yếu trong khu vực Đông Nam Á và các đảo Tây Nam Thái Bình Dương Rễ của chúng chứa rotenone, một chất gây độc tính đối với các sinh vật thủy sinh nhưng không gây độc đối với người và động vật

có vú Đặc điểm chung của các cây thuộc chi Derris là có lá kép, mọc so le, hoa nhỏ, đài hoa màu hồng, cánh hoa màu trắng hay hồng Quả dạng quả đậu dài 3-10 cm, rộng 1-4 cm với các cánh hẹp ở đường nối hai mảnh vỏ.Hiện chưa có tài liệu nào chính thức đưa ra số lượng cụ thể cho chi này

2.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY CÓC KÈN DERRIS TRIFOLIATA LOUR

[1-3]

2.2.1 Danh pháp và phân loại

Tên khoa học: Derris trifoliata Lour

Tên thường gọi: cóc kèn hay cóc kèn nước

Hình 1 Cây và quả cóc kèn

2.2.3 Phân bố sinh thái

Derris trifoliata phân bố rộng rãi trong vùng nhiệt đới từ Đông Phi đến Châu Úc, Polynesia và vùng cận nhiệt đới Châu Á Ở Việt Nam, cóc kèn mọc

tự nhiên ở ven sông, rạch các vùng nước mặn và nước lợ

2.2.4 Thành phần hóa học

Rễ cây chứa chủ yếu là rotenone

Vỏ cây chứa tanin, alkaloid, chất đường glucose, một glucoside liên kết với chất saponin, nguyên tố khoáng,…

Thân cóc kèn chứa chất đường sucrose, một lượng nhỏ muối vô cơ, acid béo, steroid, alkaloid, triterpenoid, hợp chất phenol, chất mucilage,…

Lá cóc kèn chứa chất béo lipides, sterol, triterpene Trong đó phần của sterol gồm: cholesterol, campesterol, stigmasterol, sitosterol và stigmast-7-en-3-ol Phần của triterpene gồm: β-amyrine, α-amyrine và lupeol

2.2.5 Tác dụng dược lý

Cây có vị mặn chát, có tác dụng tiêu đờm trừ thũng, kháng sinh sát trùng;

lá có tác dụng cầm máu, lợi tiểu; rễ có độc, dùng giảm đau, sát trùng Theo y học dân gian cóc kèn được dùng chữa sốt rét kinh niên, huyết ứ, trị ho, sát trùng vết thương,…

Do tính chất chát, lá cóc kèn tươi giã nát đắp hoặc nấu thành nước sắc để trị vết thương lở loét Nước sắc đặc lá cóc kèn còn có tác dụng chữa tiêu chảy, kiết lỵ Viện y dược học dân tộc Thành phố Hồ Chí Minh đã bào chế lá cóc kèn thành dạng cao lỏng 3/1, thuốc viên 0,25 g và bột băng vết thương, ngoài

ra còn bào chế thành thuốc cầm máu

Theo kinh nghiệm dân gian thuốc dán từ nguyên liệu bột của cây cóc kèn, được hâm nóng với alcol dùng để đắp vào vùng bị sưng và bong gân

Ở Ấn Độ, nước ép của lá được sử dụng 2 hoặc 3 lần/ngày để chữa trị bệnh kiết lỵ mãn tính Ngoài ra, cây cóc kèn còn được dùng như chất kích thích, chống co thắt, chống kích ứng và chống bệnh phong thấp,…

Y học truyền thống Thái Lansử dụng rễ hoặc thân như thuốc nhuận trường, thuốc chữa trị và chống viêm khớp

ở một số bộ phận nhất định Ví dụ: alkaloid tập trung ở hạt như mã tiền, cà phê,…; ở quả như ớt, hồ tiêu, thuốc phiện,…; ở lá như coca, thuốc lá, chè,…;

ở hoa như cà độc dược; ở củ như ô dầu, bình vôi, bách bộ,…

Đa số alkaloid không màu, ở dạng kết tinh rắn với điểm nóng chảy xác định hoặc có khoảng nhiệt độ phân hủy.Một vài alkaloid ở dạng nhựa vô định hình, một vài alkaloid ở dạng lỏng (nicotin, coniin) và một vài alkaloid có màu (berberin màu vàng, betanidin màu đỏ)

