g. Nhận xét đối với sinh viện thực hiện đề tài:
3.3Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Điều chế cao
Điều chế cao ethanol tổng bằng phương pháp ngâm dầm, mỗi lần ngâm 24h, dịch chiết từ các lần được gom lại, cô quay thu hồi dung môi.
Điều chế các cao thành phần: sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng. Cao ethanol được chiết lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần (petroleum ether, ethyl acetate, n-butanol,…). Sau đó cô quay thu hồi dung môi sẽ thu được các cao tương ứng.
Điều chế cao petroleum ether (cao PE)
Hòa tan cao ethanol vào một lượng tối thiểu methanol (Me), thêm vào một lượng rất ít nước cất, thu được dung dịch cái, dung dịch này được chiết lỏng-lỏng với PE. Cho 50 mL PE vào bình lóng 500 mL, sau đó cho vào một lượng cao ethanol khoảng 50 mL; tiếp tục cho thêm một lượng PE khoảng 100-200 mL, lắc mạnh nhiều lần. Sau khi lắc, để yên bình lóng trên giá đỡ từ 30 phút đến 1 giờ, cho đến khi hỗn hợp trong bình lóng phân thành 2 pha, pha hữu cơ có tỷ trọng thấp hơn chứa các chất tan trong PE nằm phía trên, phần nằm dưới là pha nước. Mở van bình lóng, hứng riêng pha hữu cơ và pha nước. Pha nước được chiết tiếp với dung môi cho đến khi chấm TLC trên pha hữu cơ không còn chất nữa thì dừng lại. Tiến hành chiết cho đến hết lượng cao ethanol ban đầu. Dịch chiết PE từ các lần chiết được gom lại, làm khan với Na2SO4, đuổi dung môi thu được cao PE.
Điều chế cao ethyl acetate (cao EA)
Pha nước thu được sau khi chiết với PE tiếp tục được chiết lỏng-lỏng với EA, quá trình chiết được thực hiện tương tự chiết với PE. Dịch chiết EA thu được đem cô quay loại dung môi thu được cao EA.
Xác định độ ẩm tương đối của mẫu nguyên liệu:
Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 chén sứ sạch, đánh dấu các chén sứ, cho vào tủ sấy ở nhiệt độ lớn hơn 100°C. Sau khi sấy, đặt chén sứ vào bình hút ẩm, để nguội ở nhiệt độ phòng rồi cân các chén sứ ta được khối lượng m1.
Cho vào mỗi chén sứ m gam mẫu, đem sấy ở nhiệt độ bằng 100°C. Sau 5 giờ thì lấy ra cân, cứ như vậy cho đến khi khối lượng chén sứ có chứa mẫu không thay đổi. Đặt chén sứ có chứa mẫu vào bình hút ẩm, để nguội ở nhiệt độ phòng rồi đem cân ta được khối lượng m2.
24 Độ ẩm trung bình của mẫu:
3.3.2 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của cao ethanol
Sử dụng một số thuốc thử đặc trưng để định tính các nhóm hợp chất có trong cao ethanol.
3.3.3 Phương pháp phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc
Sử dụng phương pháp sắc ký cột pha thường để tách các chất, dùng sắc ký lớp mỏng để dò tìm hệ dung môi giải ly cho sắc ký cột.
Dùng sắc ký bản mỏng để theo dõi quá trình sắc ký cột và kiểm tra mức độ tinh sạch của hợp chất.
Dùng phương pháp kết tinh lại để tinh chế hợp chất.
Mẫu chất sau khi phân lập được gửi đo phổ tại Viện Hóa Học Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt – Quận Cầu Giấy – Hà Nội.
25
Chương 4:
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN
4.1 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 4.1.1 Xử lý nguyên liệu 4.1.1 Xử lý nguyên liệu
Lá cây cóc kèn được thu hái tại huyện Đầm Dơi, tỉnh Cà Mau. Sau khi thu hái, lá cây được rửa sạch, loại bỏ phế phẩm, để ráo rồi cắt nhỏ, sau đó phơi gió khoảng 6 ngày cho đến khi khối lượng không đổi. Đem nghiền thành bột, cho vào các túi vải và tiến hành chiết ngâm dầm với ethanol 96° trong bình thủy tinh có thể tích 10 lít.
