Khóa luận Bước đầu nghiên cứu sản xuất nước tương lên men

o Bước đầu sử dụng kết hợp enzym protease của nấm mốc và các chếphẩm protease thương mại nhằm nâng cao hơn nữa hàm lượng Nitơ amintự do trong nước tương.. Nước tương lên men là một loại

Mục đích của luận văn “Bước đầu nghiên cứu sản xuất nước tương lên men”

nhằm khảo sát các thông số công nghệ để thủy phân một cách có hiệu quả và triệt đểhàm lượng protein thô còn tồn tại khá lớn trong nguyên liệu khô lạc của các nhà máyép dầu, nâng cao hàm lượng Nitơ amin tự do trong nước tương lên men Đồng thời đưangười sản xuất và người tiêu dùng trở về với một sản phẩm lên men truyền thống thânthiện với môi trường và tốt cho sức khoẻ con người

Sau khi tham khảo các nguồn tài liệu thu thập được về các nội dung:

o Quy trình sản xuất nước tương lên men ở một số nước trên thế giới

o Điều kiện sinh trưởng của nấm mốc Aspergillus oryzae.

o Đặc tính của một số chế phẩm enzym protease trên thị trường

Chúng tôi đã đề ra hướng nghiên cứu trong luận văn tốt nghiệp này như sau:

o Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi nấm mốc để sinh tổnghợp enzym protease có hoạt tính cao nhất

o Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân để nâng cao hàmlượng Nitơ amin tự do trong nước tương

o Bước đầu sử dụng kết hợp enzym protease của nấm mốc và các chếphẩm protease thương mại nhằm nâng cao hơn nữa hàm lượng Nitơ amintự do trong nước tương

Sản phẩm mà chúng tôi thu được trong nghiên cứu này là dịch nước tương sauthủy phân với hàm lượng Nitơ amin và Nitơ tổng cao nhất là 8.93 (g/l) và 14.41 (g/l)

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN iii

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC BẢNG viii

CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về cây lạc 4

2.1.1 Lịch sử phát hiện và đặc điểm thực vật của cây lạc 4

2.1.2 Thành phần hóa học của hạt lạc 5

2.2 Tổng quan về khô lạc 7

2.3 Tổng quan về nước tương 9

2.3.1 Định nghĩa nước tương 9

2.3.2 Giới thiệu một số phương pháp sản xuất nước tương 10

2.3.3 Tiêu chuẩn chất lượng nước tương 16

2.3.4 Vi sinh vật dùng trong sản xuất nước tương lên men 17

2.3.5 Hệ enzyme trong sản xuất nước tương lên men 21

CHƯƠNG 3 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

3.1.2 Bột mì 31

3.1.3 Muối 31

3.1.4 Nước 31

3.1.5 Vi sinh vật 31

3.2 Hóa chất sử dụng 31

3.3 Dụng cụ và thiết bị 31

3.3.1 Dụng cụ 31

3.3.2 Thiết bị 32

3.4 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 32

3.4.1 Nội dung nghiên cứu 32

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 33

3.5 Các phương pháp phân tích 36

3.5.1 Định lượng N tổng 36

3.5.2 Định lượng N amin 37

3.5.3 Định lượng N ammoniac 38

3.5.4 Định lượng lipid thô bằng bộ Soxhlet 38

3.5.5 Định lượng tinh bột 38

3.5.6 Định lượng cellulose 38

3.5.7 Định lượng độ tro 39

3.5.8 Định lượng hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến 39

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40

4.1 Khảo sát thành phần nguyên liệu 40

4.1.1 Khảo sát thành phần khô lạc 40

4.1.2 Khảo sát thành phần bột mì 42

4.2.2 Aûnh hưởng của độ ẩm tới hoạt tính protease 47

4.2.3 Aûnh hưởng của tỉ lệ mốc cấy tới hoạt tính protease 50

4.2.4 Aûnh hưởng của thời gian nuôi mốc tới hoạt tính protease 53

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

5.1 Kết luận 60

5.2 Kiến nghị 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC 64

HÌNH 2.1: Cây lạc 4

HÌNH 2.2: Quy trình công nghệ sản xuất nước tương hóa giải 11

HÌNH 2.3: Quy trình công nghệ sản xuất nước tương lên men 13

HÌNH 2.4: Aspergillus oryzae 20

HÌNH 3.1: Bánh dầu lạc 30

HÌNH 3.2: Khô lạc sau nghiền 30

HÌNH 4.1: Quan hệ giữa tỉ lệ nguyên liệu và hoạt tính protease 44

HÌNH 4.2: Quan hệ giữa độ ẩm môi trường và hoạt tính protease (lần 1) 48

HÌNH 4.3: Quan hệ giữa độ ẩm môi trường và hoạt tính protease (lần 2) 49

HÌNH 4.4: Quan hệ giữa tỉ lệ mốc cấy và hoạt tính protease 52

HÌNH 4.5: Quan hệ giữa thời gian nuôi cấy và hoạt tính protease (lần 1) 55

HÌNH 4.6: Quan hệ giữa thời gian nuôi cấy và hoạt tính protease (lần 2) 56

BẢNG 2.1: Thành phần hóa học trung bình của lạc nhân 5

BẢNG 2.2: Thành phần hóa học của hạt lạc 5

BẢNG 2.3: Các loại acid amin không thay thế trong hạt lạc 7

BẢNG 2.4: Thành phần hóa học của khô lạc 8

BẢNG 2.5: Hàm lượng acid amin trong khô lạc 8

BẢNG 2.6: Hàm lượng khoáng trong khô lạc 8

BẢNG 2.7: Chỉ tiêu hóa học của nước chấm ( TCVN 1763-75) 16

BẢNG 2.8: Chỉ tiêu cảm quan của nước chấm ( TCVN 1763-75) 17

BẢNG 2.9: Các loài vi sinh vật dùng trong sản xuất nước tương ở các nước 18

BẢNG 4.1: Kết quả khảo sát thành phần hóa học của khô lạc 40

BẢNG 4.2: Thành phần hóa học của khô đậu nành 40

BẢNG 4.3: Thành phần hóa học của bột mì từ công ty Bình Đông 42

BẢNG 4.4: Aûnh hưởng của tỉ lệ khối lượng khô lạc:bột mì đến hoạt tính protease trong canh trường bề mặt Asp oryzae 44

BẢNG 4.5: Tỉ lệ phối trộn nguyên liệu trong sản xuất nước tương ở Nhật Bản 46

BẢNG 4.6: Aûnh hưởng của độ ẩm môi trường đến hoạt tính protease từ Asp oryzae (lần 1) 47

BẢNG 4.7: Aûnh hưởng của độ ẩm môi trường đến hoạt tính protease từ Asp oryzae (lần 2) 48

BẢNG 4.8: Aûnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến hoạt tính protease từ Asp oryzae 51

BẢNG 4.9: Aûnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt tính protease (lần 1) 54

BẢNG 4.10: Aûnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt tính protease từ Asp oryzae (lần 2) 55