Alkaloid là những hợp chất có tính base yếu (do sự có mặt của nguyên tử nitơ) Tính base của các alkaloid cũng khác nhau tùy theo sự hiện diện của các nhóm thế R gắn trên nguyên tử nitơ Các alkaloid ở dạng base tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường tan tốt trong dung môi hữu cơ như chloroform, diethyl ether, alcol bậc thấp Các muối của alkaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như chloroform, diethyl ether, benzen Phần lớn alkaloid có vị đắng, đặc biệt với một lượng nhỏ alkaloid cũng có thể cho phản ứng trầm hiện với thuốc thử đặc trưng của

nó

Alkaloid là hợp chất tương đối bền, tuy nhiên, một số hợp chất thuộc loại dẫn xuất của indol dễ bị phân hủy hoặc biến chất khi gặp ánh sáng hoặc các tác nhân oxide hóa

2.3.2 Flavonoid

Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phân bố rộng nhất trong thiên nhiên, hơn một nửa rau quả thường dùng có chứa flavonoid.Cho đến nay

có khoảng 4000 flavonoid đã biết rõ cấu trúc

Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa,… Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen A và B nối nhau qua một dây có 3 carbon nên thường được gọi là C6-C3-C6 Cách đánh số tùy theo dây C3 đóng hay hở Nếu dây C3đóng, thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1 rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng B đánh số phụ Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A

có màu vàng; flavon có màu vàng nhạt hoặc màu cam, flavonol có màu vàng đến vàng nhạt; chalcon có màu vàng đến cam đỏ.Các isoflavon, flavanon, flavanonol, leucoantocyanidin, catechin kết tinh không màu Anthocyanidin thường hiện diện ở dạng glycoside ví dụ như: pelargonidin, cyanidin, delphinidin,… tạo màu xanh dương, đỏ, tím cho những cánh hoa và trái Các flavonoid có độ hòa tan khác nhau tùy theo số nhóm hydroxy (−OH) và các nhóm thế khác có trong cấu trúc hóa học Ví dụ: flavonoid mang nhiều nhóm –OCH3 và ít nhóm –OH, có tính phân cực yếu nên tan tốt trong dung môi ít phân cực như benzen, chloroform, ethyl acetate Flavonoid mang nhiều nhóm –OH, có tính phân cực mạnh sẽ hòa tan trong các dung môi phân cực như acetone, ethanol, methanol, butanol, nước,…Để phân lập từng chất flavonoid, người ta áp dụng phương pháp sắc ký cột, chất hấp phụ thông dụng là bột polyamid dùng để tách tất cả các loại flavonoid Có thể dùng các chất khác như silica gel, bột cellulose,…Trong đó, silica gel dùng để tách các flavanon, isoflavon, flavonol Muốn có đơn chất tinh khiết thì cần phải sắc ký cột lại vài lần hoặc sắc ký lớp mỏng điều chế

Dựa vào số đơn vị isoprene, người ta phân chia thành: monoterpene (C10H16), sesquiterpene (C15H24), diterpene (C20H32), sesterterpene (C25H40), triterpene (C30H48), tetraterpene (C40H64), polyterpene (C5H8)n

Monoterpene (C 10 H 16 ) là thành phần chính của tinh dầu, hiện diện trong

khoảng 60 họ thực vật, nhưng chủ yếu trong 10 họ Hàm lượng tinh dầu trong cây thường thấp, khoảng 1 %, ngoại trừ nụ hoa cây Đinh hương Syzygium aromaticum (L.) có hàm lượng tinh dầu chiếm 15-20 % Cấu trúc hóa học của các monoterpene cso thể là mạch hở 1, 2 hoặc 3 vòng với khoảng 10 khung sườn carbon cơ bản chính

Sesquiterpene (C 15 H 24 ): Tinh dầu cũng chứa những hợp chất loại

sesquiterpene, thường gặp các sesquiterpene lacton trong các cây họ Cúc Cấu trúc hóa học của các hợp chất tự nhiên sesquiterpene có thể là mạch hở, 1, 2, 3 hoặc 4 vòng với 80 khung sườn carbon cơ bản chính

Diterpene (C 20 H 32 ): Trong tự nhiên, diterpene không vòng là hợp chất

phytol, diterpene đơn vòng là vitamin A Diterpene bốn vòng có khung cơ bản

là gibberelan với ví dụ là gibberilin, chất tăng trưởng thực vật Cấu trúc hóa học của các hợp chất tự nhiên diterpene có thể là mạch hở, 1, 2, 3 hoặc 4 vòng với 70 khung sườn carbon cơ bản chính

Sesterterpene (C 25 H 40 ): Trong tự nhiên, các hợp chất loại sesterterpene

hiện diện với số lượng nhỏ Cấu trúc hóa học của các sesterterpene có thể là mạch hở, 1, 2, 3 hoặc 4 vòng với 6 khung sườn carbon cơ bản chính

