g. Nhận xét đối với sinh viện thực hiện đề tài:
4.3Khảo sát cao petroleum ether
4.3.1 Sắc ký cột thường cao PE
Tiến hành sắc ký cột thường cao PE với các số liệu như sau:
Đường kính cột: 2 cm.
Khối lượng pha tĩnh (silica gel 60 F254): 35 g.
Khối lượng cao PE: 2 g.
Chiều cao cột silica gel: 25 cm.
Dung môi ổn định cột: petroleum ether 100%.
(2 ) (1
35
Phương pháp nhồi cột: nhồi cột ướt.
Dung môi triển khai cột ban đầu là PE, sau đó dùng hệ dung môi PE:EA (tăng dần tỷ lệ EA).
Dung dịch ra khỏi cột được hứng vào các lọ với thể tích như nhau. Sau đó chấm TLC các lọ theo thứ tự, các lọ có vết giống nhau được gom chung lại thành một phân đoạn. Các vết chấm được so sánh trong cùng một bản mỏng và cùng một hệ dung môi giải ly bản mỏng để việc so sánh giá trị Rf dễ dàng. Dung dịch hiện hình bản mỏng là H2SO4 20% trong MeOH.
Kết quả sắc ký cột thường cao PE được trình bày trong bảng sau: Bảng 2 Kết quả sắc ký cột thường cao PE
Phân đoạn Thứ tự lọ Dung môi triển khai cột Dung môi giải ly bản mỏng Kết quả TLC Ghi chú I 1-9 PE 100% PE:EA = 8:2 Không có vết II 10 PE:EA = 95:5 PE:EA = 8:2 1 vết màu đỏ, 1 vết
mờ ở dưới. Dung dịch màu đỏ, lượng rất ít. III 11-16 PE:EA = 95:5 PE:EA = 8:2 2 vết chính có Rf
gần nhau,1 vết màu cam, 1 vết màu tím. Dung dịch màu vàng, không có tinh thể. IV 17-25 PE:EA = 95:5 PE:EA = 8:2 1 vết màu xanh,
đậm. Dung dịch màu vàng, tinh thể màu trắng V 26-39 PE:EA = 90:10 PE:EA = 8:2 1 vết chính đậm, 1 vết mờ ở phía trên, kéo vệt. Khảo sát tiếp. VI 40-60 PE:EA = 90:10 PE:EA = 8:2 2 vết chính, 1 vết màu cam, 1 vết màu xanh. Khảo sát tiếp. VII 61-100 101- 120 PE:EA = 90:10 PE:EA = 80:20 PE:EA = 7:3 PE:EA = 6:4 1 vết chính màu xanh, kéo vệt. VIII 121- 139 PE:EA = 75:25 PE:EA = 5:5 1 vết chính, nhiều vết phụ. IX 140- 161 PE:EA = 75:25 EA:Me = 99:1 2 vết chính rất gần nhau, kéo vệt. X 160- 195 PE:EA = 75:25 EA:Me = 99:1 1 vết, vệt đuôi kéo dài. Xả cột Me
36
Hình 21 Sắc ký cột thường cao PE
Sau khi sắc ký cột cao PE, thu được một chất kết tinh màu trắng ở phân đoạn IV chỉ có 1 vết tròn, đậm. Dùng phương pháp kết tinh lại nhiều lần để tinh chế, thu được chất sạch thứ nhất gọi là T1. Khảo sát TLC của T1 trên 3 hệ dung môi giải ly có độ phân cực khác nhau chỉ cho một vết và chất T1 được gửi đi đo phổ để xác định cấu trúc hóa học.
Hình 22 Tinh thể chất T1
Kết quả TLC của chất T1 được trình bày trong hình 23.
Hình 23 Kết quả TLC chất T1 trong 3 hệ dung môi khác nhau
(1) Hệ giải ly PE:EA = 6:4 (Rf = 0,77) (2) Hệ giải ly PE:DC = 2:8 (Rf = 0,45) (3) Hệ giải ly He:DC = 7:3 (Rf = 0,09)
37
4.3.2 Khảo sát phân đoạn PE VI
Phân đoạn PE VI có 2 vết chính có Rf khá xa nhau và khối lượng khá nhiều nên được tiếp tục sắc ký cột thường để tách chất. Tiến hành sắc ký cột thường phân đoạn PE VI với các số liệu như sau:
Đường kính cột: 1 cm.