Hình 5 Chiết ngâm dầm mẫu lá cóc kèn
Kết quả xác định độ ẩm của mẫu nguyên liệu
4.1.2 Điều chế cao tổng
Mẫu nguyên liệu ban đầu (5,5 kg lá tươi) sau khi phơi khô, nghiền thành bột (khối lượng 1,158 kg) được cho vào các túi vải nhỏ sau đó được ngâm với
26
lượng vừa đủ ethanol 96°. Sau thời gian khoảng 24 giờ/mỗi lần ngâm, dịch chiết được lọc qua giấy lọc rồi cô quay thu hồi dung môi. Dung môi thu hồi được trong quá trình cô quay sẽ được cho trở lại vào bình thủy tinh để tiếp tục chiết, tiếp tục thực hiện quá trình như thế vài lần cho đến khi chiết kiệt các chất từ mẫu bột nguyên liệu. Phần dịch chiết được cô quay đuổi dung môi, thu được cao alcol tổng có màu xanh đen (180,866 g).
Hiệu suất trích cao alcol tổng từ nguyên liệu ban đầu:
4.1.3 Điều chế các cao có độ phân cực khác nhau từ cao alcol tổng
Điều chế các cao phân đoạn bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng. Kết quả thu được 19,912 g cao PE có màu xanh đen và 9,83 g cao EA với hiệu suất trích cao là:
Hiệu suất trích cao PE từ cao alcol tổng:
Hiệu suất trích cao EA từ cao alcol tổng:
27
- Rửa sạch, phơi gió - Xay nhỏ
- Ngâm với ethanol 96° - Cô quay, thu hồi dung môi
- Chiết với PE
- Cô quay, thu hồi dung môi
- Chiết với EA
- Cô quay, thu hồi dung môi
Hình 7 Sơ đồ điều chế các loại cao
4.2 KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETHANOL 4.2.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid 4.2.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid
Thuốc thử Mayer Công thức:
Dung dịch A: 1,36 g HgCl2 + 60 mL nước cất. Dung dịch B: 5 g KI + 10 mL nước cất.
Hỗn hợp hai dung dịch A và B, thêm nước cất vừa đủ 100 mL ta được thuốc thử Mayer.
Hiện tượng: nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa trắng hoặc vàng nhạt. Lá cóc kèn tươi (5,5 kg)
Bột cây khô (1,158 kg)
Cao ethanol (180,866 g)
Cao PE (19,912 g) Phần còn lại
28
Thực nghiệm: lấy 1 mL dịch alcol cho vào ống nghiệm, sau đó cho từ từ thuốc thử Mayer vào.
Kết quả: dung dịch xuất hiện kết tủa vàng nhạt, phản ứng dương tính.
Hình 8 Định tính alkaloid bằng thuốc thử Mayer (1): dịch alcol
(2): dịch alcol có thuốc thử
Thuốc thử Dragendorff Công thức:
Dung dịch A: 8 g Bi(NO)3.H2O + 25 mL HNO3 30 % (d=1,18). Dung dịch B: 28 g KI + 1 mL HCl 6N + 5 mL nước cất.
Hỗn hợp hai dung dịch A và B, để yên trong tủ lạnh ở 5°C cho tủa màu nâu sậm và tan trở lại, lọc, thêm nước cất đủ 100 mL được thuốc thử Dragendorff.
Hiện tượng: nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu cam-nâu.
Thực nghiệm: lấy 1 mL dịch alcol cho vào ống nghiệm, sau đó cho từ từ thuốc thử Dragendorff vào.
Kết quả: xuất hiện kết tủa màu cam, phản ứng dương tính.
Hình 9 Định tính alkaloid bằng thuốc thử Dragendorff (1): dịch alcol
(2): dịch alcol có thuốc thử Kết luận: trong cao tổng có chứa alkaloid.
(2 ) (2 ) (1 ) (1 )
29
4.2.2 Khảo sát sự hiện diện của flavonoid
Thuốc thử FeCl3 5%
Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%.
