Bước đầu nghiên cứu sản xuất nước tương lên men phần 3

Bước đầu nghiên cứu sản xuất nước tương lên men

CHƯƠNG 4KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Trong luận văn này, chúng tôi xin trình bày về một số kết quả có liên quan đến: Khảo sát thành phần của bánh dầu

 Khảo sát quá trình thủy phân protein bằng enzym từ canh trường nấm mốc Khảo sát quá trình thủy phân protein bằng enzym từ canh trường nấm mốc

kết hợp với bổ sung chế phẩm enzym protease

1.Khảo sát thành phần của nguyên liệu

1.1.Thành phần của khô lạc (bã đậu phộng)

Kết quả phân tích thành phần nguyên liệu khô lạc

Bảng 4.1.Kết quả phân tích thành phần khô lạc

(% tổng khối lượng)

Độ ẩm

Hàm lượng nitơ tổng Đạm tổng

Lipid thô Xơ thô TroTinh bột

Nguyên liệu chính dùng để sản xuất nước tương trong nghiên cứu này là khô lạc Khô lạc là sản phẩm phụ thu được từ quá trình ép dầu lạc từ các nhà máy sản xuất dầu, sau đó bã được ép thành bánh có hàm ẩm thấp để có thể bảo quản được lâu ở nhiệt độ phòng

Từ thành phần bã đậu phộng, ta có thể tận dụng các chất dinh dưỡng còn sót lại trong bã đậu phộng để sản xuất nước tương một cách hiệu quả

So sánh với thành phần khô lạc [2] ta thấy:

Bảng 4.2.Thành phần của khô lạc [2]

Thành phầnCả vỏKhô lạcNhân

Xô thoâ % 24.4 4.8

So sánh thành phần khô lạc trong nghiên cứu của chúng tôi với khô lạc chứa cả vỏ theo tác giả Nguyễn Văn Dậu [2], ta thấy khô lạc trong nghiên cứu của chúng tôi có hàm ẩm, hàm lượng protein cao hơn, hàm lượng béo thô thấp hơn và hàm lượng xơ thì gần bằng nhau Điều này có thể là do khô lạc của chúng tôi được nhập từ Ấn Độ, do công nghệ sản xuất tiên tiến nên đã trích ly được nhiều lipid có trong hạt lạc, còn nguyên liệu của tác giả là sản phẩm của quy trình ép dầu lạc trong nước, nên hàm lượng lipid còn sót lại trong bã cao Ngoài ra thành phần hoá học của lạc hạt có thể thay đổi phụ thuộc vào giống, vào sự biến động của các điều kiện khí hậu, vào vị trí hạt ở quả, các yếu tố không bình thường như sâu, bệnh cũng ảnh hưởng đến thành phần hoá học của cây lạc, từ đó ảnh hưởng tới thành phần của khô lạc

1.2.Thành phần của bột mì

Bảng 4.3 Thành phần của bột mì

Thành phầnHàm lượng (%)

Tinh bột 80.16

Độ ẩm của bột mì và khô lạc gần bằng nhau Hàm lượng đạm tổng của bột mì thấp hơn, nhưng hàm lượng tinh bột lại cao Do đó, khi bổ sung bột mì càng nhiều thì hàm lượng tinh bột trong hỗn hợp nguyên liệu sẽ tăng lên càng nhiều, nhưng hàm lượng đạm tổng thì càng giảm.

2.Khảo sát quá trình thuỷ phân protein bằng enzym của nấm mốc

Quá trình thủy phân là quá trình quan trọng quyết định chất lượng của nước tương thành phẩm sau này Nếu quá trình thủy phân tốt thì lượng acid amin thu được trong dịch thủy phân sẽ nhiều và đạt hiệu quả kinh tế cao Ngược lại, nếu quá trình thủy phân không tốt thì dịch thủy phân thu được chứa hàm lượng acid amin thấp, chất lượng kém không đạt yêu cầu.