Khối lượng pha tĩnh (silica gel 60 F254): 5 g.
Khối lượng mẫu: 0,2 g.
Chiều cao cột silica gel: 12 cm.
Dung môi ổn định cột: petroleum ether 100%.
Phương pháp nhồi cột: nhồi cột ướt.
Dung môi triển khai cột ban đầu là PE, sau đó dùng hệ dung môi PE:EA (tăng dần tỷ lệ EA).
Dung dịch ra khỏi cột được hứng vào các lọ với thể tích như nhau. Sau đó chấm TLC các lọ theo thứ tự, các lọ có vết giống nhau được gom chung lại. Các vết chấm được so sánh trong cùng một bản mỏng và cùng một hệ dung môi giải ly bản mỏng để việc so sánh giá trị Rf dễ dàng. Dung dịch hiện hình bản mỏng là vanillin trong H2SO4.
Kết quả sắc ký phân đoạn PE VI được trình bày trong bảng sau: Bảng 3 Kết quả sắc ký cột thường phân đoạn PE VI
Phân đoạn
Thứ tự lọ
Dung môi triển khai cột
Dung môi giải ly bản mỏng
Kết quả TLC
VI-1 1-5 PE 100% PE:EA = 7:3 Không có vết VI-2 6-17 PE:EA = 99:1 PE:EA = 7:3 1 vết tạp
VI-3 18-30 PE:EA = 97:3 PE:EA = 7:3 1 vết màu xanh lá, có vết mờ ở dưới VI-4 31-45 PE:EA = 95:5 PE:EA = 7:3 1 vết màu xanh lá, 2
vết mờ ở dưới VI-5 46-52 PE:EA = 90:10 PE:EA = 7:3 1 vết màu xanh đậm VI-6 53-65 PE:EA = 90:10 PE:EA = 7:3 nhiều vết tạp
Xả cột Me
Sau khi tiến hành sắc ký cột, ở phân đoạn PE VI-5 thu được một chất có dạng bột màu cam, khảo sát TLC chất này với 3 hệ dung môi khác nhau chỉ cho 1 vết cho thấy đây là chất sạch, gọi là chất T2.
38
Hình 24 Chất sạch T2
Kết quả khảo sát TLC của chất T2 với 3 hệ giải ly khác nhau được trình bày trong hình 25.
Hình 25 Kết quả TLC chất T2 trong 3 hệ dung môi khác nhau
(1) Hệ giải ly EA:Me = 10:1 (Rf = 0,77) (2) Hệ giải ly PE:EA = 1:1 (Rf = 0,59) (3) Hệ giải ly He:EA = 7:3 (Rf = 0,21)
4.3.3 Khảo sát phân đoạn PE V
Phân đoạn PE V có 1 vết chính đậm và 1 vết phụ ở phía trên nên được tiếp tục sắc ký cột thường để tách chất. Tiến hành sắc ký cột thường phân đoạn PE V với các số liệu như sau:
Đường kính cột: 1 cm.
Khối lượng pha tĩnh (silica gel 60 F254): 6 g.
Khối lượng mẫu: 0,2 g.
Chiều cao cột silica gel: 15 cm.
Dung môi ổn định cột: petroleum ether 100%.
39
Hình 26 Sắc ký cột thường phân đoạn PE V
Dung môi triển khai cột ban đầu là PE, sau đó dùng hệ dung môi PE:EA (tăng dần tỷ lệ EA).
Dung dịch ra khỏi cột được hứng vào các lọ với thể tích như nhau. Sau đó chấm TLC các lọ theo thứ tự, các lọ có vết giống nhau được gom chung lại. Các vết chấm được so sánh trong cùng một bản mỏng và cùng một hệ dung môi giải ly bản mỏng để việc so sánh giá trị Rf dễ dàng. Dung dịch hiện hình bản mỏng là H2SO4 20% trong MeOH.