Từ viết tắt Tên đầy đủ

Đvhđ/gctk Đơn vị hoạt độ/gam canh trường khô

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1.Giới thiệu

Trong cuộc sống ngày nay, người ta luôn dùng các loại gia vị kèm vào bữa ănnhư nước mắm, nước chấm từ thực vật … Nước chấm từ thực vật hay còn gọi là nướctương, tàu vị yểu được dùng phổ biến ở Việt Nam Nước chấm từ thực vật ngoài vaitrò cung cấp mùi vị, nó còn cung cấp cho cơ thể người một lượng đạm nhất định vàmột số khoáng chất cần thiết cho cơ thể

Nước tương là tên gọi cho các sản phẩm nước chấm từ thực vật lên men từđậu nành nguyên hạt Còn tàu vị yểu là sản phẩm nước chấm từ thực vật được sảnxuất bằng phương pháp hóa giải nguyên liệu khô dầu Magi là sản phẩm nướcchấm thủy phân từ động vật… Tuy nhiên, hiện nay, nước tương, xì dầu, magi, tàu vịyểu được người sử dụng gọi chung là nước tương

Nước tương lên men là một loại nước chấm giàu chất dinh dưỡng, có hương vịthơm ngon, nó là sản phẩm của quá trình thủy phân nguyên liệu giàu protein dướitác dụng của enzym vi sinh vật Nước tương có vị đậm đà của chất đạm, vị ngọt củađường, vị mặn của muối ăn…

Nước tương được làm và sử dụng cách nay hơn 2500 năm bởi người phươngĐông Khi đạo Phật được truyền bá rộng rãi và việc sử dụng thịt bị kiêng kị thìnước tương là một thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, đáp ứng được nhu cầu ănchay và nhanh chóng trở thành loại gia vị phổ biến ở các nước có tôn giáo là đạoPhật Từ thế kỷ 16, nước tương đã được cải tiến hương vị và hình thức, chúng trởnên đa dạng hơn, phong phú hơn Nhờ vào những thương gia người Hà Lan mànước tương được mang tới Châu Âu vào thế kỷ 17 Và ngày nay nước tương đượctiêu thụ và ngày càng trở nên phổ biến ở Châu Âu

Trên thế giới, nước tương là loại gia vị thực phẩm có tính chất cổ truyền củanhân dân các nước thuộc khu vực châu Á như: Trung Quốc, Nhật Bản, Malaysia,Việt Nam, Indonesia… Hiện nay, có rất nhiều loại nước tương được sản xuất theokhẩu vị và thói quen sử dụng của người tiêu dùng, chẳng hạn như nước tương

Kikoman ở Nhật Bản, Taogi ở Philippin, Tempeh ở Indonesia, Trung Quốc cóYanwajun, Thái lan có Chiang…

Để thủy phân protein trong sản xuất nước chấm, trong nước, hiện nay thôngdụng nhất là sử dụng phương pháp hóa giải bằng acid Tuy nhiên trên thế giới,người ta dần dần hủy bỏ phương pháp hóa giải trong sản xuất nước tương vàchuyển sang phương pháp lên men vi sinh vật Nhật Bản và Trung Quốc là nhữngnước vẫn duy trì công nghệ lên men truyền thống có cải tiến nhiều về các thiết bịvà máy móc nên chất lượng nước tương rất ổn định và được tiêu thụ trên toàn thếgiới

Do những nhược điểm về ô nhiễm môi trường, về chất lượng dinh dưỡng và

an toàn của sản phẩm nên xu thế hiện nay ở trong nước sẽ chuyển dần các cơ sởsản xuất nước tương từ phương pháp hóa giải sang phương pháp lên men Trướcnhững yêu cầu thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Bước đầu nghiên cứu sảnxuất nước tương lên men”

1.2.Mục tiêu của đề tài

Khảo sát quá trình nuôi cấy nấm mốc để tạo ra enzym protease có hoạt tínhcao nhất

Khảo sát quá trình thủy phân protein nhằm nâng cao hàm lượng acid aminbằng phương pháp:

 Sử dụng enzym từ canh trường nấm mốc Aspergillus oryzae

 Kết hợp sử dụng enzym từ canh trường nấm mốc Aspergillus oryzae

và sử dụng chế phẩm enzym protease

1.3.Nội dung nghiên cứu

 Khảo sát thành phần của nguyên liệu

 Xác định tỉ lệ phối trộn nguyên liệu trong môi trường, tỷ lệ mốc cấy,độ ẩm và thời gian thích hợp của quá trình nuôi mốc để sinh tổng hợpprotease có hoạt tính cao nhất

 Xác định tỉ lệ môi trường : dung môi (nước muối), nồng độ muối,nhiệt độ, pH và thời gian thích hợp của quá trình thủy phân proteinbằng enzym từ canh trường nấm mốc để hàm lượng đạm trong dịchthủy phân là lớn nhất.

 Bước đầu khảo sát quá trình thủy phân protein khi sử dụng kết hợpenzym từ canh trường nấm mốc và chế phẩm enzym thương mại đểtăng hàm lượng đạm trong dịch thủy phân

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.Tổng quan về cây lạc [2, 4, 9]

2.1.1 Lịch sử phát hiện và đặc điểm thực vật của cây lạc

Loài : Arachis hypogaea

Lạc còn được gọi là đậu phộng (danh pháp khoa học: Arachis hypogaea), là

một loài cây thực phẩm thuộc họ Đậu, có nguồn gốc từ Nam Mỹ Lịch sử trồng lạc

ở Việt Nam hiện nay chưa được xác minh rõ ràng Nếu căn cứ tên gọi mà xét đoánthì danh từ “lạc” có thể do người Trung Quốc gọi cây lạc là “lạc hoa sinh” Nhưvậy, có thể lạc từ Trung Quốc nhập vào nước ta khoảng thế kỷ XVII-XVIII

Lạc thuộc đậu, thân bò và thẳng, mọc thành bụi Hoa sau khi nở chui xuốngđất, kết quả và thành củ Lạc sinh trưởng nhiều ở vùng nhiệt đới và một số vùng ônđới Trên thế giới, nơi nhiều lạc nhất là các nước thuộc châu Phi, Ấn Độ Miền namnước Nga cũng trồng nhiều lạc Ở Việt Nam, lạc hiện trồng nhiều trên các lưu vựcsông Hồng, sông Mã, sông Lam, một số huyện thuộc Hà Bắc và một số nôngtrường

Trồng lạc không những làm tăng độ màu mỡ cho đất khi cấy lúa (do tác dụngcủa vi sinh vật cố định đạm của các nốt sần có ở rễ lạc, làm tăng chất đạm cho đất)mà còn cho nguyên liệu có dầu thực vật, cho nguồn đạm thực vật phục vụ cho nhucầu nước chấm của nhân dân (sản xuất nước chấm từ khô lạc) và là nguyên liệuxuất khẩu có giá trị lớn Từ khô lạc còn có thể chế biến thành bột bánh, bột dinhdưỡng phẩm chất tốt, loại phẩm chất kém dùng làm thức ăn gia súc.