Kết quả: xuất hiện kết tủa xanh đen, phản ứng dương tính.
Hình 10 Định tính flavonoid bằng dung dịch FeCl3 (1): dịch alcol
(2): dịch alcol có thuốc thử
Tác dụng với H2SO4 đậm đặc
Hòa tan hợp chất flavonoid vào H2SO4 đậm đặc: flavon và flavonol cho màu vàng đậm đến màu cam và có phát huỳnh quang đặc biệt. Chalcon, auron cho màu đỏ hoặc xanh dương-đỏ.Flavanon cho màu từ cam đến đỏ.
Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch H2SO4 đậm đặc.
Kết quả: dung dịch chuyển sang màu vàng nâu, phản ứng dương tính.
Hình 11 Định tính flavonoid bằng H2SO4 đậm đặc
(1): dịch alcol
(2): dịch alcol có thuốc thử
Thuốc thử 1% NaOH/ethanol
Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch flavonoid/hòa tan trong ethanol, sẽ có màu từ vàng đến cam-đỏ.
Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử 1% NaOH/ethanol. (2 ) (2 ) (1 ) (1 )
30
Kết quả: dung dịch sau khi thêm thuốc thử có màu vàng, phản ứng dương tính.
Hình 12Định tính flavonoid bằng thuốc thử 1% NaOH/ethanol
(1): dịch alcol
(2): dịch alcol có thuốc thử Kết luận: trong cao tổng có chứa flavonoid.
4.2.3 Khảo sát sự hiện diện của steroid-triterpenoid
Thuốc thử Liebermann-Burchard
Công thức: 1 mL anhydrid acetic + 1 mL chloroform, làm lạnh, thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc.
Cho mẫu vào ở thể rắn hoặc pha trong chloroform. Nếu có steroid thì dung dịch đổi màu thành xanh dương, lục, cam hoặc đỏ, màu này bền không đổi
Thực nghiệm: hòa tan cao tổng trong chloroform, cho 1 mL dung dịch này vào ống nghiệm, thêm từ từ vài giọt thuốc thử Liebermann-Burchard vào.
Kết quả: xuất hiện kết tủa màu đỏ, phản ứng dương tính.
Hình 13Định tính steroid-triterpenoid bằng thuốc thử Liebermann-Burchard
(1): mẫu thử
(2): mẫu thử có thuốc thử
Thuốc thử Salkowski
Hòa tan 1-2 mg mẫu thử trong 1 mL chloroform và nhỏ thêm 1 mL H2SO4 đậm đặc. Phản ứng dương tính khi dung dịch đổi màu thành đỏ đậm, xanh, xanh-tím. (2 ) (2 ) (1 ) (1 )
31
Kết quả: dung dịch đổi thành màu đỏ đậm, phản ứng dương tính.
Hình 14Định tính steroid-triterpenoid bằng thuốc thử Salkowski
(1): mẫu thử
(2): mẫu thử có thuốc thử Kết luận: trong cao tổng có chứa steroid-triterpenoid.
4.2.4 Khảo sát sự hiện diện của tanin
Thuốc thử Stiasny
Công thức: 20 mL formol 36% + 10 ml HCl đậm đặc.
Phản ứng dương tính có tanin khi xuất hiện trầm hiện màu đỏ.
Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 mL mẫu thử, thêm từ từ thuốc thử Stiasny vào.
Kết quả: không xuất hiện trầm hiện màu đỏ, phản ứng âm tính.
Hình 15Định tính tanin bằng thuốc thử Stiasny
(1): mẫu thử
(2): mẫu thử có thuốc thử
Thuốc thử Pb(CH3COO)2 bão hòa
Phản ứng dương tính có tanin khi xuất hiện kết tủa.
Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 mL mẫu thử, thêm từ từ dung dịch Pb(CH3COO)2 bão hòa vào
Kết quả: không xuất hiện kết tủa, phản ứng âm tính.
(2 ) (2 ) (1 ) (1 )
32
Hình 16Định tính tanin bằng Pb(CH3COO)2 bão hòa
(1): mẫu thử
(2): mẫu thử có thuốc thử Kết luận: trong cao tổng không có chứa tanin.