Kết quả sắc ký phân đoạn PE V được trình bày trong bảng sau: Bảng 4 Kết quả sắc ký cột thường phân đoạn PE V
Phân
đoạn Thứ tự lọ Dung môi triển khai cột
Dung môi giải ly bản mỏng Kết quả TLC Ghi chú V-1 1-5 PE 100% PE:EA = 7:3 Không có vết. V-2 6-20 PE:EA = 99:1 PE:EA = 7:3 1 vết tạp. V-3 21-30 PE:EA = 98:2 PE:EA = 7:3 1 vết mờ. V-4 31-45 PE:EA = 97:3 PE:EA = 7:3 1 vết màu tím,
1 vết mờ ở dưới.
V-5 46-57 PE:EA = 95:5 PE:EA = 7:3 1 vết màu cam chuyển sang màu tím. Dung dịch không màu, tinh thể màu trắng V-6 58-67 PE:EA = 90:10 PE:EA = 7:3 1 vết mờ, kéo
40
Xả cột Me
Sau khi tiến hành sắc ký cột, ở phân đoạn PE V-5 thu được một chất kết tinh màu trắng, khảo sát TLC chất này với 3 hệ dung môi khác nhau chỉ cho 1 vết cho thấy đây là chất sạch, gọi là chất T3. Chất này được gửi đo phổ để xác định cấu trúc hóa học.
Hình 27 Tinh thể hợp chất T3
Kết quả khảo sát TLC của chất T3 với 3 hệ giải ly khác nhau được trình bày trong hình 28.
Hình 28 Kết quả TLC chất T3 trong 3 hệ dung môi khác nhau
(1) Hệ giải ly He:EA = 1:1 (Rf = 0,82) (2) Hệ giải ly PE:EA = 85:15 (Rf = 0,41) (3) Hệ giải ly PE:DC = 1:1 (Rf = 0,23)
4.3.4 Biện luận phổ của hợp chất T1
Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3,δppm) cho các tín hiệu tại0,80 (3H,
s, CH3-27), 0,82 (3H, s, CH3-26), 0,90 (3H, s, CH3-29), 0,92 (3H, CH3-20), 1,01 (3H, s, CH3-19), 3,20 (1H, m, H-3), 5,53 (1H, dd, J = 5 Hz, H-6).
41
Bảng 5 Số liệu so sánh kết quả phổ 1H-NMR của hợp chất T1 và β-sitosterol đã được công bố [7] 1H-NMR (δ ppm) T1 1H-NMR (δ ppm) β-sitosterol 0.80 (3H, s) 0.79 (3H, s, CH3-27) 0.82 (3H, s) 0.83 (3H, s, CH3-26) 0.90 (3H, s) 0.87 (3H, s, CH3-29) 0.92 (3H) 0.91 (3H, d, J = 6.4 Hz, CH3-20) 1.01 (3H, s) 1.01 (3H, s, CH3-19) 3.20 (1H, m) 3.52 (1H, m, H-3) 5.53 (1H, dd, J = 5 Hz) 5.35 (1H, d, J = 5 Hz, H-6) Từ các dữ kiện đã nêu trên, so sánh với tài liệu tham khảo [7], [9], [10], [13] có thể nhận danh hợp chất T1 là β-sitosterol.
β-Sitosterol
β-Sitosterol là một chất thuộc nhóm steroid, có công thức phân tử C29H50O, khối lượng phân tử mol 414 g/mol. Theo nhiều nghiên cứu, β-Sitosterol là một loại sterol thực vật có khả năng cản trở quá trình hấp thu cholesterol, làm giảm tỉ lệ cholesterol trong máu, phòng tránh các nguy cơ tai biến mạch máu não hoặc các bệnh liên quan đến tim mạch, hỗ trợ điều trị bệnh ung thư tuyến tiền liệt.