Để cho quá trình thủy phân protein trong môi trường diễn ra tốt nhất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân Chúng tôi khảo sát từng yếu tố một, cố định các yếu tố còn lại Sử dụng giá trị tối ưu có được của thí nghiệm trước làm giá trị cố định cho thí nghiệm sau để khảo sát sát các yếu tố còn lại

Trong nghiên cứu này, chúng tôi lần lượt khảo sát các điều kiện công nghệ ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bao gồm: tỉ lệ canh trường và dung môi, nồng độ muối, pH, nhiệt độ và thời gian thủy phân để lượng acid amin thu được trong dịch thủy phân là cao nhất

Kết quả thủy phân protein được chúng tôi đánh giá thông qua 3 thông số bao gồm: hàm lượng N tổng, hàm lượng N amin và hàm lượng N ammoniac có trong một lít dịch thủy phân thu được Trong đó

- N tổng là tổng hợp các chất chứa nitơ ở dạng vô cơ và hữu cơ có trong sản phẩm N tổng bao gồm cả N amin tự do, N ammoniac, các chuỗi polypeptid hay protein chưa bị thủy phân Hàm lượng N tổng cao là tốt chỉ khi hàm lượng N amin tự do cũng cao

- N amin tự do là thành phần dễ tiêu hóa, dễ hấp thu, có giá trị dinh dưỡng cao nên mong muốn càng nhiều càng tốt

- N ammoniac là dạng N tạo thành do sự phân huỷ protein, chúng tồn tại ở dạng muối vô cơ là muối ammonium hay những amin dễ bay hơi Loại N này không có giá trị dinh dưỡng và làm giảm phẩm chất của sản phẩm thực phẩm chứa nó

2.1.Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ giữa canh trường và dung môi

Điều kiện thí nghiệm như sau:

Trong quá trình nuôi cấy nấm mốc

Tỉ lệ nguyên liệu (bánh dầu:bột mì) = 90:10 (w/w)Độ ẩm nguyên liệu: 60%

Tỉ lệ mốc cấy: 7% (v/w)

Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòngThời gian nuôi cấy: 44 giờ

Trong quá trình thủy phân

Tỷ lệ canh trường : dung môi (w/v) là 1:2, 1:3, 1:4 Nồng độ nước muối: 16% (w/v)

pH: 6.5

Nhiệt độ thủy phân: 50oCThời gian thủy phân: 3 ngàyChúng tôi đã thu được kết quả như sau

Bảng 4.4.Kết quả hàm lượng N tổng, N amin tự do và N ammoniac trung bình ở các nghiệm thức có tỷ lệ canh trường : dung môi khác nhau

Tỷ lệ canh trường:

dung môi

(g/100g nguyên liệu khô)

(g/100g nguy

ên liệu khô)

(g/100g nguy

ên liệu khô)

1:4 2.84c 1.62a 2.76c 1.58b 0.97b 0.55a

Chú thích: “a, b, c, d…”: kí tự giống nhau trong cùng một cột thì các giá trị khác biệt không có ý nghĩa, kí tự khác nhau trong cùng một cột thì các giá trị khác biệt có ý nghĩa với P<0,05

Từ kết quả trên ta có đồ thị sau

Hình 4.1.Ảnh hưởng của tỉ lệ canh trường: dung môi đến quá trình thủy phân protein trong sản xuất nước tương

Từ hình 4.1, ta thấy:

− Hàm lượng N amin tự do tính trên 100g nguyên liệu khô thu được trong dịch thủy phân tăng dần khi thay đổi tỷ lệ canh trường: dung môi từ 1:2 đến 1:4 Kết quả thu được ở 2 nghiệm thức với tỷ lệ canh trường: dung môi là 1:2 và 1:3 khác nhau không có nghĩa Tương tự, kết quả thu được ở 2 nghiệm thức với tỷ lệ canh trường: dung môi là 1:3 và 1:4 cũng khác nhau không có nghĩa Còn nếu tính hàm lượng N amin tự do có trong một lít dung dịch thì nghiệm thức với tỷ lệ canh trường: dung môi là 1:2 sẽ cho kết quả cao nhất Khi tăng hàm lượng dung môi sử dụng thì hàm lượng N amin tự do có trong một lít dịch thủy phân sẽ giảm dần và giá trị thu được ở cả 3 nghiệm thức khảo sát đều khác nhau có nghĩa

− Trong khi đó, hàm lượng N tổng và N ammoniac tính trên 100g nguyên liệu khô ở cả 3 nghiệm thức đều khác nhau không có nghĩa

Vì vậy để thu được dịch thủy phân có hàm lượng N amin tự do cao ta chọn tỷ lệ canh trường: dung môi 1:2 là tỷ lệ thích hợp.