Triterpene (C 30 H 48 ) được phân bố rộng rãi trong giới động vật và thực

vật, hiện diện ở dạng tự do hoặc glycoside Cấu trúc hóa học của các triterpene

có thể là mạch hở, 3, 4 hoặc 5 vòng với 33 khung sườn carbon cơ bản chính

Tetraterpene (C 40 H 64 ) còn được gọi là carotenoid.Các hợp chất này

thường có cấu trúc hóa học gồm hệ thống các nối đôi liên hợp, nên hợp chất

có màu từ vàng, cam đến đỏ tạo nên màu sắc cho hoa và trái cây.Cấu trúc hóa học của các tetraterpene có thể là mạch hở, 1 hoặc 2 vòng

Polyterpene (C 5 H 8 ) n: Các polyterpene luôn có cấu trúc mạch hở, thẳng Các polyterpene tự nhiên với độ polymer hóa cao (từ 500 đến 5000 đơn vị

isoprene) là những hợp chất nhựa cây hiện diện trong khoảng 300 loài thực vật

2.3.4 Steroid

Sterol thuộc nhóm steroid, là những alcol thể rắn có cấu trúc từ 27-29 nguyên tử C trong phân tử với cấu trúc khung cơ bản là cyclopentanoperhydrophenantren và một chuỗi ngang với các nhóm methyl (ergostan) hoặc ethyl (stigmastan) đặc biệt là ở C24

Khung cyclopentanoperhydrophenantren

Sterol phân bố rộng rãi, thường có mặt song song với các alkaloid hoặc saponinsteroid Chúng có nguồn gốc động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol, β-sitosterol, ergosterol, stigmasterol,…)

Sterol có mặt trong tất cả các bộ phận của cây nhưng có nhiều nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các ester Sterol là chất không phân cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu béo, caroten; tan nhiều trong các dung môi không phân cực như petroleum ether, benzen, chloroform, nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol Sản phẩm chiết được bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp các ester sterol kết hợp với lipid, caroten, lecitin Phải qua giai đoạn xà phòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ Tinh chế bằng kết tinh phân đoạn

2.3.5 Glycoside

Các glycoside hiện diện trong rất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ phận cây: lá, vỏ, hạt,…Các glycoside thường là chất kết tinh và có vị đắng Trong cây, chúng tồn tại dưới dạng glycoside hòa tan trong các dịch tế bào Glycoside là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm có hai phần: phần aglycon và phần đường

Phần đường của glycoside: Phần đường phổ biến là D-glucose,

D-galactose, L-arabinose, L-rhamnose, D-xylose, acid glucuronic, acid galacturonic và một số đường khác

Phần aglycon của glycoside: Phần aglycon rất đa dạng và gồm tất cả các hợp chất tự nhiên như: monoterpene, sesquiterpene, diterpene, triterpene, steroid, iridoid, alkaloid, quinonoid, polyphenol,…

Các glycoside có tính phân cực khá mạnh nên không tan trong petroleum ether, hexane, benzen nhưng tan được trong chloroform, diethyl ether (các monoglycoside), tan tốt trong alcol, nước

2.3.6 Tanin

Tanin là loại hợp chất polyphenol phân bố rộng rãi trong họ thực vật Tanin có trong lá trà, lá ổi, rượu vang đỏ, nhiều loại trái cây nhất là trong vỏ trái măng cụt,…Các tanin có trọng lượng phân tử khoảng 500-3000

Tanin được phân thành hai nhóm lớn tùy theo cấu trúc hóa học của nó Tùy theo việc tanin đó có hoặc không bị thủy giải bởi men hoặc môi trường acid hay base mà phân thành “tanin thủy giải được” hoặc “tanin hóa đặc”

Tanin thủy giải được là polyester khi bị thủy phân cho ra phần aglycol là

polyphenol gồm acid galic hoặc hexahydroxydiphenic

Tanin hóa đặc là sự polymer của một vài flavanol ví dụ như catechol

hoặc epicatechol.Loại này khác với tanin thủy giải được vì nó không bị thủy giải dưới tác dụng của acid vô cơ loãng

Các tanin do mang nhiều nhóm −OH nên ít nhiều hòa tan trong nước tạo nên dung dịch nhớt Khi nếm tanin có cảm giác chát, se lưỡi, do tanin làm kết tủa các enzym có trong nước bọt, làm cho nước bọt mất đi tính chất của nó, làm bề mặt trong của lưỡi trơn láng Tanin hiện diện với hàm lượng cao trong thực vật, muốn chiết lấy tanin có thể sử dụng dung môi là nước.Làm tủa tanin bằng gelatin mặn, bằng cách rót dung dịch gelatin mặn vào dịch chiết, khuấy nhẹ, đều rồi để yên ở nhiệt độ phòng, tanin sẽ tủa

