Nấm mốc Asp. oryzae cĩ khả năng sản xuất ra một hệ enzym rất phức tạp. Tuy nhiên, khơng phải tất cả các chủng thuộc lồi Asp. oryzae đều cĩ khả năng sinh tổng hợp một phức hệ enzym như nhau. Vì vậy, để cĩ được chủng thích hợp ứng dụng cho từng mục đích sản xuất là cả một vấn đề khĩ khăn, phức tạp và lâu dài. Đối với sản xuất nước tương thì protease và amylase là hai enzym đĩng vai trị quan trọng nhất.
2.3.5.1. Cơ chế sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật [1, 6, 10] Sản xuất enzym là một dạng đặc biệt của sản xuất protein. Tổng hợp các enzym ngoại bào phụ thuộc rất nhiều vào cơ chất. Tuy nhiên, cơ chế của sự tiết enzym này cịn chưa được nghiên cứu chi tiết.
Vi sinh vật cĩ khả năng tự “chế biến” chất dinh dưỡng cho mình nhờ hệ enzym của chính chúng. Tuy nhiên, trong mơi trường khơng phải lúc nào cũng cĩ sẵn các chất dinh dưỡng dễ tiêu hĩa, cịn rất nhiều loại chất mà vi sinh vật phải tự biến đổi để chúng chuyển thành những chất cĩ kích thước nhỏ hơn hoặc những chất cĩ cấu tạo phân tử nhỏ hơn, dễ dàng đi qua màng tế bào để hấp thu. Để làm được điều này thì vi sinh vật phải tự tổng hợp các enzym ở trong tế bào và sau đĩ, các enzym này phải ra khỏi tế bào và thực hiện các phản ứng phân giải ngồi tế bào. Các enzym được tổng hợp trong tế bào và thực hiện phản ứng ngồi tế bào được gọi là enzym ngoại bào.
Quá trình dị hĩa ngồi tế bào vi sinh vật xảy ra trong trường hợp cơ chất cĩ kích thước lớn. Muốn tiêu hĩa được cơ chất này, vi sinh vật phải phân hủy chúng thành các chất cĩ kích thước nhỏ hơn, đủ để cĩ thể xâm nhập được vào trong tế bào thơng qua thành và màng tế bào. Như vậy, khi cĩ mặt của cơ chất, tế bào sẽ tổng hợp enzym tương ứng. Cơ chế này gọi là cơ chế cảm ứng.
Cơ chế cảm ứng chỉ cĩ thể xảy ra khi cĩ mặt của cơ chất. Khi đĩ, chính cơ chất làm chất kích thích để tạo ra enzym tương ứng, thực hiện các phản ứng phân giải. Cơ chế này xảy ra thường xuyên ở vi sinh vật. Cơ chế cảm ứng ít khi hoặc khơng xảy ra ở các tế bào sinh vật đa bào. Chất kích thích quá trình sinh tổng hợp enzym gọi là chất cảm ứng. Enzym được tạo ra từ cơ chế này được gọi là enzym cảm ứng. Cơ chế cảm ứng cĩ ý nghĩa rất lớn trong quá trình phát triển của vi sinh vật vì đặc điểm tự “chế biến” chất dinh dưỡng ở vi sinh vật gắn liền với sự tạo thành của enzym cảm ứng. Protease và amylase là hai enzym cảm ứng được tạo ra bởi Asp. oryzae trong sản xuất nước tương lên men.
Ngược lại với quá trình sinh tổng hợp cảm ứng enzym chính là hiện tượng kìm hãm tổng hợp cảm ứng enzym. Hiện tượng này xảy ra khi những sản phẩm cuối của quá trình chuyển hĩa tăng tới mức quá thừa thì chính sản phẩm này kìm hãm
sự tổng hợp enzym cảm ứng. Chất kìm hãm tác động vào hệ gen tổng hợp các enzym của quá trình phản ứng, làm ngưng sản xuất tồn bộ các enzym của quá trình.
2.3.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp enzym [1, 6, 10]
Asp. oryzae cĩ thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, nhưng trong sản xuất nước tương sử dụng chủ yếu là amylase và protease. Đây là loại nấm mốc cĩ khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào mạnh mẽ nhất. Tuy nhiên, lượng protease được sinh tổng hợp cịn phụ thuộc vào chủng vi sinh vật, thành phần mơi trường, điều kiện nuơi cấy và thời gian nuơi cấy.
Tuyển lựa và chọn giống các chủng vi sinh vật cĩ hoạt lực enzym cao:
Khơng phải tất cả mọi vi sinh vật đều cĩ khả năng sinh tổng hợp enzym như nhau. Ngay cả những chủng cùng giống, cùng lồi cũng cĩ thể khác nhau về lượng enzym do chúng sản sinh ra. Vì vậy, việc tuyển chọn vi sinh vật tạo enzym nhiều khi cần phải luơn luơn kết hợp chặt chẽ với sự kiểm tra hoạt lực của hàng chục, hàng trăm chủng vi sinh vật để tìm ra chủng cĩ khả năng sinh tổng hợp enzym đã cho cao nhất.
Thành phần mơi trường dinh dưỡng:
Chúng ta cĩ thể điều khiển sinh tổng hợp enzym cần thiết bằng cách chọn mơi trường dinh dưỡng cĩ thành phần định tính và định lượng phù hợp nhất.