4.2.5 Khảo sát sự hiện diện của saponin
Dựa vào tính chất tạo bọt của saponin
Ống nghiệm 1: 5 mL NaOH 0,1N (pH=13) + 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử.
Ống nghiệm 2: 5 mL HCl 0,1N (pH=1) + 3 giọt dung dịch alcol chứa mẫu thử.
Bịt miệng 2 ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống, để yên 15 phút và quan sát cột bọt trong 2 ống nghiệm. Nếu trong 2 ống nghiệm có cột bọt bền thì mẫu thử có chứa saponin.
Kết quả: cả hai ống nghiệm không có bọt, phản ứng âm tính.
Hình 17 Định tính saponin dựa vào tính chất tạo bọt
Thuốc thử Pb(CH3COO)2 bão hòa
Phản ứng dương tính có saponin khi xuất hiện kết tủa.
Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 mL mẫu thử, thêm từ từ dung dịch Pb(CH3COO)2 bão hòa vào
Kết quả: không xuất hiện kết tủa, phản ứng âm tính.
(2 ) (2 ) (1 ) (1 )
33
Hình 18Định tính saponin bằng Pb(CH3COO)2 bão hòa
(1): mẫu thử
(2): mẫu thử có thuốc thử Kết luận: trong cao tổng không có chứa saponin.
4.2.6 Khảo sát sự hiện diện của glycoside
Thuốc thử Fehling
Fehling A: dung dịch CuSO4.
Fehling B: dung dịch muối kali natri tartrat.
Phản ứng dương tính có glycoside khi xuất hiện kết tủa đỏ gạch
Thực nghiệm: Cho vào ống nghiệm vài giọt Fehling A, vài giọt Fehling B theo tỉ lệ 1:1, lắc, ta thấy xuất hiện màu xanh thẫm, thêm dung dịch mẫu thử rồi đem đun cách thủy.
Kết quả: xuất hiện kết tủa đỏ gạch, phản ứng dương tính.
Hình 19 Định tính glycoside bằng thuốc thử Fehling Kết luận: trong cao tổng có chứa glycoside.
4.2.7 Khảo sát sự hiện diện của iridoid
Thuốc thử Trim-Hill: CH3COOH (10 mL), dung dịch nước 0,2% CuSO4
(1 mL), HCl đậm đặc (0,5 mL).
Phản ứng dương tính có iridoid khi dung dịch chuyển màu xanh dương.
(1 )
(2 )
34
Thực nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 mL mẫu thử, thêm vài giọt thuốc thử Trim-Hill vào.
Kết quả: dung dịch chuyển màu, phản ứng dương tính.
Hình 20Định tính iridoid bằng thuốc thử Trim-Hill
(1): mẫu thử
(2): mẫu thử có thuốc thử Kết luận: trong cao tổng có chứa iridoid.
Bảng 1 Kết quả định tính một số nhóm hợp chất có trong lá cóc kèn
Nhóm chức Thuốc thử Hiện tượng Kết luận
Alkaloid Mayer Kết tủa vàng nhạt +
Dragendroff Kết tủa cam +
Flavonoid
FeCl3 5% Kết tủa xanh đen +
H2SO4 đậm đặc Dung dịch vàng nâu + 1% NaOH/ethanol Dung dịch màu vàng + Steroid-
Triterpenoid
Liebermann-Burchard Kết tủa đỏ +
Salkowski Dung dịch màu đỏ đậm +
Tanin Stiasny Không xuất hiện trầm hiện -
Pb(CH3COO)2 bão hòa Không có kết tủa -
Saponin Phản ứng tạo bọt Không có bọt -
Pb(CH3COO)2 Không có kết tủa -
Glycoside Fehling Kết tủa gạch +
Iridoid Trim-Hill Dung dịch có màu xanh +
4.3 KHẢO SÁT CAO PETROLEUM ETHER 4.3.1 Sắc ký cột thường cao PE 4.3.1 Sắc ký cột thường cao PE
Tiến hành sắc ký cột thường cao PE với các số liệu như sau:
Đường kính cột: 2 cm.
Khối lượng pha tĩnh (silica gel 60 F254): 35 g.