2.4 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT TỰ NHIÊN [4]

2.4.1Dung môi để chiết tách

 Dung môi

Do cấu tạo của cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu đại phân

tử (polymer, ví dụ như cellulose có trong cây cỏ, nấm mốc, thành tế bào vi sinh vật) tương đối trơ, không hoà tan trong dung môi hữu cơ, vì thế việc khảo sát hợp chất thiên nhiên là chiết lấy và khảo sát các chất biến dưỡng thứ cấp có trọng lượng phân tử nhỏ

Thông thường người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái dầu có mức độ phân cực khác nhau, tuy nhiên, đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái nước Điều này được thực hiện bằng cách chiết những hợp chất có trong cây lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăng

dần hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất bằng cách sử dụng dung môi vạn năng methanol (có thể chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên)

Nguyên tắc tổng quát là lựa chọn dung môi và quy trình phù hợp để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tuỳ thuộc vào đặc tính của chất biến dưỡng thứ cấp có trong cây mà người khảo sát mong muốn tách cô lập Các hợp chất tự nhiên có cấu trúc hóa học đa dạng, với tính chất phân cực khác biệt nên không thể có một quy trình tổng quát nào có thể áp dụng chung cho tất cả các nhóm, mà mỗi loại nhóm phải có một số quy trình chiết tách đặc trưng, vì vậy, khi tiến hành thực nghiệm phải thu thập đầy đủ các tài liệu tham khảo có liên quan trực tiếp trên cây mới có thể chọn được quy trình phù hợp Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung môi phù hợp, sử dụng

kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm, bằng máy chiết Soxhlet, Sau khi chiết, phần bã cây hay sinh khối còn lại được loại bỏ, dung môi qua lọc được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ thấp khoảng 30-40°C vì thực hiện ở nhiệt độ cao có thể làm hư hại một vài hợp chất kém bền nhiệt

Lựa chọn dung môi để chiết tách

Chọn dung môi phải có tính trung tính, không độc, không quá dễ cháy, hoà tan được hợp chất cần khảo sát, sau khi chiết tách xong, dung môi đó có thể được loại bỏ dễ dàng Cần tránh các dung môi độc như benzen hoặc dễ cháy do có nhiệt độ sôi thấp như diethyl ether, carbon tetraclorua,…

Dung môi dùng để chiết cần thỏa một số điều kiện sau:

- Có nhiệt độ sôi thấp, tuy nhiên nếu thấp quá thì dung môi dễ hao hụt do bay hơi dẫn đến dễ cháy nổ

- Không tác dụng hóa học với các chất có trong nguyên liệu và không bị thay đổi tính chất khi sử dụng lại

- Nhiệt hóa hơi thấp để tránh tiêu hao nhiều nhiệt

- Có độ nhớt bé để không làm giảm tốc độ khuếch tán

- Có khả năng hòa tan lớn các hoạt chất nhưng rất bé đối với tạp chất

- Không tạo thành hỗn hợp nổ đối với không khí, không được có những tạp chất không bay hơi và khi bay hơi không được để lại các tạp chất có mùi

lạ

- Phải tinh khiết, không ăn mòn thiết bị Không gây mùi lạ đối với sản phẩm và không độc hại với người sử dụng

- Dễ tìm và rẻ tiền

 Một số điều cần thiết khi sử dụng dung môi để chiết tách hợp chất Các dung môi cần được chưng cất lại và tồn trữ trong các chai lọ thủy tinh do trong dung môi thường hay chứa một số tạp bẩn mà thường gặp nhất là chất dẻo hóa Các chất dẻo lẫn vào dung môi do dung môi thường được chứa trong các thùng làm bằng nhựa dẻo

Methanol và chloroform thường chứa tạp chất là di(2-etylhexyl) phthalat

và chất này thường bị nhiều tác giả nhầm lẫn rằng là hợp chất tự nhiên có chứa trong cây cỏ đang khảo sát

Chloroform, dichloromethane có thể tạo phản ứng với các loại alkaloid như brucin, strychnin, ephedrine,… để tạo thành các alkaloid dạng muối tứ cấp và một vài hợp chất giả tạo khác Tương tự, các vết HCl có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước, sự đồng phân hoá cho vài hợp chất hữu cơ

Diethyl ether ít được sử dụng để chiết vì có nhiệt độ sôi thấp, dễ cháy, độc, có thể gây mê cho người sử dụng và có khuynh hướng tạo thành peroxid

dễ gây nổ.Peroxid này rất hoạt động, có thể oxid hoá các hợp chất mang nhiều nối đôi liên hợp như carotenoid