2.1.2 Thành phần hóa học của hạt lạc

BẢNG 2.1: Thành phần hóa học trung bình của lạc nhân [9]

Thành phần hóa học Hàm lượng (% tổng khối lượng)

BẢNG 2.2: Thành phần hóa học của hạt lạc [18]

Thành phần Hàm lượng/100g lạc nhân

 Một nối đôi 24 g

 Nhiều nối đôi 16 g

Trước đây, người ta chỉ chú ý đến dầu trong hạt lạc mà chưa chú ý đến proteinkhá cao trong hạt và trong các bộ phận khác của cây lạc Tình trạng thiếu proteinhiện nay trên thế giới đòi hỏi phải nghiên cứu sử dụng toàn diện loại cây này.

 Protein:

Protein thô trong hạt lạc khá cao, chủ yếu do 2 globulin (arachin vàconarachin) hợp thành (95%) Conarachin hơn hẳn arachin về dinh dưỡng và cóhàm lượng methionine nhiều gấp 3 lần Trong protein hạt lạc có 2/3 arachin và 1/3conarachin Hàm lượng 4 loại acid amin là Lys, Trp, Met, Thr trong lạc thấp hơn sovới các loại protein khác (BẢNG 2 3)

BẢNG 2.3: Các loại acid amin không thay thế trong hạt lạc [4]

Acid amin Chỉ tiêu lý tưởng (g/16g N) Lạc (g/16g N)

Valine 4.2 4.4

 Lipid:

Trong lipid của hạt lạc có 2 loại acid béo no và acid béo không no Loại acidbéo không no bao gồm: Acid oleic (50-70%); Acid linoleic (13-20%); Acidlinolenoic (13-20%) Loại acid béo không no bao gồm: Acid palmitic(6-11%); Acidstearic (2-6%); Acid arachidic (5-7%)

 Vitamin:

Lạc là thức ăn giàu vitamin nhóm B (ngoại trừ B12), như thiamin (B1),riboflavin (B2), acid pantotenin (B3), B6, acid nicotinic (PP) Giá trị chính của lạc làgiàu vitamin PP (100g lạc đủ cung cấp nhu cầu vitamin PP hàng ngày cho 1 ngườilớn)

Như vậy, lạc là một loại thức ăn giàu lipid, nhiều protein và vitamin Ngoài

ra, lạc còn có hương thơm và mùi vị đặc biệt được tạo nên bởi đường và một sốchất hữu cơ bay hơi

2.2.Tổng quan về khô lạc [2, 9]

Khô lạc hay còn gọi là khô đậu phộng là bã thu được sau quá trình ép lạc ởcác nhà máy ép dầu Khô lạc có hàm lượng protein thô cao, chứa khoảng 35-50%hoặc 5.5-17% protein (tuỳ từng loại khô dầu) Trước đây, người ta thường sử dụngkhô lạc làm thức ăn gia súc Nhưng hiện nay, các nhà sản xuất đã nhận ra được giátrị dinh dưỡng cao trong khô lạc và biết cách tận dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiềnnày trong sản xuất nước tương nhằm đem lại hiệu quả kinh tế cao

BẢNG 2.4: Thành phần hóa học của khô lạc [2]

BẢNG 2.5: Hàm lượng acid amin trong khô lạc [2]

Acid amin Hàm lượng (g/1 kg khô lạc)

BẢNG 2.6: Hàm lượng khoáng trong khô lạc [2]

Chất khoáng Hàm lượng (g/1 kg khô lạc)

 Tình hình sản xuất khô lạc ở Việt Nam

Hiện tại ở Việt Nam, nguồn nguyên liệu khô lạc để sản xuất nước tương chủyếu được nhập từ Ấn Độä Bã lạc sau khi đã trích ly dầu sẽ được ép thành bánh gọilà bánh khô lạc Bánh khô lạc ép thủ công có hàm lượng béo khoảng 5-8% Trongkhi đó, bánh khô lạc ép công nghiệp chỉ còn khoảng 3-5% chất béo

2.3.Tổng quan về nước tương [2, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17]

2.3.1 Định nghĩa nước tương

Nước tương là một loại nước chấm dùng làm gia vị có hàm lượng đạm vànồng độ muối tương đối cao Mặc dù có nhiều tên gọi khác nhau như xì dầu, tàu vịyểu, Magi… nhưng chúng đều được sản xuất chủ yếu bằng 2 phương pháp lên menvà hóa giải nguồn nguyên liệu giàu đạm mà chủ yếu là các hạt có dầu

Nước tương là sản phẩm thủy phân protein của nguyên liệu giàu đạm thànhhỗn hợp các acid amin và polypeptide hòa tan Tác nhân xúc tác là enzym protease

do nấm mốc Asperillus oryzae sinh tổng hợp ra Bên cạnh đó, còn có quá trình thủy

phân tinh bột thành đường (glucose, maltose, dextrin…) dưới tác dụng của enzym

amylase cũng do nấm mốc Asperillus oryzae sinh tổng hợp Ngoài ra, do hoạt động

của một số vi sinh vật tạo hương và những phản ứng hóa học xảy ra dưới sự thamgia của các chất được hình thành trong quá trình thủy phân làm cho nước tương cóhương vị đặc trưng

Giá trị dinh dưỡng của nước tương được thể hiện qua thành phần hóa học,gồm có protein, đường, acid hữu cơ, chất thơm, chất màu Ta quan tâm đặc biệt đếnprotein trong nước tương, các acid amin có trong nước tương sẽ làm cho nước tươngcó vị ngọt và mùi thơm của thịt Đường có vai trò quan trọng trong việc hình thànhmàu sắc của nước tương do phản ứng caramel hóa và phản ứng Maillard giữađường khử và acid amin Các acid hữu cơ có khả năng tham gia tạo hương vị chonước tương

Nước tương có nguồn gốc xuất phát từ Trung Quốc cách đây hàng ngàn năm.Theo con đường phật giáo, nước tương du nhập vào Nhật Bản vào khoảng thế kỉthứ 7, được biến đổi và trở thành một sản phẩm mang nét đặc trưng riêng của ngườiNhật Vào khoảng thế kỉ thứ 17, nước tương đã du nhập vào phương Tây và dầndần trở nên phổ biến khắp thế giới với nhiều chủng loại khác nhau Hiện nay trênthế giới, nước tương được sản xuất chủ yếu bởi các nước châu Á như: Trung Quốc,Malaysia, Thái lan, Nhật Bản… và trong đó có Việt Nam Nước tương được sản xuất

ở các nước khác nhau, thậm chí ở các vùng khác nhau trong cùng một nước cũng cónhững đặc điểm chất lượng khác nhau, thể hiện qua độ sệt, màu sắc và mùi vị.Nguyên nhân là do có sự khác nhau về nguyên liệu ban đầu, tỷ lệ phối trộn giữacác nguyên liệu… Ngoài ra còn khác nhau về chủng vi sinh vật sử dụng trong quátrình lên men, thời gian lên men và chế biến sau lên men

Hiện nay các nước có các sản phẩm nước tương lên men như: kecap củaIndonesia, Ceiew của Thái Lan, meju của Hàn Quốc, shoyu của Nhật Bản

2.3.2 Giới thiệu một số phương pháp sản xuất nước tương

Để sản xuất nước tương, người ta sử dụng 2 phương pháp công nghệ chủ yếulà phương pháp lên men và phương pháp hóa giải

2.3.2.1 Cơ sở khoa học của các phương pháp sản xuất nước tương

Cơ sở khoa học của phương pháp sản xuất nước tương lên men là lợi dụng hệenzym của vi sinh vật phát triển trên nguyên liệu giàu đạm, nuôi chúng để rồi thủyphân protein có trong nguyên liệu thành nước tương Do vậy, trong quá trình sảnxuất, phải nuôi vi sinh vật cho tốt để tạo ra nhiều enzym protease, nâng cao hiệusuất thủy phân protein của nguyên liệu, hạ giá thành sản phẩm.

