g. Nhận xét đối với sinh viện thực hiện đề tài:
2.5 Một số kỹ thuật sắc ký
2.5.1 Sắc ký cột (Column Chromatography)
Sắc ký cột là một trong những kỹ thuật rất quan trọng.Trong nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên, sắc ký cột thường được sử dụng để tách riêng các hợp chất từ một hỗn hợp.
Trong sắc ký cột thông thường, chất hấp thu (pha tĩnh) được nạp vào một cột làm bằng thủy tinh (có thể nạp dưới dạng khô hay ướt), dung môi di chuyển qua lớp pha tĩnh theo chiều từ trên cao xuống thấp nhờ vào trọng lực. Mẫu được nạp ở đầu trên của cột, do ái lực khác nhau của các hợp phần trong mẫu với pha tĩnh và pha động mà có sự tách riêng giữa các hợp phần này.
Các chất hấp thu thường dùng: nhôm oxit, silica gel, polyamide, CaCO3,… Chất hấp thuthường được sử dụng là silica gel, pha động là các dung môi hữu cơ với nhiều tỷ lệ khác nhau, tìm hệ dung môi dựa vào sắc ký lớp mỏng. Thông thường người ta nạp silica gel vào cột dưới dạng sệt (nạp ướt) do silica gel có khả năng trương nở khi bị solvat hóa.
Dung môi giải ly cột
Các hệ dung môi dùng cho sắc ký lớp mỏng đều có thể ứng dụng vào sắc ký cột. Tuy vậy, đối với các dung môi có độ sôi quá thấp hoặc có mùi khó chịu hoặc độc thì không nên dùng làm dung môi giải ly cột.
Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp. Sau khi đã chọn được thì có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc ký cột. Cần phải chỉnh tỉ lệ dung môi sao cho có tính kém phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn.
Thông thường nên bắt đầu bằng một dung môi không phân cực để loại một cách tương đối các hợp chất không phân cực ra khỏi cột và kế đó dung môi giải ly sẽ được tăng dần độ phân cực để đuổi các hợp chất có tính phân cực hơn. Muốn thay đổi một dung môi có tính phân cực hơn, thì phải thay đổi bằng cách cho thêm vào mỗi lần vài phần trăm một lượng dung môi có tính phân cực hơn vào dung môi đang giải ly. Thí dụ đang giải ly với ete dầu hỏa,
15
sau đó muốn đổi sang ethyl acetate thì phải thêm từ từ theo tỷ lệ (99:1) (99 mL ete dầu hỏa và 1 mL ethyl acetate), (98:2); (95:5); (90:10); (70:30); (50:50); (10:90); (0:100). Nếu cho thêm vào đột ngột thì sẽ làm gãy cột do alumine hay silica gel được trộn với dung môi sẽ tạo ra nhiệt, nhiệt này làm cho dung môi bốc hơi một cách cục bộ, hơi sinh ra sẽ tạo bọt khí và làm nứt, gãy cột, cột gãy sẽ làm khả năng tách của cột kém đi.
Thông thường, hợp chất không phân cực di chuyển nhanh và được giải ly ra khỏi cột trước còn các hợp chất phân cực sẽ di chuyển chậm hơn (khối lượng phân tử cũng liên quan đến thứ tự giải ly, một hợp chất không phân cực và có khối lượng phân tử lớn sẽ di chuyển chậm hơn một hợp chất không phân cực và có khối lượng phân tử nhỏ hơn).
Kích thước cột và lượng chất hấp thu
Kích thước cột sắc ký và lượng chất hấp thu cần được lựa chọn thích đáng để có thể tách tốt các mẫu cần sắc ký. Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì khối lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25-50 lần khối lượng mẫu chất cần sắc ký. Tuy nhiên, với những hỗn hợp các hợp chất khó tách riêng thì cần số lượng chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100-200 lần), còn với các hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng lượng chất hấp thu ít hơn. Ngoài ra, chiều cao của lượng chất hấp thu cần đạt tỉ lệ: chiều cao chất hấp thu: đường kính trong của cột vào khoảng 10:1.