Acetone có thể tạo ra dẫn xuất acetonid nếu hợp chất chiết có chứa nhóm cis-1,2-diol hiện diện trong môi trường acid

Chiết bằng môi trường acid hay kiềm có thể thuỷ giải các hợp chất glycosid (môi trường acid sẽ cắt đứt glycosid tại nối acetal làm mất đi phần đường) hoặc cắt đứt nối ester (môi trường kiềm) hoặc tạo ra sự chuyển vị Sau khi chiết, dung môi được thu hồi bằng máy cô chân không ở nhiệt độ 30−40°C, chưng cất ở nhiệt độ cao có thể làm hư một số hợp chất kém bền nhiệt

 Sự hòa tan các hợp chất trong dung môi

Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thể

dự đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn chiết

Trong cao petroleum ether hoặc cao hexane, cao diethyl ether: có thể có các hydrocacbon béo và thơm (như triglyceride, alkane mạch carbon dài, alcol béo, ester béo, acid béo,…), các thành phần của tinh dầu (monoterpen, sesquiterpen, một vài diterpen bay hơi được), các sterol thực vật (phytosterols), các chất màu thực vật như carotene,…

Trong cao chloroform hoặc cao ethyl acetate: có thể có các sesquiterpen, diterpen, coumarin, quinon, các aglycon do hợp chất glycosid bị thủy giải, các monoglycosid (chỉ mang một phân tử đường), một số alkaloid loại base yếu Trong cao methanol hoặc cao nước: có thể có các chất màu thực vật như chlorophyl, các glycosid (saponin), các alkaloid ở dạng muối tứ cấp, kết hợp với các acid hữu cơ, các muối amine, các tannin, các hydrate carbon có trọng lượng phân tử nhỏ như monosacarid, oligosacarid, các protein thực vật, các muối vô cơ, một số polysacarid như: pectin, chất nhầy, chất gôm,…

2.4.2 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất ra khỏi nguyên liệu

Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ.Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng-lỏng và chiết rắn-lỏng Trong thực nghiệm, việc chiết rắn-lỏng được áp dụng nhiều hơn gồm sự ngấm kiệt, sự ngâm dầm, sự trích với máy chiết Soxhlet,… Ngoài ra, còn có thể chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (lưu chất siêu tới hạn), chiết có sự hỗ trợ của vi sóng

2.4.2.1 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi Cao alcol thô ban đầu (thí dụ bột cây được tận trích với methanol 80%, đuổi dung môi thu được cao alcol thô ban đầu) hoặc dung dịch ban đầu (thí dụ dung dịch sinh học) đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất khó cô lập riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo Người ta dùng kỹ thuật chiết lỏng-lỏng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (thí dụ petroleum ether) sẽ hoà tan tốt các hợp chất không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo,…); dung môi phân cực trung bình (thí dụ diethyl ether, dichlorometan,…) hoà tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm chức ether, aldehyde, ketone, ester,…) và dung môi phân cực mạnh (thí dụ methanol, nước,…) sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức −OH, −COOH,…)

Việc chiết lỏng-lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thô được hoà tan vào pha nước Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hoà tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tuỳ độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực thí dụ như: petroleum ether hoặc hexane, chloroform, ethyl

acetate, n-butanol,… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện

nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4,… sau đó cô quay thu hồi dung môi ta thu được cao chiết tương ứng Để kiểm tra xem các hợp chất nào đã được chiết vào pha hữu cơ cũng như các hợp chất nào còn lại ở trong pha nước

và chiết bao nhiêu lần thì hoàn tất, có thể sử dụng sắc ký lớp mỏng, trên bản mỏng cần so sánh đồng thời vết của pha nước và của pha hữu cơ Sự chiết bởi một dung môi cụ thể nào đó được gọi là hoàn tất khi lần chiết thứ n, trên bản mỏng không còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nước cũng như trong pha hữu cơ Cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên trên một tấm kính sạch, sau khi bay hết dung môi, không còn để lại vết gì trên mặt kiếng Cần lưu ý rằng sự chiết lỏng-lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi

sẽ tăng lên và nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều thay đổi

Hình 2 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng

2.4.2.2 Kỹ thuật chiết rắn-lỏng

 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

Phương pháp này được sử dụng khá phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp

Dụng cụ: gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng để dung môi tinh khiết