4.3.5 Biện luận phổ của hợp chất T3
Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3, δ ppm) cho thấy trong phân tử T3 có 1 tín hiệu mũi đôi-đôi của 1 proton ở vùng từ trường cao 3,18 ppm là dấu hiệu đặc trưng cho proton gắn ở vị trí nguyên tử C số 3 của hợp chất pentacyclic triterpenoid. Tín hiệu phổ cho 2 mũi ở vị trí 4,68 và 4,56 chỉ định cho mỗi proton gắn ở vị trí nguyên tử C số 29. Tín hiệu phổ cho thấy có 7 mũi đơn ở các vị trí δ 0,76 (3H, CH3-28); 0,78 (3H, CH3-23); 0,83 (3H, CH3-24); 0,94 (3H, CH3-25); 0,96 (3H, CH3-26); 1,03 (3H, CH3-27) và 1,68 (3H, CH3-30). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 HO
42
Bảng 6 Số liệu so sánh kết quả phổ 1H-NMR của hợp chất T3 và lupeol đã được công bố [8] 1H-NMR (δ ppm) T3 1H-NMR (δ ppm) lupeol 1,66 (1H, s, H-1) 1,66 (1H, d, H-1) 1,63 (1H, d) và 1,61 (1H, m) 1,62 (1H, d, H-2) và 1,60 (1H, q, H- 2) 3,18 (1H, dd, J = 11; 4,5 Hz, H-3) 3,18 (1H, dd, J = 11; 4,5 Hz, H-3) 0,69 (1H, s) 0,69 (1H, d, H-5) 1,27 (1H, d) 1,28 (1H, d, H-9) 1,42 (1H, d) và 1,29 (1H, d) 1,42 (1H, d, H-11) và 1,29 (1H, q, H-11) 1,63 (1H, d, J=3,5 Hz) và 1,07 (1H, m) 1,66 (1H, d, J=3,5 Hz, H-12) và 1,07 (1H, q, H-12) 2,37 (1H, m, J = 5,5 Hz) 2,37 (1H, m,J = 5,5 Hz, H-19) 1,92 (1H, m) và 1,33 (1H, m) 1,92 (1H, m, H-21) và 1,33 (1H, m, H-21) 1,42 (1H, m) và 1,20 (1H, m) 1,42 (1H, m, H-22) và 1,20 (1H, m, H-22) 0,78; 3H 0,78; 3H 0,83; 3H 0,81; 3H 0,94; 3H 0,92; 3H 0,96; 3H 0,94; 3H 1,03; 3H 1,02; 3H 0,76; 3H 0,75; 3H 4,56 (1H, s, H-29) và 4,68 (1H, d, J = 2 Hz; H-29) 4,56 (1H, d, J = 2,25; 1,25 Hz, H- 29) và 4,68 (1H, dq, J = 2 Hz; H- 29) 1,68 (3H, s, CH3-30) 1,68 (3H, s, CH3-30)
Từ các dữ kiện đã nêu trên, so sánh với tài liệu [8], [12] có thể nhận danh hợp chất T3 là lupeol. HO CH2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
43
Lupeol
Lupeol có khả năng ngăn chặn sự di chuyển và sự phát triển của tế bào ung thưvùng đầu và cổ bao gồm vùng ung thư mũi, khoang miệng, họng, thanh quản, tuyếngiáp và tuyến nước bọt. Nghiên cứu in vitro và cận lâm sàng đối với động vật cho thấy lupeol có khả năngkháng viêm, kháng vi trùng, làm hạ cholesterol. Lupeol cũng được thử nghiệm trêncận lâm sàng như một phương thuốc điều trị các bệnh như: chữa lành vết thương, tiểuđường, tim mạch, thận, viêm khớp.[13]
44
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 KẾT LUẬN
Qua quá trình thực hiện đề tài NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ CÓC KÈN (Derris trifoliate Lour.) đã thu được một số kết quả như sau:
Xác định độ ẩm của mẫu nguyên liệu lá cóc kèn là 8,171%.