Nạp chất hấp thu vào cột
Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột
Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá.Nếu phần đầu ra của cột không có miếng thủy tinh xốp để chặn thì nhồi vào một lớp bông gòn để thay thế. Chất hấp thuđược nạp vào cột ở dạng sệt được chuẩn bị như sau:
- Trong một becher đã chứa sẵn dung môi (loại bắt đầu cho quá trình giải ly cột), cho chất hấp thu vào becher, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa rót vừa khuấy nhẹ đều. Lượng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt khiến cho bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng.
- Nhờ một phễu lọc có đuôi dài đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa mở nhẹ khóa ở bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher sạch ở bên dưới cột, dung môi này được rót trả lại lên đầu cột.
- Tiếp tục rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng một thanh cao su khỏ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột.
16
- Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài ba lần để cột được nạp chặt hơn, cho đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạng đồng nhất.
Trong quá trình nạp cột, dung môi vẫn liên tục chảy nhẹ đều ra khỏi cột, luôn luôn phải có dung môi phủ trên phần đầu cột.
Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thuở đầu cột phải nằm ngang. Nếu mặt thoáng không nằm ngang phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ phần dung môi sát mặt thoáng làm xáo một phần chất hấp thu ở trên đầu cột, để yên, chất hấp thu lắng xuống từ từ tạo nên một mặt thoáng bằng phẳng.
Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột
Cho dung môi loại kém phân cực nhất có thể vào khoảng hai phần ba chiều cao cột, sau đó cho từ từ bột hấp thu vào cột, dùng thanh cao su khỏ nhẹ vào bên ngoài thành cột theo chiều từ dưới lên để bột xuống được đều đặn. Khi lớp chất hấp thu đạt chiều cao khoảng 2 cm thì mở nhẹ khóa cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để bên dưới cột, dung môi này được sử dụng lại để rót trả lại trên đầu cột. Tiếp tục cho bột hấp phụ vào đến khi cột đạt được chiều cao nhất định.Tiếp đến, rót dung môi vào cột và cho chảy liên tục một thời gian để ổn định cột. Từ lúc này trở đi không được để khô dung môi ở đầu cột.
Theo dõi quá trình giải ly cột
Với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu, quá trình giải ly cột có thể được theo dõi bằng mắt thường nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu sắc khác nhau đang tách ra xa nhau trong cột. Theo dõi các lớp màu khác nhau đó và hứng chúng khi chúng được giải ly ra khỏi cột. Tuy nhiên trong đa số trường hợp các chất hữu cơ thường không có màu, phải theo dõi bằng nhiều cách khác nhau.
Phương pháp thông dụng nhất là theo dõi quá trình sắc ký cột bởi sắc ký lớp mỏng, áp dụng cho những phân đoạn dung dịch hứng được trong quá trình giải ly. Dung dịch giải ly ra khỏi cột được hứng vào lọ thủy tinh được đánh số thứ tự và được cân bì sẵn, mỗi lọ thủy tinh sẽ hứng một thể tích bằng nhau của dung dịch giải ly. Dung dịch của những lọ hứng sẽ được sắc ký lớp mỏng trên cùng một bản mỏng. Những lọ nào có kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau sẽ được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn. Sau đó làm bay hơi dung môi trong mỗi phân đoạn sẽ thu được cao của phân đoạn đó.
17
2.5.2 Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC)
Sắc ký lớp mỏng (TLC) còn gọi là sắc ký bản mỏng hay sắc ký phẳng chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thu. Trong đó, pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một lớp chất hấp thu trơ như: silica gel hoặc oxit nhôm, chất hấp phụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp phụ được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng (TLC).
Bình sắc ký: một chậu, hũ, lọ,… bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy.
Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu, thí dụ như silica gel, alumin…được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic.
Mẫu chất phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau, thông qua một ống vi quản, được đưa lên lớp pha tĩnh ở vị trí cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình sắc ký.
Trong quá trình sắc ký, pha động di chuyển theo chiều từ dưới lên nhờ lực mao quản, mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với một vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các tương tác với pha tĩnh và pha động của các thành phần trong mẫu chất. Đối với pha tĩnh là silica gel các chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và các chất phân cực sẽ di chuyển chậm.