Phương pháp thực hiện: bột cây được xây thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình Đậy bề mặt lớp bông bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt, có thể

sử dụng dung môi nóng hoặc nguội.Để yên sau một thời gian, thường là 12-24 giờ.Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình

Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ một giọt dung dịch chiết lên tấm kiếng sạch, để bốc hơi và xem có còn để lại vết gì trên mặt kiếng hay không, nếu không còn vết gì là đã chiết kiệt

Hiệu quả phương pháp: So sánh với phương pháp ngâm dầm, phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp hơn một chút nhưng hiệu quả lại cao hơn và

ít mất công hơn vì đây là quá trình chiết liên tục, dung môi trong bình ngấm kiệt đã bão hòa mẫu chất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi tinh khiết

 Kỹ thuật chiết ngâm dầm

Kỹ thuật chiết ngâm dầm cũng tương tự như kỹ thuật chiết ngấm kiệt nhưng không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây

Dụng cụ: bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ, hình trụ đứng, có nắp đậy

Phương pháp thực hiện: bột cây được đặt vào bình, rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc của tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, cô quay thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xóc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài) Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể thêm được nhiều hơn nên có ngâm lâu

Dung môi sau khi thu hồi được làm khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau

Trong thực nghiệm, việc chiết rắn-lỏng được áp dụng nhiều, gồm sự ngấm kiệt, sự ngâm dầm, sự trích với máy chiết Soxhlet,…Ngoài ra, còn có sự chiết với phương pháp lôi cuốn hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn

2.5 MỘT SỐ KỸ THUẬT SẮC KÝ [4]

2.5.1 Sắc ký cột (Column Chromatography)

Sắc ký cột là một trong những kỹ thuật rất quan trọng.Trong nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên, sắc ký cột thường được sử dụng để tách riêng các hợp chất từ một hỗn hợp

Trong sắc ký cột thông thường, chất hấp thu (pha tĩnh) được nạp vào một cột làm bằng thủy tinh (có thể nạp dưới dạng khô hay ướt), dung môi di chuyển qua lớp pha tĩnh theo chiều từ trên cao xuống thấp nhờ vào trọng lực Mẫu được nạp ở đầu trên của cột, do ái lực khác nhau của các hợp phần trong mẫu với pha tĩnh và pha động mà có sự tách riêng giữa các hợp phần này Các chất hấp thu thường dùng: nhôm oxit, silica gel, polyamide, CaCO3,… Chất hấp thuthường được sử dụng là silica gel, pha động là các dung môi hữu cơ với nhiều tỷ lệ khác nhau, tìm hệ dung môi dựa vào sắc ký lớp mỏng Thông thường người ta nạp silica gel vào cột dưới dạng sệt (nạp ướt) do silica gel có khả năng trương nở khi bị solvat hóa

Dung môi giải ly cột

Các hệ dung môi dùng cho sắc ký lớp mỏng đều có thể ứng dụng vào sắc

ký cột Tuy vậy, đối với các dung môi có độ sôi quá thấp hoặc có mùi khó chịu hoặc độc thì không nên dùng làm dung môi giải ly cột

Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng

để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp Sau khi đã chọn được thì có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc ký cột Cần phải chỉnh tỉ lệ dung môi sao cho

có tính kém phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn

Thông thường nên bắt đầu bằng một dung môi không phân cực để loại một cách tương đối các hợp chất không phân cực ra khỏi cột và kế đó dung môi giải ly sẽ được tăng dần độ phân cực để đuổi các hợp chất có tính phân cực hơn Muốn thay đổi một dung môi có tính phân cực hơn, thì phải thay đổi bằng cách cho thêm vào mỗi lần vài phần trăm một lượng dung môi có tính phân cực hơn vào dung môi đang giải ly Thí dụ đang giải ly với ete dầu hỏa,

sau đó muốn đổi sang ethyl acetate thì phải thêm từ từ theo tỷ lệ (99:1) (99 mL ete dầu hỏa và 1 mL ethyl acetate), (98:2); (95:5); (90:10); (70:30); (50:50); (10:90); (0:100) Nếu cho thêm vào đột ngột thì sẽ làm gãy cột do alumine hay silica gel được trộn với dung môi sẽ tạo ra nhiệt, nhiệt này làm cho dung môi bốc hơi một cách cục bộ, hơi sinh ra sẽ tạo bọt khí và làm nứt, gãy cột, cột gãy

sẽ làm khả năng tách của cột kém đi

Thông thường, hợp chất không phân cực di chuyển nhanh và được giải ly

ra khỏi cột trước còn các hợp chất phân cực sẽ di chuyển chậm hơn (khối lượng phân tử cũng liên quan đến thứ tự giải ly, một hợp chất không phân cực

và có khối lượng phân tử lớn sẽ di chuyển chậm hơn một hợp chất không phân cực và có khối lượng phân tử nhỏ hơn)