Khi dung môi ít thì sự thủy phân protein xảy ra kém, nhưng khi lượng dung môi sử dụng quá cao thì hàm lượng đạm tổng và đạm amin tự do tính trên một lít dung dịch thu được sẽ thấp, không đạt yêu cầu trong sản xuất nước tương có hàm lượng đạm cao.

Theo Takeshi Akao [26] thì lượng nước cần bổ sung trong giai đoạn thủy phân protein để sản xuất nước tương sẽ cao hơn từ 1 -3 lần so với khối lượng nguyên liệu sử dụng, điều này phù hợp với kết quả thu được của chúng tôi Vậy ta chọn tỷ lệ canh trường: dung môi là 1:2

2.2.Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối trong dung dịch nước muối

Muối ăn NaCl có thể ức chế hoạt tính enzym protease [24] Để enzyme protease có khả năng xúc tác quá trình thủy phân protein đạt hiệu quả cao thì việc khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối tới quá trình thủy phân là cần thiết.

Điều kiện thí nghiệm như sau:

Trong quá trình nuôi cấy nấm mốc

Tỉ lệ nguyên liệu (bánh dầu:bột mì) = 90:10 (w/w)Độ ẩm nguyên liệu: 60%

Tỉ lệ mốc cấy: 7% (v/w)

Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòngThời gian nuôi cấy: 44 giờ

Trong quá trình thủy phân

Tỉ lệ canh trường: dung môi là 1:2

Nồng độ nước muối: 0%, 4%, 10%, 16%, 22% (w/v)pH: 6.5

Nhiệt độ thủy phân: 50oCThời gian thủy phân: 3 ngàyChúng tôi đã thu được kết quả như sau

Bảng 4.5.Kết quả hàm lượng N tổng, N amin và N ammoniac trung bình của các nghiệm thức có nồng độ muối khác nhau (g/l)

Nồng độ muốiN tổng N amin tự do N ammoniac

Từ kết quả thu được ta tiến hành vẽ đồ thị như sau:

Hình 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối trong dung dịch nước muối đến quá trình thủy phân protein trong sản xuất nước tương

Từ hình 4.2 ta thấy:

Khi tăng nồng độ muối từ 0 đến 10% trong dung dịch nước muối thì hàm lượng N tổng và N amin tự do trong dịch thủy phân tăng và đạt cực đại khi nồng độ muối là 10% Nếu tiếp tục tăng nồng độ muối trong dung môi thì hàm lựong N tổng và N amin tự do sẽ giảm xuống Còn khi nồng độ muối trong dung môi càng tăng thì hàm lượng N ammoniac trong dịch thủy phân sẽ giảm nhẹ nhưng các giá trị khác biệt giữa các nghiệm thức là không lớn Ngoài ra trong quá trình khảo sát, ta thấy nồng độ muối thấp làm cho dung dịch rất dễ bị nhiễm vi sinh vật lạ, làm cho dung dịch nhớt, có mùi lạ và pH giảm nhanh Từ kết quả phân tích trên, ta chọn nồng độ muối 10% là thích hợp nhất

Kết quả như trên có thể giải thích là do ở nồng độ muối thấp, dung dịch thủy phân dễ dàng bị nhiễm vi sinh vật lạ Các vi sinh vật này sẽ sử dụng N amin và N tổng trong môi trường làm thức ăn cho chúng và xảy ra quá trình lên men thối làm cho hàm lượng N ammoniac cao, đồng thời hàm lượng amin thu được sẽ thấp

Nhưng ờ nồng độ muối cao thì hàm lượng N tổng, N amin thu được trong dịch thủy phân cũng thấp Nguyên nhân là do ở nồng độ muối cao thì hoạt tính protease giảm mạnh Đó là do các phân tử NaCl hòa tan sẽ tạo ra một giá trị lực ion trong dịch thủy phân Khi giá trị lực ion quá cao có thể làm thay đổi cấu hình không gian của phân tử protein enzym và làm giảm hoạt tính xúc tác của nó