Định tính sự hiện diện của các hợp chất hữu cơ trong cao EtOH tổng và xác định được có sự hiện diện của 5 nhóm hợp chất: alkaloid, flavonoid, steroid-triterpenoid, glycoside, iridoid.
Điều chế các cao gồm: cao EtOH tổng, cao PE, cao EA. Xác định khối lượng các cao và tính hiệu suất thu cao.
Sắc ký cột thường cao PE thu được nhiều phân đoạn, tiến hành khảo sát phân đoạn PE V và PE VI, thu được 3 chất sạch đặt tên là T1, T2 và T3.
Khảo sát phổ NMR của hợp chất T1 và T3, đối chiếu tài liệu tham khảo, hợp chất T1được đề nghị là β-Sitosterol, hợp chất T3 đề nghị là lupeol.
5.2 KIẾN NGHỊ
Do hạn chế về thời gian nên tôi chỉ khảo sát một số phân đoạn trên cao PE. Tôi hy vọng đề tài sẽ tiếp tục được phát triển theo các hướng sau:
Xác định hoạt tính sinh học của chất cô lập được. Khảo sát các phân đoạn còn lại của cao PE.
Khảo sát thêm các cao phân cực hơn như: cao EA, điều chế và khảo sát cao n-butanol.
45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
(1)Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, quyển I, NXB Trẻ, trang 901.
(2) Đỗ Huy Bích (1995), Thuốc từ Cây cỏ và Động vật, NXB Y học.
(3)Nguyễn Thanh Vân, Vườn Dược Thảo,
http://duocthaothucdung.blogspot.com/2013/02/day-coc-ken-three- leaf-derris.html.
(4) Nguyễn Kim Phi Phụng (2007).Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh.
(5)Nguyễn Ngô Huyền Nhung (2011).Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học cao petroleum ether ly trích từ cây Chỉ thiên giả, Luận văn tốt nghiệp Đại học ngành Hóa học, Khoa KHTN, Đại học Cần Thơ. (6)Nguyễn Kim Phi Phụng (2005).Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ,
NXB Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh.
(7)Nguyễn ThịLan Anh (2012).Nghiên cứu thành phần hóa học trong cao Petroleum Ether từ thân cây Bần chua (Sonneratia caseolaris
(L.) Engl.),Luận văn tốt nghiệp Đại học ngành Hóa học, Khoa KHTN,
Đại học Cần Thơ.
(8)Phạm Thị Thùy Trang (2010).Khảo sát thành phần hóa học của rể mắm, Luận văn Thạc sĩ Hóa Hữu cơ, Đại học Cần Thơ.
(9)Md. Abdul Muhit, Syed Mohammed Tareq, Apurba Sarker Apu, Debasish Basak and Mohamad S. Islam (2010).Isolation and Identification of compounds from the leaf Extract of dillenia indicalinn. Bangladesh Pharmaceutical Journal, Vol. 13
(10) Mir Shumaia parvin, Md. Abdul kader, Md. Abdul Muhit, Md. Ashik Morsaddkik and Imam Ibne Wahed (2011). Triterpenoid and phytosteroids from sterm bark of createva nurvala buch ham. Journal of applied pharmaceutical Science, 01 (09), 47-50.
(11)Tôn Nữ Liên Hương (2011). Giáo trình nghiên cứu hợp chất thiên nhiên, Đại học Cần Thơ.
(12) Soumia Mouffok, Hamada Haba, Catherine Lavaud, Christophe Long, Mohammed Benkhaled (2012).Chemical constituents of Centaurea omphalotricha Coss. & Durieu ex Batt. & Trab,Rec. Nat. Prod. 6:3 (2012) 292-295.
(13) Eman M. Elgendy and Huda Al-Ghamdy (2007). Thermal and Photooxidation Reactions of the Steroids: β-Sitosterol, Stigmasterol
and Diosgenin, Taiwan Pharmaceutical Journal, 2007, 59, 113-132.
(14) Bành Nguyễn Anh Hào và Lê Thanh Phước (2011), Khảo sát thành phần hóa học của rễCau (Areca catechu L.), Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ, 19b, tr. 80-84.
46
PHỤ LỤC
47
48
49
50
51