Giải ly bản mỏng
Chuẩn bị bình giải ly bản mỏng
Chuẩn bị bình có kích thước lớn hơn một chút so với kích thước của bản mỏng. Kích thước của bình và lượng thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá trị Rf của mẫu. Cần sử dụng bình nhỏ nhất có thể vì như thế bầu khí quyển sẽ nhỏ nhất. Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung môi vào bình. Mực dung môi không được cao hơn vị trí chấm mẫu trên bản mỏng.
Trước khi cho tấm bản mỏng vào bình, bình cần được bão hòa dung môi để có một bầu khí quyển đồng nhất, để quá trình bão hòa dung môi được nhanh người ta phủ bề mặt trong của bình bằng một tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải ly để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc.
18
Đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, cạnh đáy của bản ngập vào dung môi giải ly khoảng 0,5-1 cm. Hệ dung ly phù hợp là sao khi giải ly, hệ sẽ cho các vết chính có Rf khoảng từ 0,3 đến 0,6.
Hình 3 Giải ly bản mỏng
Các kỹ thuật giải ly bản mỏng
Dung môi giải ly di chuyển xuống
Sau khi bình đã bão hòa dung môi, người ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, để cho các vết chấm mẫu ở phía trên cao, gần với nắp đậy bình. Ở phía trên cao của bình triển khai, có một máng nhỏ chứa dung môi giải ly. Người ta cho một tờ giấy lọc (có chiều ngang bằng chiều ngang của tấm bản mỏng) vắt ngang từ máng qua tấm lớp mỏng, để dung môi từ máng di chuyển đến cạnh đầu trên của tấm bản mỏng rồi đi xuống dưới thấp.
Dung môi giải ly di chuyển lên
Sau khi bình đã bão hòa dung môi, người ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, để cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh phía dưới gần đáy bình. Cạnh đáy của tấm bản mỏng ngập vào dung dịch giải ly khoảng 0,5-1 cm.
Giải ly nhiều lần liên tiếp
Kỹ thuật được áp dụng để tách mẫu có chứa các hợp chất có Rfgần sát nhau, thực hiện bằng cách giải ly nhiều lần liên tiếp với cùng một loại dung môi đã chọn. Mỗi lần giải ly xong, lấy bản ra, sấy khô và cho vào trở lại để giải ly lần nữa.
Giải ly hai chiều
Trên tấm sắc ký bản mỏng hình vuông, thí dụ 20×20 cm, chấm dung dịch mẫu cần phân tích lên góc phải, cách hai bìa một khoảng 2-3 cm, giải ly với hệ
19
dung môi X. Lấy bản ra, sấy khô và xoay bản 90°, đặt trở lại bình sắc ký để được giải ly với hệ dung môi Y.
Hiện hình các vết sau khi giải ly
Sau khi giải ly xong, các vết có màu sẽ được phát hiện bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phương pháp hóa học hoặc vật lý.
Phương pháp vật lý thông dụng nhất là sử dụng máy soi UV ở các bước sóng 254 và 365 nm.
Phương pháp hóa học là phát hiện các vết bằng thuốc thử, bằng cách hòa thuốc thử vào một dung môi thích hợp rồi phun xịt thuốc thử này lên bản mỏng hoặc nhúng bản mỏng vào một lọ có chứa dung dịch thuốc thử, sau đó hơ nóng trên bếp điện đến khi các vết hiện rõ.
Giá trị Rf
Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn, có giá trị Rf không đổi trong một hệ dung môi xác định. Cách tính giá trị Rf được thể hiện trong hình sau:
Hình 4 Cách tính giá trị Rf
Các công dụng của sắc ký lớp mỏng
Kỹ thuật TLC hiện nay vẫn là công cụ rất cần thiết trong ngành hóa hữu cơ, đặc biệt là trong hóa học các hợp chất thiên nhiên:
- Để công bố đặc điểm của hợp chất vừa chiết tách, cô lập được. - Để kiểm tra xem hai hợp chất có giống nhau hay không.