Kích thước cột và lượng chất hấp thu

Kích thước cột sắc ký và lượng chất hấp thu cần được lựa chọn thích đáng để có thể tách tốt các mẫu cần sắc ký Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì khối lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25-50 lần khối lượng mẫu chất cần sắc ký Tuy nhiên, với những hỗn hợp các hợp chất khó tách riêng thì cần số lượng chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100-200 lần), còn với các hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng lượng chất hấp thu ít hơn Ngoài ra, chiều cao của lượng chất hấp thu cần đạt tỉ lệ: chiều cao chất hấp thu: đường kính trong của cột vào khoảng 10:1

Nạp chất hấp thu vào cột

Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột

Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá.Nếu phần đầu ra của cột không có miếng thủy tinh xốp để chặn thì nhồi vào một lớp bông gòn để thay thế Chất hấp thuđược nạp vào cột ở dạng sệt được chuẩn bị như sau:

- Trong một becher đã chứa sẵn dung môi (loại bắt đầu cho quá trình giải

ly cột), cho chất hấp thu vào becher, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa rót vừa khuấy nhẹ đều Lượng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt khiến cho bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng

- Nhờ một phễu lọc có đuôi dài đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa mở nhẹ khóa ở bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher sạch ở bên dưới cột, dung môi này được rót trả lại lên đầu cột

- Tiếp tục rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng một thanh cao su khỏ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều

- Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài ba lần

để cột được nạp chặt hơn, cho đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất

Trong quá trình nạp cột, dung môi vẫn liên tục chảy nhẹ đều ra khỏi cột, luôn luôn phải có dung môi phủ trên phần đầu cột

Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thuở đầu cột phải nằm ngang Nếu mặt thoáng không nằm ngang phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ phần dung môi sát mặt thoáng làm xáo một phần chất hấp thu ở trên đầu cột, để yên, chất hấp thu lắng xuống từ từ tạo nên một mặt thoáng bằng phẳng

Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột

Cho dung môi loại kém phân cực nhất có thể vào khoảng hai phần ba chiều cao cột, sau đó cho từ từ bột hấp thu vào cột, dùng thanh cao su khỏ nhẹ vào bên ngoài thành cột theo chiều từ dưới lên để bột xuống được đều đặn Khi lớp chất hấp thu đạt chiều cao khoảng 2 cm thì mở nhẹ khóa cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để bên dưới cột, dung môi này được

sử dụng lại để rót trả lại trên đầu cột Tiếp tục cho bột hấp phụ vào đến khi cột đạt được chiều cao nhất định.Tiếp đến, rót dung môi vào cột và cho chảy liên tục một thời gian để ổn định cột Từ lúc này trở đi không được để khô dung môi ở đầu cột

Theo dõi quá trình giải ly cột

Với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu, quá trình giải ly cột có thể được theo dõi bằng mắt thường nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu sắc khác nhau đang tách ra xa nhau trong cột Theo dõi các lớp màu khác nhau đó và hứng chúng khi chúng được giải ly ra khỏi cột Tuy nhiên trong đa số trường hợp các chất hữu cơ thường không có màu, phải theo dõi bằng nhiều cách khác nhau

Phương pháp thông dụng nhất là theo dõi quá trình sắc ký cột bởi sắc ký lớp mỏng, áp dụng cho những phân đoạn dung dịch hứng được trong quá trình giải ly Dung dịch giải ly ra khỏi cột được hứng vào lọ thủy tinh được đánh số thứ tự và được cân bì sẵn, mỗi lọ thủy tinh sẽ hứng một thể tích bằng nhau của dung dịch giải ly Dung dịch của những lọ hứng sẽ được sắc ký lớp mỏng trên cùng một bản mỏng Những lọ nào có kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau sẽ được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn Sau đó làm bay hơi dung môi trong mỗi phân đoạn sẽ thu được cao của phân đoạn đó

2.5.2 Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC)

Sắc ký lớp mỏng (TLC) còn gọi là sắc ký bản mỏng hay sắc ký phẳng chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thu Trong đó, pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một lớp chất hấp thu trơ như: silica gel hoặc oxit nhôm, chất hấp phụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plastic Do chất hấp phụ được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng (TLC)

Bình sắc ký: một chậu, hũ, lọ,… bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy

Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu, thí

dụ như silica gel, alumin…được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic

Mẫu chất phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau, thông qua một ống vi quản, được đưa lên lớp pha tĩnh ở vị trí cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình sắc ký Trong quá trình sắc ký, pha động di chuyển theo chiều từ dưới lên nhờ lực mao quản, mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với một vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các tương tác với pha tĩnh và pha động của các thành phần trong mẫu chất Đối với pha tĩnh là silica gel các chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và các chất phân cực sẽ di chuyển chậm

Giải ly bản mỏng

Chuẩn bị bình giải ly bản mỏng

Chuẩn bị bình có kích thước lớn hơn một chút so với kích thước của bản mỏng Kích thước của bình và lượng thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá trị Rf của mẫu Cần sử dụng bình nhỏ nhất có thể vì như thế bầu khí quyển sẽ nhỏ nhất Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung môi vào bình Mực dung môi không được cao hơn vị trí chấm mẫu trên bản mỏng

Trước khi cho tấm bản mỏng vào bình, bình cần được bão hòa dung môi

để có một bầu khí quyển đồng nhất, để quá trình bão hòa dung môi được nhanh người ta phủ bề mặt trong của bình bằng một tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải ly để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc

Đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, cạnh đáy của bản ngập vào dung môi giải ly khoảng 0,5-1 cm Hệ dung ly phù hợp là sao khi giải ly, hệ sẽ cho các vết chính có Rf khoảng từ 0,3 đến 0,6.

Hình 3 Giải ly bản mỏng

Các kỹ thuật giải ly bản mỏng

Dung môi giải ly di chuyển xuống

Sau khi bình đã bão hòa dung môi, người ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, để cho các vết chấm mẫu ở phía trên cao, gần với nắp đậy bình Ở phía trên cao của bình triển khai, có một máng nhỏ chứa dung môi giải ly Người ta cho một tờ giấy lọc (có chiều ngang bằng chiều ngang của tấm bản mỏng) vắt ngang từ máng qua tấm lớp mỏng, để dung môi từ máng di chuyển đến cạnh đầu trên của tấm bản mỏng rồi đi xuống dưới thấp

Dung môi giải ly di chuyển lên

Sau khi bình đã bão hòa dung môi, người ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, để cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh phía dưới gần đáy bình Cạnh đáy của tấm bản mỏng ngập vào dung dịch giải ly khoảng 0,5-1 cm

Giải ly nhiều lần liên tiếp

Kỹ thuật được áp dụng để tách mẫu có chứa các hợp chất có Rfgần sát nhau, thực hiện bằng cách giải ly nhiều lần liên tiếp với cùng một loại dung môi đã chọn Mỗi lần giải ly xong, lấy bản ra, sấy khô và cho vào trở lại để giải ly lần nữa

Giải ly hai chiều

Trên tấm sắc ký bản mỏng hình vuông, thí dụ 20×20 cm, chấm dung dịch mẫu cần phân tích lên góc phải, cách hai bìa một khoảng 2-3 cm, giải ly với hệ

dung môi X Lấy bản ra, sấy khô và xoay bản 90°, đặt trở lại bình sắc ký để

được giải ly với hệ dung môi Y

Hiện hình các vết sau khi giải ly

Sau khi giải ly xong, các vết có màu sẽ được phát hiện bằng mắt thường,

nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy

các vết, cần sử dụng phương pháp hóa học hoặc vật lý

Phương pháp vật lý thông dụng nhất là sử dụng máy soi UV ở các bước

sóng 254 và 365 nm

Phương pháp hóa học là phát hiện các vết bằng thuốc thử, bằng cách hòa

thuốc thử vào một dung môi thích hợp rồi phun xịt thuốc thử này lên bản

mỏng hoặc nhúng bản mỏng vào một lọ có chứa dung dịch thuốc thử, sau đó

hơ nóng trên bếp điện đến khi các vết hiện rõ

Giá trị Rf

Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn, có giá trị Rf không đổi trong

một hệ dung môi xác định Cách tính giá trị Rf được thể hiện trong hình sau:

Hình 4 Cách tính giá trị Rf

Các công dụng của sắc ký lớp mỏng

Kỹ thuật TLC hiện nay vẫn là công cụ rất cần thiết trong ngành hóa hữu

cơ, đặc biệt là trong hóa học các hợp chất thiên nhiên:

- Để công bố đặc điểm của hợp chất vừa chiết tách, cô lập được

- Để kiểm tra xem hai hợp chất có giống nhau hay không

- Để tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất cần khảo sát

- Để chuẩn bị cho việc sắc ký cột

- Để theo dõi diễn tiến của một phản ứng tổng hợp hữu cơ

- Để kiểm tra biết một hợp chất có kém bền