Cơ sở khoa học của phương pháp sản xuất nước tương hóa giải là dùng hóachất để thủy phân protein của nguyên liệu thành nước tương Do vậy, trong quátrình thủy phân phải đảm bảo tốt các điều kiện nhiệt độ, thời gian để phản ứng tiếnhành triệt để

2.3.2.2 Phương pháp hóa giải:

Quy trình công nghệ (HÌNH 2 2)

Đây là quy trình chủ yếu để sản xuất nước tương công nghiệp từ trước cho đếnnay ở nước ta

Nguyên liệu sản xuất là bã đậu phộng hoặc bã đậu nành được ép thành bánh,trước khi sản xuất cần nghiền nhỏ đến 2-3mm Giai đoạn thủy phân sử dụng tácnhân thủy phân là acid HCl có nồng độ 6-10 N, nhiệt độ 100-180oC và thời gianthủy phân từ 24-72 giờ Dịch sau thủy phân được thêm nước nóng và soda(Na2CO3) để trung hoà lượng acid dư Qua giai đoạn này, dịch thủy phân sẽ đượclọc bỏ phần bã, chỉ lấy nước và đem đi thanh trùng Thông số của quá trình thanhtrùng là: nhiệt độ 60-70oC trong 2-3 giờ hoặc đun ở 90-100oC trong 15-20 phútnhằm tiêu diệt vi sinh vật có trong dịch lọc Các phụ gia bảo quản (như natribenzoat hoặc acid benzoic) được đưa vào trước khi thanh trùng Hương liệu, gia vị,phụ gia tạo màu (caramel) được thêm vào sau khi thanh trùng Sau đó, nước tươngbán thành phẩm được lắng lọc lại lần thứ 2 nhằm tách triệt để các cặn gây vẩn đụchay các thành phần lơ lửng có khả năng tạo cặn trong quá trình bảo quản Sảnphẩm tạo ra là nước tương thành phẩm

HÌNH 2.2: Quy trình công nghệ sản xuất nước tương hóa giải

 Ưu điểm của phương pháp hóa giải:

o Rẻ và nhanh Thời gian của quy trình sản xuất ngắn

o Hiệu suất thủy phân protein cao

o Sản phẩm tạo ra giàu acid amin

o Mùi vị nước tương phù hợp với thị hiếu của người tiêu dùng tại ViệtNam hiện nay.

 Nhược điểm của phương pháp hóa giải:

o Chi phí năng lượng và thiết bị cao do thiết bị phải chịu nhiệt và chịuăn mòn

o Việc sử dụng HCl đặc độc hại và gây ô nhiễm môi trường

o Do nhiệt độ cao và nồng độ acid đặc nên một số acid amin bị phá hủytrong quá trình thủy phân Các acid amin chứa S bị mất 10-30% Cácacid amin chứa nhóm –OH bị phân hủy một phần Trp bị phân hủyhoàn toàn và Thr, Ser, Met, Cys bị phân hủy một phần

o Khi nồng độ HCl cao và nhiệt độ cao thường xảy ra phản ứng giữa Cl

-hoặc HCl với glycerol có trong chất béo, sinh độc tố 3-MCPD

2.3.2.3 Phương pháp lên men

 Quy trình công nghệ (HÌNH 2 3)

 Thuyết minh quy trình công nghệ

o Nghiền:

 Mục đích:

 Chuẩn bị cho quá trình phối trộn và hấp Bánh dầu lạc được nghiềnnhỏ để khi phối trộn, nước thấm đều hơn, khi hấp, nguyên liệu chínđều hơn, tránh hiện tượng “trong sống ngoài chín” Ngoài ra, nghiềncòn nhằm mục đích tăng diện tích phát triển của nấm mốc và khảnăng xúc tác của enzyme khi thủy phân Kích thước thích hợp củanguyên liệu sau nghiền 0,5 – 1 mm

HÌNH 2.3: Quy trình công nghệ sản xuất nước tương lên men

o Phối trộn nguyên liệu:

 Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình hấp và nuôi mốc Khô lạc, bột

mì, nước được phân bố đều trong hỗn hợp Bột mì là nguồn tinh bộtcho nấm mốc sử dụng làm nguồn thức ăn để sinh trưởng và pháttriển Nước có tác dụng làm cho nguyên liệu có độ ẩm thích hợp chosự phát triển của nấm mốc

o Hấp:

 Mục đích: Chuẩn bị chất dinh dưỡng cung cấp cho quá trình nuôimốc Hấp làm chín tinh bột, làm protein bị biến tính Đây là nguồnthức ăn cho nấm mốc phát triển Đồng thời, hấp còn tiêu diệt vi sinhvật bám trên nguyên liệu, làm cho mốc phát triển thuận lợi

o Thủy phân:

 Mục đích: Chế biến - Tạo pH thích hợp cho enzyme protease vàamylase của nấm mốc hoạt động, quá trình thủy phân làm biến đổisâu sắc thành phần nguyên liệu theo hướng tạo ra sản phẩm là nướctương

o Lọc:

 Mục đích: Khai thác - Loại bỏ khô lạc để thu được nước tương thànhphẩm

o Trích ly bã lọc:

 Mục đích: Khai thác - Trích ly phần nước tương còn sót lại trong khôlạc sau khi qua quá trình lọc.

o Phối trộn nước tương:

 Mục đích: Hoàn thiện - Tạo ra các sản phẩm nước tương với chấtlượng khác nhau phụ thuộc vào tỉ lệ phối trộn

o Thanh trùng:

 Mục đích: Bảo quản - Tiêu diệt vi sinh vật, kéo dài thời gian bảoquản sản phẩm

 Thông số kỹ thuật:

 Nhiệt độ thanh trùng: 70 – 800C hoặc 90-100oC

 Thời gian thanh trùng: 0,5 – 1 giờ hoặc 15-20 phút

o Điều hương – điều vị:

 Mục đích: Hoàn thiện - Tạo hương vị thơm ngon cho nước tươngthành phẩm

 Đặc điểm của phương pháp lên men là:

o Nước tương được sản xuất bằng phương pháp lên men do không cóphản ứng sinh ra Glycerin và không sử dụng axit HCl nên không tạothành 3-MCPD

o Tuy nhiên, thời gian sản xuất nước tương bằng phương pháp lên menkéo dài, hiệu suất thủy phân thấp và mùi vị khác so với phương pháphóa giải

2.3.3 Tiêu chuẩn chất lượng của nước tương

Người ta xem nước tương là một loại nước chấm gia vị thực phẩm, nên chấtlượng của nước tương được đánh giá thông qua tiêu chuẩn của nước chấm theo 3nhóm chỉ tiêu:

2.3.3.1 Thành phần hóa học

Về thành phần hóa học, người ta đánh giá nước chấm theo các chỉ tiêu: hàmlượng acid (giá trị pH), hàm lượng N tổng, hàm lượng N amin, hàm lượng Nammoniac, muối ăn

BẢNG 2.7: Chỉ tiêu hóa học của nước chấm ( TCVN 1763-75)

Loại đặc biệt

Hàm lượng Nitơ tổng, không

nhỏ hơn

Hàm lượng Nitơ ammoniac,

không lớn hơn

Hàm lượng Nitơ formol,

không nhỏ hơn

Hàm lượng acid ( tính bằng

ml NaOH 0.1N dùng để trung

hoà 1ml mẫu), không lớn hơn

2.3.3.2 Chỉ tiêu vi sinh

Vi sinh vật có 2 nhóm: nhóm làm hư hỏng sản phẩm (vi khuẩn hiếu khí, nấm

men, nấm mốc) và nhóm vi khuẩn gây bệnh (E.coli…)

Chỉ tiêu vi sinh vật và độc tố của nước tương (TCVN1763-86)

o Không có nấm mốc nhìn thấy bằng mắt thường

o Tổng vi khuẩn hiếu khí, không lớn hơn: 20.000 cfu/ml

o Clostridium perfringens, không lớn hơn 2 cfu/ml

o E.coli : không được có

o Vi khuẩn gây bệnh: không được có

o Aflatoxin: không được có

2.3.3.3 Chỉ tiêu cảm quan

Nước tương phải có màu từ nâu nhạt đến nâu, không có váng, không có cặnbã Trong suốt, có mùi thơm đặc trưng, vị ngọt và mặn dịu, không gắt cổ

Sau đây chúng tôi xin giới thiệu văn bản qui định tiêu chuẩn chất lượng củanước chấm theo TCVN 1763-75

BẢNG 2.8: Chỉ tiêu cảm quan của nước chấm ( TCVN 1763-75)

Màu sắc Màu nâu cánh gián

Mùi Thơm đặc trưng của nước chấm lên men,

không có mùi mốc, không có mùi lạ khác

Vị Ngọt đậm (đối với loại đặc biệt)

Ngọt dịu (đối với loại 1, loại 2), không có

vị chua, vị lạ

Độ trong Trong, không vẩn đục

2.3.4 Vi sinh vật dùng trong sản xuất nước tương lên men

Vi sinh vật trong sản xuất nước tương sẽ chuyển hóa những protein phức tạp,tinh bột của nguyên liệu thành acid amin, đường đơn rất dễ được cơ thể hấp thu.Ngoài ra, vi sinh vật còn tạo ra mùi vị đặc trưng cho từng sản phẩm nước tươngkhác nhau Đối với từng quốc gia, việc sử dụng vi sinh vật để sản xuất nước tương

cũng có một số điểm khác biệt Dưới đây là bảng các loài vi sinh vật dùng trongsản xuất nước tương của một số quốc gia Châu Á (BẢNG 2 9).

Trong phương pháp cổ truyền, người ta thường dùng vi sinh vật có sẵn trong tự

nhiên, các loại nấm mốc thường gặp là Mucor rouxii, Rhizopus nignicans, Asp oryzae… Tuy nhiên, nếu dùng nấm mốc tự nhiên như vậy sẽ rất khó kiểm soát được

chất lượng của sản phẩm và có thể sinh ra độc tố do một số vi sinh vật không mongmuốn Vì vậy, muốn đưa nước chấm vào sản xuất công nghiệp, điều kiện trước tiênlà phải có giống thuần khiết vì nó quyết định hương vị, hiệu suất và chất lượng sảnphẩm và là điều kiện cơ bản để ổn định sản xuất, không bị động cho sản xuất

BẢNG 2.9: Các loài vi sinh vật dùng trong sản xuất nước tương ở các nước

[13]

STT Tên quốc gia Tên gọi loại nước

tương

Vi sinh vật sử dụng

Bacillus subtilis Bacillus pumillus Bacillus citreus Sarcina maxima Saccharomyces rouxii

Kecap manis

Rhizopus oligoporus Rhizopus oryzae Aspergillus oryzae

Pediococcus halophilus Pediococcus soyae Bacillus sp Bacillus licheniformis

Pichia sp Candida sp

4 Trung Quốc Si yau Aspergillus oryzae

Aspergillus sojae Aspergillus terriol

5 Việt Nam Xì dầu, nước tương Aspergillus oryzae

Hasinula anomala Hasinula sugelliculosa Lactobacillus delbrueckii

Sacchrosemyces sp Lactobacillus sp

Staphilococcus sp Bacillus sp Aspergillus oryzae

Saichikomi shoyuShiro shoyuTamari shoyuUsukuchi shoyu

Aspergillus oryzae Zygosaccharomyces rouxii Candida versatilis Candida etchellsii Lactobacillus delbrueckii Pediococcus halophilus Streptococcus faecalis Bacillus sp Saccharomyces halomebransis

Tương tự Koikuchi shoyuTương tự Koikuchi shoyuTương tự Koikuchi shoyuTương tự Koikuchi shoyu

 Giống đưa vào sản xuất phải có các điều kiện sau:

o Hoạt lực protease cao

o Ảnh hưởng tốt đối với hương của sản phẩm

o Khả năng phát triển mạnh và chống tạp khuẩn tốt

o Không sinh độc tố (Aflatoxin) Aflatoxin là độc tố gây bệnh ung thư,

được sinh ra bởi Asp parasiticus NRRL 2999 Độc tố này rất bền trong suốt quá trình lên men nước tương Asp oryzae, mặc dù không sinh độc tố này nhưng khó có thể phân biệt được Asp oryzae với Asp flavus hay Asp parasiticus vì chúng đều phân bố rộng rãi và dễ phát

triển trong canh trường lên men không thuần khiết

Trong khuôn khổ của luận văn này, chúng tôi chỉ giới thiệu đặc tính của loài

vi sinh vật phổ biến trong sản xuất nước tương là nấm mốc Asp oryzae có màu vàng nên ta thường gọi là mốc vàng

 Giới thiệu về loài Aspergillus oryzae:

o Đặc điểm hình thái của Aspergillus oryzae

Đặc điểm nhận diện khuẩn lạc Aspergillus oryzae: khuẩn lạc phát triển rất

nhanh, có màu sắc thay đổi từ màu vàng lục nhạt, màu vàng ô liu đến màu xanhlục, một vài dạng có màu nâu tối tùy theo tuổi và cuối cùng là màu vàng nâu Cáckhuẩn ty lúc mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu xanh lợt lẫn ít

bào tử Mới đầu, bào tử hình elip, rồi thay đổi dần dần đến hình cầu, nhẵn hoặc xù

xì không đều

Quan sát dưới kính hiển vi ta thấy, đầu của bào tử đính tỏa ra, đường kính150-300 m Chân cuống bào tử đính trong suốt, dài 4-5mm Túi đính có dạng bầudục hay bán bầu dục, ít khi có hình cầu, có đường kính 75 m Các bào tử đính códạng cầu hoặc hình oval có tia, kích thước không giống nhau dù được cấy trong mộtmôi trường Bào tử dài hình chuỗi đơn hoặc kép gồm có 2 hàng nằm chồng lênnhau

o Điều kiện sinh trưởng của Asperillus oryzae [2]:

Môi trường có độ ẩm 45% là điều kiện thích hợp nhất cho sự hình thành bàotử để làm giống, còn độ ẩm thích hợp để sinh tổng hợp enzym là 55-60% pH môitrường là 5,5-5,6 Độ ẩm của không khí là 85-95%

Asperillus oryzae là loại nấm hoàn toàn hiếu khí, khi có đủ oxi thì phát triển

rất mạnh Theo thực tế sản xuất, 1kg môi trường khi nuôi cấy mốc trung bình cần từ1,7-1,9 m3 không khí (áp suất 1atm, nhiệt độ nuôi cấy từ 27-300C)

Thời gian: Khi nuôi mốc làm giống, đòi hỏi thời gian 60-70 giờ, lúc đó bào tửmới hình thành đầy đủ, còn nuôi mốc để có enzym amylase cực đại là 30-36 giờ,protease cực đại là 36-42 giờ, một số chủng của loại này cho 2 enzym cực đại là 30và 60 giờ

Loài nấm mốc Asperillus oryzae cho ra 3 loại enzym chính là amylase,

protease và các enzym oxy hóa khử như glucooxydase

2.3.5 Hệ enzyme trong sản xuất nước tương lên men

Nấm mốc Asp oryzae có khả năng sản xuất ra một hệ enzym rất phức tạp Tuy nhiên, không phải tất cả các chủng thuộc loài Asp oryzae đều có khả năng

sinh tổng hợp một phức hệ enzym như nhau Vì vậy, để có được chủng thích hợpứng dụng cho từng mục đích sản xuất là cả một vấn đề khó khăn, phức tạp và lâudài Đối với sản xuất nước tương thì protease và amylase là hai enzym đóng vai tròquan trọng nhất

2.3.5.1 Cơ chế sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật [1, 6, 10]

Sản xuất enzym là một dạng đặc biệt của sản xuất protein Tổng hợp cácenzym ngoại bào phụ thuộc rất nhiều vào cơ chất Tuy nhiên, cơ chế của sự tiếtenzym này còn chưa được nghiên cứu chi tiết.

Vi sinh vật có khả năng tự “chế biến” chất dinh dưỡng cho mình nhờ hệenzym của chính chúng Tuy nhiên, trong môi trường không phải lúc nào cũng cósẵn các chất dinh dưỡng dễ tiêu hóa, còn rất nhiều loại chất mà vi sinh vật phải tựbiến đổi để chúng chuyển thành những chất có kích thước nhỏ hơn hoặc những chấtcó cấu tạo phân tử nhỏ hơn, dễ dàng đi qua màng tế bào để hấp thu Để làm đượcđiều này thì vi sinh vật phải tự tổng hợp các enzym ở trong tế bào và sau đó, cácenzym này phải ra khỏi tế bào và thực hiện các phản ứng phân giải ngoài tế bào.Các enzym được tổng hợp trong tế bào và thực hiện phản ứng ngoài tế bào đượcgọi là enzym ngoại bào

Quá trình dị hóa ngoài tế bào vi sinh vật xảy ra trong trường hợp cơ chất cókích thước lớn Muốn tiêu hóa được cơ chất này, vi sinh vật phải phân hủy chúngthành các chất có kích thước nhỏ hơn, đủ để có thể xâm nhập được vào trong tếbào thông qua thành và màng tế bào Như vậy, khi có mặt của cơ chất, tế bào sẽtổng hợp enzym tương ứng Cơ chế này gọi là cơ chế cảm ứng

Cơ chế cảm ứng chỉ có thể xảy ra khi có mặt của cơ chất Khi đó, chính cơchất làm chất kích thích để tạo ra enzym tương ứng, thực hiện các phản ứng phângiải Cơ chế này xảy ra thường xuyên ở vi sinh vật Cơ chế cảm ứng ít khi hoặckhông xảy ra ở các tế bào sinh vật đa bào Chất kích thích quá trình sinh tổng hợpenzym gọi là chất cảm ứng Enzym được tạo ra từ cơ chế này được gọi là enzymcảm ứng Cơ chế cảm ứng có ý nghĩa rất lớn trong quá trình phát triển của vi sinhvật vì đặc điểm tự “chế biến” chất dinh dưỡng ở vi sinh vật gắn liền với sự tạothành của enzym cảm ứng Protease và amylase là hai enzym cảm ứng được tạo ra

bởi Asp oryzae trong sản xuất nước tương lên men.

Ngược lại với quá trình sinh tổng hợp cảm ứng enzym chính là hiện tượng kìmhãm tổng hợp cảm ứng enzym Hiện tượng này xảy ra khi những sản phẩm cuốicủa quá trình chuyển hóa tăng tới mức quá thừa thì chính sản phẩm này kìm hãmsự tổng hợp enzym cảm ứng Chất kìm hãm tác động vào hệ gen tổng hợp các

enzym của quá trình phản ứng, làm ngưng sản xuất toàn bộ các enzym của quátrình.

2.3.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp enzym [1, 6,

10]

Asp oryzae có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, nhưng trong

sản xuất nước tương sử dụng chủ yếu là amylase và protease Đây là loại nấm mốccó khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào mạnh mẽ nhất Tuy nhiên, lượngprotease được sinh tổng hợp còn phụ thuộc vào chủng vi sinh vật, thành phần môitrường, điều kiện nuôi cấy và thời gian nuôi cấy

 Tuyển lựa và chọn giống các chủng vi sinh vật có hoạt lực enzym cao: Không phải tất cả mọi vi sinh vật đều có khả năng sinh tổng hợp enzym nhưnhau Ngay cả những chủng cùng giống, cùng loài cũng có thể khác nhau về lượngenzym do chúng sản sinh ra Vì vậy, việc tuyển chọn vi sinh vật tạo enzym nhiềukhi cần phải luôn luôn kết hợp chặt chẽ với sự kiểm tra hoạt lực của hàng chục,hàng trăm chủng vi sinh vật để tìm ra chủng có khả năng sinh tổng hợp enzym đãcho cao nhất

 Thành phần môi trường dinh dưỡng:

Chúng ta có thể điều khiển sinh tổng hợp enzym cần thiết bằng cách chọnmôi trường dinh dưỡng có thành phần định tính và định lượng phù hợp nhất

o Nguồn carbon: Nguồn carbon dùng nuôi cấy vi sinh vật là các

glucide: monosaccharide, disaccharide và tinh bột Trong đó, fructose,saccharose, maltose là nguồn carbon tốt nhất để sinh tổng hợpprotease Tinh bột cũng là nguồn carbon tốt đối với một số chủng visinh vật nhất định Ngoài glucide, ta cũng có thể dùng các nguồn

carbon khác như: dầu mỡ, acid hữu cơ, rượu… Đối với Asp oryzae, các

nguồn carbon có tác dụng tốt đến sinh tổng hợp protease được sắp xếptheo thứ tự giảm dần như sau: fructose, saccharose, maltose, glucose,arabinose, galactose, lactose

o Nguồn nitơ:

 Các chất dùng làm nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy vi sinh vậtcó thể là các chất hữu cơ (protein và các sản phẩm thủy phân củachúng) hoặc các muối vô cơ (muối amon, nitrat) Nước chiết ngô, bộtđậu nành, bột mì, dịch thủy phân, casein… rất giàu các hợp chất N

 Các nguồn N hữu cơ với hàm lượng acid amin tự do tương đối thấpthường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease vìchúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này Hàm lượng Ntrong môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh tổng hợpprotease

 Ngoài ra, để đảm bảo tổng hợp được nhiều protease, ta chọn tỉ lệ C:Nthích hợp Theo một số nhà khoa học thì khi hàm lượng C tăng quánồng độ tối thích thì không ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợpprotease Tuy nhiên, nếu tăng lượng N quá nồng độ thích hợp sẽ kìmhãm quá trình sinh tổng hợp protease [6] Trong sản xuất protease,người ta có thể dùng một số cơ chất tự nhiên làm nguồn C, nguồn Nvà những nguyên tố khoáng như bột mì đen, bột đậu nành, cám mì,cám ngô…

 Tỉ lệ C:N thích hợp để tổng hợp protease đối với Asp oryzae là từ

8:1-2:1

o Chất cảm ứng: Trong trường hợp nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp

protease, môi trường cần phải có chất cảm ứng là các nguồn N hữu

cơ Nhiều loài nấm mốc khác nhau như Asp oryzae, Asp awamori, Asp niger, Asp flavus… trên môi trường có các nguồn N hữu cơ, sinh

tổng hợp protease có hoạt lực rất cao Nhiều nghiên cứu cho thấy, quátrình sinh tổng hợp protease diễn ra mạnh mẽ trên môi trường chứacám mì, bột đậu tương đã tách béo và một ít nguồn N vô cơ

 Điều kiện nuôi cấy:

o Nhiệt độ: Mỗi loài vi sinh vật thường có một nhiệt độ tối thích cho quá

trình sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp protease Những nghiên cứumới đây cho thấy, đa số các loài nấm mốc phát triển thích hợp trong

khoảng nhiệt độ 22-32oC Nếu nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn sẽ kìmhãm quá trình phát triển và tổng hợp protease Nhiệt độ cao, cácenzyme bị biến tính do enzyme có bản chất là protein Nhưng điềukiện này còn phụ thuộc vào loại enzyme mà vi sinh vật tổng hợp

o Độ ẩm môi trường: Có ảnh hưởng đáng kể đến sinh trưởng và sinh

tổng hợp protease khi nuôi cấy nấm mốc bằng phương pháp bề mặt.Thông thường, độ ẩm thích hợp cho đa số các loài nấm mốc phát triểntrên khay hở là từ 58-60% Nếu độ ẩm quá cao, ta khó thông khí môitrường, còn nếu quá thấp thì môi trường sẽ khô nhanh, nấm mốc sinhbào tử mạnh và làm giảm hoạt tính protease tạo thành Trong quátrình nuôi cấy, ta nên giữ độ ẩm môi trường ổn định bằng cách duy trìđộ ẩm của không khí được nạp qua môi trường với mục đích cung cấpoxy cho nấm mốc phát triển

o Thời gian nuôi cấy: Thông thường, lượng enzyme được sinh tổng hợp

nhiều nhất trong môi trường khi nấm mốc chuẩn bị sinh bào tử Thờigian nuôi cấy còn phụ thuộc vào từng chủng nấm mốc và các điềukiện nuôi cấy nấm mốc

o Độ thoáng khí: Các loài nấm mốc là những vi sinh vật hiếu khí nên độ

thoáng khí của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến quá trình sinhtổng hợp protease Thông thường, để làm tăng độ thoáng khí trongmôi trường, người ta thường thổi không khí vô trùng qua canh trườnghoặc qua bộ phận khuấy đảo Tốc độ đảo trộn càng lớn thì môi trườngbão hòa oxy nhiều hơn Độ thoáng khí có thể đánh giá dựa vào lượngoxy hòa tan trong môi trường

o pH của môi trường: Theo một số nghiên cứu, pH môi trường ảnh

hưởng đến tỉ lệ các protease được tổng hợp nên Do đó, nếu giữ cho

pH luôn có một giá trị ổn định trong suốt quá trình nuôi cấy, vi sinhvật sẽ có khuynh hướng sinh tổng hợp một dạng protease xác định Vìvậy, loại protease này sẽ chiếm ưu thế trong môi trường Khi dùngphương pháp bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng

hợp enzym của vi sinh vật vì pH hầu như không đổi trong suốt quátrình phát triển của vi sinh vật Trong khi theo phương pháp bề sâu,

pH ảnh hưởng rất lớn, nhiều khi đóng vai trò quyết định đến sự tíchlũy protease [6, 10]

2.3.5.3 Kỹ thuật nuôi cấy bề mặt

Môi trường được trải đều ra các khay với chiều dày 2-3 cm và tiến hành trộngiống vi sinh vật vào khối môi trường sao cho thật đều Giống vi sinh vật thườngđược nuôi cấy riêng ở phòng thí nghiệm hay các phân xưởng nhân giống hoặc làcác giống thương phẩm Các loại giống này thường chứa nhiều bào tử Khi cấy vàomôi trường dinh dưỡng, chúng sẽ phát triển thành tế bào vi sinh vật và tạo ra cácloại enzym mà ta mong muốn

Sau khi trộn giống, các khay chứa môi trường sẽ được đưa vào phòng nuôicấy, đặt trên các giá đỡ Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khíđược lưu thông thường xuyên Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độvà độ ẩm không khí

Nhiệt độ thích hợp cho đại đa số nấm sợi là 28-32oC Nhiệt độ thấp quá hoặccao quá đều không có lợi cho sự phát triển của nấm sợi

Thời gian nuôi nấm sợi để thu nhận enzym vào khoảng 36-60 giờ Điều nàycòn phụ thuộc vào giống vi sinh vật và vào điều kiện môi trường cũng như phụthuộc vào điều kiện nuôi cấy

Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằngphương pháp bề mặt có thể trải qua các giai đoạn sau:

 Giai đoạn 1:

Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy Ở giai đoạnnày có những thay đổi sau:

o Nhiệt độ tăng rất chậm

o Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc trắng sữa

o Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi

o Khối môi trường còn rời rạc

o Enzym mới bắt đầu hình thành

o Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt Tuyệtđối không được đưa nhiệt độ cao quá 30oC vì thời kỳ đầu này, giốngrất mẫn cảm với nhiệt độ

o Môi trường được kết lại khá chặt

o Độ ẩm môi trường giảm dần

o Nhiệt độ sẽ tăng nhanh, có thể lên tới 40-45oC

o Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hóa mạnh củanấm sợi

o Các loại enzym được hình thành và enzym nào có cơ chất cảm ứngtrội hơn sẽ được tạo thành nhiều hơn

o Lượng oxy trong không khí giảm và lượng CO2 sẽ tăng dần, do đótrong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cốgắng duy trì trong khoảng 29-30oC là tốt nhất

 Giai đoạn 3:

Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ Ở giai đoạn này có một số thay đổi

cơ bản như sau:

o Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó, mức độ giảm chất dinhdưỡng sẽ chậm lại

o Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khímôi trường xuống còn 20-25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôicấy/1giờ Nhiệt độ nuôi duy trì ở 30oC

o Trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều, do đó lượngenzym sẽ giảm Chính vì thế, việc xác định thời điểm để thu nhậnenzym là rất cần thiết

2.3.5.4 Enzym protease

 Khái niệm:

Enzyme protease hay peptid hydrolase, là một chất xúc tác sinh học có bảnchất là protein Nó xúc tác cho quá trình thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-)trong phân tử protein và các polypeptid Sản phẩm của quá trình thủy phân có thểlà các acid amin, các peptide, các polypeptide chuỗi ngắn…

 Phân loại protease:

Protease là tên gọi chung một nhóm bao gồm nhiều enzyme khác nhau Hiệnnay, trên thế giới có rất nhiều phương pháp phân loại protease

o Theo pH xúc tác:

Dựa vào mức độ hoạt động trong dung dịch có giá trị pH khác nhau màenzyme protease được chia làm ba loại:

 Protease acid: Loại protease này thường được thu nhận từ các loài

nấm mốc như: Asp niger, Asp awamori, Asp saitoi, Asp shirousami.

pHopt = 2.5-3 Hầu hết được sử dụng trong chế biến các sản phẩm từthịt

 Protease trung tính: Loại này có thể thu nhận từ rất nhiều loại nấm

mốc khác nhau như: Asp oryzae, Asp flavus, Asp fumigatus, Asp terricola Protease trung tính thường có pHopt : 6-7.5 và được sử dụngtrong công nghiệp thực phẩm

 Protease kiềm: Loại protease kiềm này thường được thu nhận từ các

loài nấm mốc như: Asp oryzae, Asp sojae, Asp flavus Protease kiềm

có pHopt = 8-11 Các loại protease kiềm được ứng dụng trong sản xuấtbột giặt.

o Theo vị trí xúc tác trong phân tử protein:

Dựa trên cơ chế tác dụng của protease lên cơ chất, người ta phân loại enzymethành hai nhóm lớn: Exopeptidase (còn gọi là peptidase) và Endopeptidase Trongđó, exopeptidase tham gia xúc tác thủy phân liên kết peptide từ đầu mút của phântử protein Nếu phân cắt ở gốc amino hoặc carboxyl tự do thì gọi là enzymeaminopeptidase hay carboxypeptidase Endopeptidase (còn gọi là protease) xúc tácphản ứng thủy phân liên kết peptide nằm ở giữa mạch phân tử protein

Phương pháp phân loại này rất tổng quát, nên chỉ mang tính chất định tính sơbộ ban đầu

2.3.5.5 Enzym amylase

 Định nghĩa và phân loại:

Amylase là nhóm enzym thủy phân tinh bột, glycogen, dextrin Sản phẩm củaquá trình thủy phân là maltose, glucose, dextrin có phân tử lượng nhỏ

o -amylase: (EC :3.2.1.1)

Thủy phân liên kết -(1-4) glucoside bên trong chuỗi amylose và amylopectin

ở bất kỳ vị trí nào để tạo ra hỗn hợp các mono và oligosaccharide như glucose,maltose Phản ứng này dừng lại khi gặp liên kết -(1-6) tại điểm phân nhánh Đặc tính của -amylase của Aspergillus oryzae:

 pH hoạt động là 4-7

 Nhiệt độ tối ưu là 55-60oC

o Glucose amylase (EC : 3.2.1.3)

Đây là exo-enzym, thủy phân tinh bột, glycogen, polysaccharide ở các mốiliên kết  -(1-4) và  -(1-6) glucoside từ đầu không khử thành các dextrin có phântử lượng thấp và cuối cùng tạo thành glucose

Đặc tính của Glucoamylase của Asp.Oryzae:

 Glucoamylase (pH tối ưu 4.8, nhiệt độ tối ưu: 50oC)

CHƯƠNG 3 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.Nguyên liệu 3.1.1 Khô lạc

HÌNH 3.5: Bánh dầu lạc

HÌNH 3.6: Khô lạc sau nghiền

Trong luận văn này, khô lạc được sử dụng làm nguyên liệu chính để sản xuấtnước tương lên men Khô lạc được nhập khẩu từ Ấn Độ và được ép thành các bánhkhô dầu nặng khoảng 1kg

Loài nấm mốc Aspergillus oryzae sử dụng trong luận văn do Phòng thí nghiệm

Công nghệ thực phẩm 2, thuộc Bộ môn Công nghệ Thực phẩm cung cấp Nấm mốcđược bảo quản theo phương pháp cấy chuyền định kỳ Thời gian giữa 2 lần cấychuyền liên tiếp là 3 tháng

3.2.Hóa chất sử dụng

Các hóa chất đã sử dụng trong nghiên cứu gồm: KOH, NaOH, KH2PO4,

Na2HPO4, phenolphthalein, ninhydrin, KIO3, cồn 96o… có xuất xứ từ Trung Quốc

3.3.Dụng cụ và thiết bị 3.3.1 Dụng cụ

Các dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm pipet, erlen, buret, becher,ống đong, bình định mức, ống nghiệm, đĩa petri, cốc sứ, đũa thủy tinh, que cấy, phễuthủy tinh… Và một số dụng cụ khác

3.3.2 Thiết bị

Các thiết bị đã được sử dụng trong nghiên cứu thuộc phòng thí nghiệm Côngnghệ thực phẩm 2 và phòng thí nghiệm Hóa Sinh, Trường Đại học Bách Khoa TP HồChí Minh, bao gồm:

Khay nuôi mốc

Máy ly tâm hiệu MIKRO 22R

Máy đo pH hiệu CONSORT C830

Tủ sấy hiệu ECOCELL 111, hãng MEMMERT

Máy khuấy từ hiệu PLABINCO

Bếp điều nhiệt hãng MEMMERT

Máy lắc điều nhiệt hãng GERHARDT

Tủ lạnh

Cân điện tử, cân thường

Máy đo màu quang phố UV-VIS

Máy cất đạm hãng GERHARDT

Nồi hấp tiệt trùng

Máy đo ẩm hồng ngoại

3.4.Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Nội dung nghiên cứu

Sơ đồ quá trình nghiên cứu

3.4.2 Phương pháp nghiên cứu

3.4.2.1 Khảo sát thành phần của khô lạc

 Xử lý mẫu trước phân tích

Bánh dầu lạc trước khi sử dụng cần phải được đập nhỏ và đem nghiền nhỏ tớikích thước khoảng 1mm

 Khảo sát các thành phần của khô lạc bao gồm:

Khảo sát thành phần của nguyên liệu

Xác định tỉ lệ phối trộn nguyên liệu, tỷ lệ mốc cấy, độ ẩm

và thời gian thích hợp của quá trình nuôi mốc để hoạt tính

protease là cao nhất

Xác định tỉ lệ canh trường:nước muối, nồng độ muối, nhiệt

độ, pH và thời gian thích hợp của quá trình thủy phân

Xác định tỉ lệ bổ sung chế phẩm protease để thúc đẩy quá

trình thủy phân protein