Khi nồng độ muối quá lớn, thì khả năng hòa tan của enzym trong dung dịch sẽ giảm và enzym có thễ bị kết tủa, đó là do khi bổ sung NaCl vào thì sẽ xảy ra hiện tượng solvat hóa enzyme và phức chất enzym-cơ chất, quá trình này sẽ làm mất đi các phân tử nước bao quanh phân tử protein enzym Kết quả làm giảm khả năng hòa tan của enzym trong dung dịch và từ đó làm giảm khả năng xúc tác của nó, do đó quá trình thủy phân xảy ra không hiệu quả, sẽ làm giảm lượng nitơ hòa tan trong dung dịch

Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao sẽ tạo ra một áp suất thẩm thấu lớn làm co tế bào chất của vi sinh vật, nên dịch thủy phân ít bị nhiễm vi sinh vật lạ, và đạm thối sinh ra trong dịch thủy phân ít hơn so với nồng độ muối thấp.

Kết quả thí nghiệm cho thấy nồng độ muối xấp xỉ 10 % là thích hợp Chúng tôi chọn nồng độ muối này cho các thí nghiệm sau.

So sánh với một số nghiên cứu khác, ta thấy:

• Theo Catrinus van der Sluis [16], Tadanobu Nakadai [22] và T Hamada [23] trong sản xuất nước tương truyền thống của Nhật dịch thủy phân có nồng độ muối xấp xỉ khoảng khoảng 17% muối

• Theo Wilfred F M [24] nước tương truyền thống của Indonesia có bổ sung nuớc muối tiệt trùng với nồng độ 17.5% Sự hư hỏng của nước tương có liên quan tới nồng độ muối, khi nồng độ muối càng thấp thì vi sinh vật càng dễ phát triển làm pH trong dịch thủy phân giảm nhanh Ở nồng độ 10% NaCl pH của dịch thủy phân sẽ giảm và nhỏ hơn 5.0 sau 3 ngày, 20% NaCl pH của dịch thủy phân sẽ giảm và nhỏ hơn 5.0 sau 6 ngày

• Theo tác giả Runak Bairacharva [26] kết luận nồng độ muối thích hợp là từ 15 – 19%

Các nghiên cứu trên cho thấy, nồng độ muối trong dịch thủy phân thường là 17% - cao hơn giá trị 10% trong nghiên cứu của chúng tôi Điều này có thể giải thích là do nước tương truyền thống của Nhật hay Indonesia ngoài quá trình thủy phân bằng enzym của nấm mốc còn có quá trình lên men tạo hương bởi vi khuẩn

Tetragenococcus halophila và nấm men Zygosaccharomyces rouxii, Candida versatilis Trong quá trình thủy phân, enzym của Aspergillus oryzae thủy phân các cơ chất trong

môi trường tạo ra các acid amin và các loại đường Các sản phẩm này lại là thức ăn

cho Tetragenococcus halophila phát triển, đây là vi khuẩn sinh acid lactic, gram dương,

chịu mặn và kị khí tùy tiện Vi khuẩn này phát triển trong giai đoạn đầu và làm giảm pH từ 7 xuống dưới 5, lúc đó nó bị ức chế và lúc này nấm men bắt đầu phát triển, kết quả sinh ra ethanol và hàng loạt các hợp chất hương khác Vì vậy để quá trình lên men ủ hương được tốt, người ta thường bổ sung muối với nồng độ cao (để tránh nhiễm

vi sinh vật lạ và tạo điều kiện thích hợp cho Tetragenococcus halophila phát triển)

2.3.Khảo sát ảnh hưởng của pH thủy phân

pH môi trường thường có ảønh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzym Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến tốc độ phản ứng enzym Do đó, việc khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease là rất cần thiết để ứng dụng trong sản xuất

Điều kiện thí nghiệm như sau:

Trong quá trình nuôi cấy nấm mốc

Tỉ lệ nguyên liệu (bánh dầu:bột mì) = 90:10 (w/w)Độ ẩm nguyên liệu: 60%

Tỉ lệ mốc cấy: 7% (v/w)

Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòngThời gian nuôi cấy: 44 giờ

Trong quá trình thủy phân

Tỉ lệ canh trường: dung môi là 1:2 Nồng độ nước muối: 10% (w/v)pH: 5.5, 6.0, 6.5, 7.0

Nhiệt độ thủy phân: 50oCThời gian thủy phân: 3 ngàyChúng tôi đã thu được kết quả như sau

Bảng 4.6.Kết quả hàm lượng N tổng, N amin và N ammoniac trung bình của các nghiệm thức có pH khác nhau (g/l)

pHN tổng N amin tự do N ammoniac

7 6.98a 4.67b 2.47b

Chú thích: “a, b, c, d…”: kí tự giống nhau trong cùng một cột thì các giá trị khác biệt không có ý nghĩa, kí tự khác nhau trong cùng một cột thì các giá trị khác biệt có ý nghĩa với P<0,05

Hình 4.3.Ảnh hưởng của pH ban đầu của dịch thủy phân đến quá trình thủy phân protein trong sản xuất nước tương

Ảnh hưởng của pH đến N tổng: khi tăng pH dịch thủy phân tăng từ 5.5 đến 7.0 thì hàm lượng N tổng tăng dần và đạt cực đại ở pH 6.5 rồi sau đó giảm dần Ở pH 6.5 có N tổng khác nhau có ý nghĩa với giá trị ở các nghiệm thức có pH khác

Ảnh hưởng của pH đến N amin tự do: hàm lượng N amin tự do thay đổi theo quy luật tương tự N tổng, nhưng mức đổi biến đổi ít hơn

Ảnh hưởng của pH đến N ammoniac: khi tăng pH dịch thủy phân tăng từ 5.5 tới 7 thì hàm lượng N ammoniac thay đổi không nhiều.

Từ các kết quả trên ta thấy ở pH 6.5 dịch thủy phân có hàm lượng N tổng cao nhất trong khi đó hàm lượng N amin tự do và N ammoniac ở các nghiệm thức này thì không khác nhau nhiều so với các nghiệm thức khác, nên pH 6.5 là giá trị thích hợp cho quá trình thủy phân.

Các kết quả trên có thể được giải thích là phân tử enzym chứa các ion và các nhóm chức khác nhau Việc hình thành phức hợp enzym-cơ chất và phân ly phức hợp enzym-sản phẩm chỉ diễn ra ở một trạng thái ion hóa nhất định của phức hợp pH môi trường thay đổi sẽ làm ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất và enzym, từ đó ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng do enzym xúc tác Đa số enzym chỉ thể hiện hoạt tính xúc tác trong một giới hạn pH nhất định Ngoài ra, khi pH quá thấp hoặc quá cao sẽ tạo ra lực đẩy tĩnh điện giữa các nhóm bị ion hóa trong phân tử protein, dẫn đến các phân tử protein bị dãn mạch và biến tính.

Trong nghiên cứu này hoạt tính protease đạt cực đại ở pH 6.5 Điều này phù hợp với nhiều nghiên cứu trước đây, chế phẩm protease thu được từ canh trường nấm mốc

Aspergillus oryzae thì có pH tối ưu khoảng 6.0 – 7.5 [8]. Ngoài ra, theo tác giả Runak Bairacharva [26], pH trong giai đoạn đầu của quá trình thủy phân bằng enzym của

Aspergillus oryzae thích hợp trong khoảng từ 6.0 – 7.0 Kết quả này phù hợp với kết

quả nghiên cứu thu được của nhóm chúng tôi Như vậy chúng tôi chọn pH 6.5 cho các thí nghiệm tiếp theo

2.4.Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzym Tốc độ phản ứng enzym không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzym sẽ giảm Trong công nghệ sản xuất và bảo quản các sản phẩm thực phẩm, yếu tố nhiệt độ thường được sử dụng để điều hòa các phản ứng enzym theo chiều mong muốn Vì vậy việc nghiên cứu nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân bằng enzym là một vấn đề rất cần thiết

Điều kiện thí nghiệm như sau:

Trong quá trình nuôi cấy nấm mốc