Sau khi đã tiến hành khảo sát các yếu tố về tỉ lệ phối trộn nguyên liệu, độ ẩm mơi trường nuơi cấy, tỉ lệ mốc cấy thích hợp cho quá trình nuơi mốc sinh tổng hợp protease, chúng tơi tiến hành khảo sát và chọn thời gian thích hợp để protease sinh tổng hợp bởi Asp. oryzae cĩ hoạt tính cao nhất.
Điều kiện thí nghiệm được thực hiện như sau:
Các yếu tố cố định trong quá trình nuơi nấm mốc:
• Thành phần mơi trường (khơ lạc : bột mì) là 90:10 (w/w). • Độ ẩm mơi trường nuơi cấy: 60%
• Tỉ lệ mốc cấy: 0.035% (w bào tử /w mơi trường) • Nhiệt độ nuơi mốc: nhiệt độ phịng
Yếu tố thay đổi:
• Thời gian nuơi cấy thay đổi lần lượt là: 24h, 36h, 42h, 48h, 60h, 72h. Kết quả đo hoạt tính protease thu được như sau:
Thời gian nuơi cấy Hoạt tính protease tb (Đvhđ/g ctk) 0 giờ 0.00 24 giờ 1.96a 36 giờ 3.68b 42 giờ 4.25c 48 giờ 5.30d 60 giờ 3.56b 72 giờ 2.99e
Chú thích: “a, b, c, d…”: kí tự giống nhau thì các giá trị khác biệt khơng cĩ ý nghĩa, kí tự khác nhau thì các giá trị khác biệt cĩ ý nghĩa với P<0,05
Nhận thấy, hoạt tính protease đạt cực đại sau 48 giờ nuơi cấy. Chúng tơi tiếp tục thí nghiệm nuơi cấy nấm mốc với các khoảng thời gian nuơi cấy dao động xung quanh giá trị 48 giờ. Kết quả đo hoạt tính protease như sau:
BẢNG 4.19: Aûnh hưởng của thời gian nuơi cấy đến hoạt tính protease từ Asp. oryzae (lần 2)
Thời gian nuơi cấy Hoạt tính protease tb (Đvhđ/g ctk)
0 giờ 0.00 24 giờ 2.29a 42 giờ 3.57d 43 giờ 4.21e 44 giờ 4.50f 45 giờ 4.13e 46 giờ 3.82de 47 giờ 3.15c 48 giờ 3.10c 49 giờ 2.97bc 50 giờ 2.67ab 51 giờ 2.67ab 52 giờ 2.65ab 53 giờ 2.65ab 54 giờ 2.48a 60 giờ 2.37a
Chú thích: “a, b, c, d…”: kí tự giống nhau thì các giá trị khác biệt khơng cĩ ý nghĩa, kí tự khác nhau thì các giá trị khác biệt cĩ ý nghĩa với P<0,05
HÌNH 4.12: Quan hệ giữa thời gian nuơi cấy và hoạt tính protease (lần 2) HÌNH 4 .12 cho ta thấy sự thay đổi hoạt tính của enzym tuân theo quy luật như sau: trong khoảng thời gian đầu, hoạt độ protease tăng dần, đến một thời điểm, hoạt độ protease đạt cực đại và sau đĩ giảm dần. Điều này cĩ thể được giải thích như sau:
• Ban đầu, nấm mốc sử dụng các chất cĩ phân tử lượng thấp trong mơi trường để phát triển. Do đĩ, hoạt lực protease chỉ tồn tại ở dạng vết trong canh trường nuơi cấy.
• Do hàm lượng các chất dinh dưỡng cĩ phân tử lượng thấp trong mơi trường khơng nhiều nên giai đoạn tiếp theo, nấm mốc bắt buộc sinh tổng
hợp nhĩm enzym phân giải các chất dinh dưỡng cĩ phân tử lượng cao thành những phân tử lượng thấp, dễ hấp thu qua màng tế bào, trong đĩ cĩ enzym protease. Hoạt tính protease do nấm mốc tạo ra bắt đầu tăng dần và đạt cực đại.