Khối lượng cao PE: 2 g.
Chiều cao cột silica gel: 25 cm.
Dung môi ổn định cột: petroleum ether 100%.
(2 ) (1
35
Phương pháp nhồi cột: nhồi cột ướt.
Dung môi triển khai cột ban đầu là PE, sau đó dùng hệ dung môi PE:EA (tăng dần tỷ lệ EA).
Dung dịch ra khỏi cột được hứng vào các lọ với thể tích như nhau. Sau đó chấm TLC các lọ theo thứ tự, các lọ có vết giống nhau được gom chung lại thành một phân đoạn. Các vết chấm được so sánh trong cùng một bản mỏng và cùng một hệ dung môi giải ly bản mỏng để việc so sánh giá trị Rf dễ dàng. Dung dịch hiện hình bản mỏng là H2SO4 20% trong MeOH.
Kết quả sắc ký cột thường cao PE được trình bày trong bảng sau: Bảng 2 Kết quả sắc ký cột thường cao PE
Phân đoạn Thứ tự lọ Dung môi triển khai cột Dung môi giải ly bản mỏng Kết quả TLC Ghi chú I 1-9 PE 100% PE:EA = 8:2 Không có vết II 10 PE:EA = 95:5 PE:EA = 8:2 1 vết màu đỏ, 1 vết
mờ ở dưới. Dung dịch màu đỏ, lượng rất ít. III 11-16 PE:EA = 95:5 PE:EA = 8:2 2 vết chính có Rf
gần nhau,1 vết màu cam, 1 vết màu tím. Dung dịch màu vàng, không có tinh thể. IV 17-25 PE:EA = 95:5 PE:EA = 8:2 1 vết màu xanh,
đậm. Dung dịch màu vàng, tinh thể màu trắng V 26-39 PE:EA = 90:10 PE:EA = 8:2 1 vết chính đậm, 1 vết mờ ở phía trên, kéo vệt. Khảo sát tiếp. VI 40-60 PE:EA = 90:10 PE:EA = 8:2 2 vết chính, 1 vết màu cam, 1 vết màu xanh. Khảo sát tiếp. VII 61-100 101- 120 PE:EA = 90:10 PE:EA = 80:20 PE:EA = 7:3 PE:EA = 6:4 1 vết chính màu xanh, kéo vệt. VIII 121- 139 PE:EA = 75:25 PE:EA = 5:5 1 vết chính, nhiều vết phụ. IX 140- 161 PE:EA = 75:25 EA:Me = 99:1 2 vết chính rất gần nhau, kéo vệt. X 160- 195 PE:EA = 75:25 EA:Me = 99:1 1 vết, vệt đuôi kéo dài. Xả cột Me
36
Hình 21 Sắc ký cột thường cao PE
Sau khi sắc ký cột cao PE, thu được một chất kết tinh màu trắng ở phân đoạn IV chỉ có 1 vết tròn, đậm. Dùng phương pháp kết tinh lại nhiều lần để tinh chế, thu được chất sạch thứ nhất gọi là T1. Khảo sát TLC của T1 trên 3 hệ dung môi giải ly có độ phân cực khác nhau chỉ cho một vết và chất T1 được gửi đi đo phổ để xác định cấu trúc hóa học.
Hình 22 Tinh thể chất T1
Kết quả TLC của chất T1 được trình bày trong hình 23.
Hình 23 Kết quả TLC chất T1 trong 3 hệ dung môi khác nhau
(1) Hệ giải ly PE:EA = 6:4 (Rf = 0,77) (2) Hệ giải ly PE:DC = 2:8 (Rf = 0,45) (3) Hệ giải ly He:DC = 7:3 (Rf = 0,09)
37
4.3.2 Khảo sát phân đoạn PE VI
Phân đoạn PE VI có 2 vết chính có Rf khá xa nhau và khối lượng khá nhiều nên được tiếp tục sắc ký cột thường để tách chất. Tiến hành sắc ký cột thường phân đoạn PE VI với các số liệu như sau:
Đường kính cột: 1 cm.
Khối lượng pha tĩnh (silica gel 60 F254): 5 g.