- Để tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất cần khảo sát. - Để chuẩn bị cho việc sắc ký cột.
- Để theo dõi diễn tiến của một phản ứng tổng hợp hữu cơ. - Để kiểm tra biết một hợp chất có kém bền.
20
2.5.3 Một số kỹ thuật khác
2.5.3.1 Sắc ký cột pha đảo
Khi tiến hành sắc ký cột trên những chất rất phân cực, nếu sử dụng silica gellàm chất hấp thu, khả năng các chất bị giữ lại trên cột sẽ rất lớn, do đó, gây hao hụtnhiều mẫu phân tích. Các chất phân cực cũng rất khó tách ra khỏi nhau trên các chấthấp thu phân cực như silica gel.Để khắc phụctình trạng này người ta sử dụng loại silica gel pha đảo, bề mặt loạisilica gel này ít phân cực, do đó, không giữ chặt những chất phân cực. Có nhiều loạisilica gel pha đảo nhưng phổ biến nhất là C8 và C18. Sắc ký cột trên silica gel pha đảoxảy ra theo cơ chế phân bố, chất càng phân cực thì được giải ly ra khỏi cột càng nhanh.
Bên cạnh silica gel thường và silica gel pha đảo, còn có nhiều loại pha tĩnh khácnhư alumin, các loại silica gel chế hóa dùng cho pha thường, các loại pha tĩnh dùngtrong sắc ký lọc gel,… Tùy vào mục đích sử dụng mà lựa chọn loại pha tĩnh phù hợp.
Diaion là tên gọi chung của nhiều loại polymer được điều chế nhờ quá trìnhđồng trùng hợp giữa styren và divinylbenzen do hãng Mitsubishi (Nhật Bản) sản xuất.Cũng như silica gel của Merck hay sephadex của Pharmacia, diaion cũng cónhiều loại hoạt động theo nhiều cơ chế khác nhau, thông dụng nhất là các loại diaionhoạt động theo cơ chế phân bố kiểu pha đảo, dưới tên chung là diaion HP. Tùy kíchthước hạt và đường kính xoang, có 4 loại diaion HP phổ biến là diaion HP-10, HP-20,HP-30 và HP-40. Trong đó thông dụng nhất là diaion HP-20.Diaion HP-20 ở dạng hạt nhẹ, xốp, diện tích bề mặt khoảng 600 m2/g, đườngkính xoang trung bình khoảng 0,04 mm. Diaion không tan trong nước và cũng khôngtan trong các dung môi hữu cơ. Diaion có thể sử dụng được ngay cả khi dung môi khaitriển là acid hoặc kiềm.Diaion HP-20 chủ yếu được sử dụng như là một pha tĩnh cho mục đích phânchia các cao thô ban đầu, ít khi được sử dụng cho mục đích cô lập chất tinh khiết.
2.5.3.2 Sắc ký lớp mỏng pha đảo
Chất hấp thu cho sắc ký lớp mỏng loại này là silica gel pha đảo (C18), pha tĩnhnày có tính chất không phân cực, hấp thu mạnh các hợp chất không phân cực. Khi giảily bản mỏng với các loại dung môi phân cực, các chất phân cực của mẫu chất, dokhông bị pha tĩnh níu giữ mạnh, sẽ được giải ly đi lên trên cao, còn cácchất khôngphân cực của mẫu chất sẽ ở vị trí thấp; nghĩa là thứ tự các loại hợp chất phân cực vàkhông phân cực hiện diện trên bản có trật tự ngược lại với bản tráng silica gel thôngthường.
21
Pha động là hệ dung môi phân cực, thường dùng các dung môi tan trong nước, trong rất nhiều trường hợp, nước là thành phần chính của pha động. Thường dùng hỗn hợp methanol-nước, acetonitril-nước với các tỷ lệ thích hợp, có thể thêm vào các dungdịch đệm, chất điện ly,…
So với sắc ký lớp mỏng pha thường, sắc ký lớp mỏng pha đảo có một số ưuđiểm như: tính chọn lọc cao, tách tốt các hợp chất, nhưng giá rất đắt. Có thể