g. Nhận xét đối với sinh viện thực hiện đề tài:
2.5.2 Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC)
Sắc ký lớp mỏng (TLC) còn gọi là sắc ký bản mỏng hay sắc ký phẳng chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thu. Trong đó, pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một lớp chất hấp thu trơ như: silica gel hoặc oxit nhôm, chất hấp phụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp phụ được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng (TLC).
Bình sắc ký: một chậu, hũ, lọ,… bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy.
Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu, thí dụ như silica gel, alumin…được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic.
Mẫu chất phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau, thông qua một ống vi quản, được đưa lên lớp pha tĩnh ở vị trí cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình sắc ký.
Trong quá trình sắc ký, pha động di chuyển theo chiều từ dưới lên nhờ lực mao quản, mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với một vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các tương tác với pha tĩnh và pha động của các thành phần trong mẫu chất. Đối với pha tĩnh là silica gel các chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và các chất phân cực sẽ di chuyển chậm.
Giải ly bản mỏng
Chuẩn bị bình giải ly bản mỏng
Chuẩn bị bình có kích thước lớn hơn một chút so với kích thước của bản mỏng. Kích thước của bình và lượng thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá trị Rf của mẫu. Cần sử dụng bình nhỏ nhất có thể vì như thế bầu khí quyển sẽ nhỏ nhất. Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung môi vào bình. Mực dung môi không được cao hơn vị trí chấm mẫu trên bản mỏng.
Trước khi cho tấm bản mỏng vào bình, bình cần được bão hòa dung môi để có một bầu khí quyển đồng nhất, để quá trình bão hòa dung môi được nhanh người ta phủ bề mặt trong của bình bằng một tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải ly để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc.
18
Đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, cạnh đáy của bản ngập vào dung môi giải ly khoảng 0,5-1 cm. Hệ dung ly phù hợp là sao khi giải ly, hệ sẽ cho các vết chính có Rf khoảng từ 0,3 đến 0,6.
Hình 3 Giải ly bản mỏng
Các kỹ thuật giải ly bản mỏng
Dung môi giải ly di chuyển xuống
Sau khi bình đã bão hòa dung môi, người ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, để cho các vết chấm mẫu ở phía trên cao, gần với nắp đậy bình. Ở phía trên cao của bình triển khai, có một máng nhỏ chứa dung môi giải ly. Người ta cho một tờ giấy lọc (có chiều ngang bằng chiều ngang của tấm bản mỏng) vắt ngang từ máng qua tấm lớp mỏng, để dung môi từ máng di chuyển đến cạnh đầu trên của tấm bản mỏng rồi đi xuống dưới thấp.
Dung môi giải ly di chuyển lên
Sau khi bình đã bão hòa dung môi, người ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, để cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh phía dưới gần đáy bình. Cạnh đáy của tấm bản mỏng ngập vào dung dịch giải ly khoảng 0,5-1 cm.
Giải ly nhiều lần liên tiếp
Kỹ thuật được áp dụng để tách mẫu có chứa các hợp chất có Rfgần sát nhau, thực hiện bằng cách giải ly nhiều lần liên tiếp với cùng một loại dung môi đã chọn. Mỗi lần giải ly xong, lấy bản ra, sấy khô và cho vào trở lại để giải ly lần nữa.
Giải ly hai chiều
Trên tấm sắc ký bản mỏng hình vuông, thí dụ 20×20 cm, chấm dung dịch mẫu cần phân tích lên góc phải, cách hai bìa một khoảng 2-3 cm, giải ly với hệ
19
dung môi X. Lấy bản ra, sấy khô và xoay bản 90°, đặt trở lại bình sắc ký để được giải ly với hệ dung môi Y.
Hiện hình các vết sau khi giải ly
Sau khi giải ly xong, các vết có màu sẽ được phát hiện bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phương pháp hóa học hoặc vật lý.
Phương pháp vật lý thông dụng nhất là sử dụng máy soi UV ở các bước sóng 254 và 365 nm.
Phương pháp hóa học là phát hiện các vết bằng thuốc thử, bằng cách hòa thuốc thử vào một dung môi thích hợp rồi phun xịt thuốc thử này lên bản mỏng hoặc nhúng bản mỏng vào một lọ có chứa dung dịch thuốc thử, sau đó hơ nóng trên bếp điện đến khi các vết hiện rõ.
Giá trị Rf
Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn, có giá trị Rf không đổi trong một hệ dung môi xác định. Cách tính giá trị Rf được thể hiện trong hình sau:
Hình 4 Cách tính giá trị Rf
Các công dụng của sắc ký lớp mỏng
Kỹ thuật TLC hiện nay vẫn là công cụ rất cần thiết trong ngành hóa hữu cơ, đặc biệt là trong hóa học các hợp chất thiên nhiên:
- Để công bố đặc điểm của hợp chất vừa chiết tách, cô lập được. - Để kiểm tra xem hai hợp chất có giống nhau hay không.
- Để tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất cần khảo sát. - Để chuẩn bị cho việc sắc ký cột.
- Để theo dõi diễn tiến của một phản ứng tổng hợp hữu cơ. - Để kiểm tra biết một hợp chất có kém bền.
20