• Nếu tiếp tục kéo dài thời gian nuơi cấy, hàm lượng các chất dinh dưỡng giảm dần, quá trình trao đổi chất của nấm mốc và mơi trường giảm do tế bào đã đến giai đoạn già. Mặt khác, các sản phẩm trao đổi chất trong mơi trường quá nhiều bắt đầu ức chế quá trình trao đổi chất của tế bào nên quá trình sinh tổng hợp enzym protease sẽ giảm dần. Ngồi ra, do là enzym thủy phân nên các phân tử protease cĩ thể thủy phân lẫn nhau, làm giảm hoạt tính protease. Như vậy, việc sinh tổng hợp enzym cảm ứng protease liên quan khá mật thiết với việc phân giải cơ chất dinh dưỡng và sinh trưởng và trao đổi chất của nấm mốc.
Những thay đổi quan sát được trong quá trình nuơi cấy nấm mốc diễn ra như sau: Trong khoảng 6-10 giờ đầu tiên, đây là giai
đoạn nấm mốc thích nghi với mơi trường nuơi cấy nên chưa tiến hành sinh sản. Enzym bắt đầu được tổng hợp ở giai đoạn này nhưng khơng đáng kể.
Trong khoảng 14-36 giờ tiếp theo, khuẩn ti xuất hiện rõ rệt, lúc này nguyên liệu hơi kết bánh. Hệ sợi nấm bắt đầu phát triển nhanh, màu trắng ngà, nhiệt độ mơi trường tăng lên khoảng 30-32oC.
Từ 36-48 giờ, nấm mốc bắt đầu sinh bào tử, hệ sợi chuyển dần từ màu trắng sang màu vàng nhạt. Lúc này là giai đoạn enzym
protease được hình thành chủ yếu và hoạt tính cao nhất.
Sau 48 giờ, hệ sợi chuyển dần từ màu vàng sang màu vàng lục. Nguồn cơ chất trong mơi trường cịn ít, quá trình trao đổi chất diễn ra yếu dần và cĩ thể kết thúc giai đoạn nuơi mốc để chuyển sang giai đoạn thủy phân.
Quan sát đồ thị, ta nhận thấy, tại thời điểm 44 giờ sau khi nuơi cấy, ta thu được giá trị hoạt tính protease là cao nhất và giá trị hoạt tính là khác nhau cĩ ý nghĩa so với các giá trị tại các thời điểm nuơi cấy khác. Như vậy, 44 giờ là thời gian thích hợp để nuơi cấy nấm mốc sinh protease cĩ hoạt tính cao nhất với các điều kiện thí nghiệm nêu trên.
Theo các tài liệu nghiên cứu về thời gian sinh trưởng của Asp.oryzae thì thời gian nuơi mốc để làm giống là 60-70 giờ vì lúc này bào tử mới hình thành đầy đủ, cịn để hình thành protease cực đại là trong khoảng 36-42giờ. Tùy thuộc vào hoạt lực của chủng nấm mốc đem nuơi cấy mà thời gian cĩ thể dài hay ngắn hơn [2]. Kết quả khảo sát thời gian nuơi cấy mốc thích hợp của chúng tơi là 44 giờ, tương tự như kết quả của những nghiên cứu trước đây.
Trong thực tế sản xuất nước tương lên men ở một số quốc gia trên thế giới, thời gian nuơi mốc được áp dụng như sau:
Nhật Bản: Đối với mơi trường nuơi cấy chứa (50-90%) hạt đậu nành hoặc khơ đậu nành và(10-50%) bột mì thì quá trình nuơi mốc được thực hiện trong khoảng 30 đến 50 giờ, nhiệt độ nuơi cấy là 20-40oC. Thơng thường, họ chọn 44 giờ làm thời gian nuơi cấy thích hợp (Bajracharya và cộng sự) [12].
Thái Lan: Sử dụng bào tử Asp.oryzae để nuơi cấy trên mơi trường hạt đậu nành và bột mì theo tỉ lệ 7:1. Thời gian nuơi cấy kéo dài 40- 48 giờ, tại nhiệt độ phịng [15].
Indonesia: Thời gian nuơi cấy mốc trên mơi trường 100% đậu nành kéo dài 3 ngày (72 giờ), ở nhiệt độ phịng [16]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nếu kéo dài thời gian nuơi cấy, nấm mốc sẽ chủ yếu hình thành bào tử và lượng enzym protease được sinh tổng hợp ra với hoạt tính thấp. Hơn nữa, thời gian nuơi cấy quá dài sẽ ảnh hưởng tới năng suất thiết bị và lợi nhuận kinh tế của nhà sản xuất. Như vậy, chọn thời điểm kết thúc thích hợp cho quá trình nuơi cấy nấm mốc là rất quan trọng.
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VAØ KIẾN NGHỊ