• Nguồn carbon: Nguồn carbon dùng nuơi cấy vi sinh vật là các glucide: monosaccharide, disaccharide và tinh bột. Trong đĩ, fructose, saccharose, maltose là nguồn carbon tốt nhất để sinh tổng hợp protease. Tinh bột cũng là nguồn carbon tốt đối với một số chủng vi sinh vật nhất định. Ngồi glucide, ta cũng cĩ thể dùng các nguồn carbon khác như: dầu mỡ, acid hữu cơ, rượu… Đối với Asp. oryzae, các nguồn carbon cĩ tác dụng tốt đến sinh tổng hợp protease được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: fructose, saccharose, maltose, glucose, arabinose, galactose, lactose.
• Nguồn nitơ:
o Các chất dùng làm nguồn nitơ trong mơi trường nuơi cấy vi sinh vật cĩ thể là các chất hữu cơ (protein và các sản phẩm thủy phân của chúng) hoặc các muối vơ cơ (muối amon, nitrat). Nước chiết ngơ, bột đậu nành, bột mì, dịch thủy phân, casein… rất giàu các hợp chất N.
o Các nguồn N hữu cơ với hàm lượng acid amin tự do tương đối thấp thường cĩ ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease vì chúng cĩ vai trị như chất cảm ứng của quá trình này. Hàm lượng N trong mơi trường cĩ ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh tổng hợp protease.
o Ngồi ra, để đảm bảo tổng hợp được nhiều protease, ta chọn tỉ lệ C:N thích hợp. Theo một số nhà khoa học thì khi hàm lượng C tăng quá nồng độ tối thích thì khơng ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, nếu tăng lượng N quá nồng độ thích hợp sẽ kìm hãm quá trình sinh tổng hợp protease [6]. Trong sản xuất protease, người ta cĩ thể dùng một số cơ chất tự nhiên làm nguồn C, nguồn N và những nguyên tố khống như bột mì đen, bột đậu nành, cám mì, cám ngơ…
o Tỉ lệ C:N thích hợp để tổng hợp protease đối với Asp. oryzae là từ 8:1-2:1
• Chất cảm ứng: Trong trường hợp nuơi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp protease, mơi trường cần phải cĩ chất cảm ứng là các nguồn N hữu cơ. Nhiều lồi nấm mốc khác nhau như Asp. oryzae, Asp. awamori, Asp. niger, Asp. flavus… trên mơi trường cĩ các nguồn N hữu cơ, sinh tổng hợp protease cĩ hoạt lực rất cao. Nhiều nghiên cứu cho thấy, quá trình sinh tổng hợp protease diễn ra mạnh mẽ trên mơi trường chứa cám mì, bột đậu tương đã tách béo và một ít nguồn N vơ cơ.
Điều kiện nuơi cấy:
trình sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp protease. Những nghiên cứu mới đây cho thấy, đa số các lồi nấm mốc phát triển thích hợp trong khoảng nhiệt độ 22-32oC. Nếu nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn sẽ kìm hãm quá trình phát triển và tổng hợp protease. Nhiệt độ cao, các enzyme bị biến tính do enzyme cĩ bản chất là protein. Nhưng điều kiện này cịn phụ thuộc vào loại enzyme mà vi sinh vật tổng hợp. • Độ ẩm mơi trường: Cĩ ảnh hưởng đáng kể đến sinh trưởng và sinh
tổng hợp protease khi nuơi cấy nấm mốc bằng phương pháp bề mặt. Thơng thường, độ ẩm thích hợp cho đa số các lồi nấm mốc phát triển trên khay hở là từ 58-60%. Nếu độ ẩm quá cao, ta khĩ thơng khí mơi trường, cịn nếu quá thấp thì mơi trường sẽ khơ nhanh, nấm mốc sinh bào tử mạnh và làm giảm hoạt tính protease tạo thành. Trong quá trình nuơi cấy, ta nên giữ độ ẩm mơi trường ổn định bằng cách duy trì độ ẩm của khơng khí được nạp qua mơi trường với mục đích cung cấp oxy cho nấm mốc phát triển.
• Thời gian nuơi cấy: Thơng thường, lượng enzyme được sinh tổng hợp nhiều nhất trong mơi trường khi nấm mốc chuẩn bị sinh bào tử. Thời gian nuơi cấy cịn phụ thuộc vào từng chủng nấm mốc và các điều kiện nuơi cấy nấm mốc.
• Độ thống khí: Các lồi nấm mốc là những vi sinh vật hiếu khí nên độ thống khí của mơi trường nuơi cấy cĩ ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease. Thơng thường, để làm tăng độ thống khí trong mơi trường, người ta thường thổi khơng khí vơ trùng qua canh trường hoặc qua bộ phận khuấy đảo. Tốc độ đảo trộn càng lớn thì mơi trường bão hịa oxy nhiều hơn. Độ thống khí cĩ thể đánh giá dựa vào lượng oxy hịa tan trong mơi trường.
• pH của mơi trường: Theo một số nghiên cứu, pH mơi trường ảnh hưởng đến tỉ lệ các protease được tổng hợp nên. Do đĩ, nếu giữ cho pH luơn cĩ một giá trị ổn định trong suốt quá trình nuơi cấy, vi sinh vật sẽ cĩ khuynh hướng sinh tổng hợp một dạng protease xác định. Vì
vậy, loại protease này sẽ chiếm ưu thế trong mơi trường. Khi dùng phương pháp bề mặt, pH mơi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzym của vi sinh vật vì pH hầu như khơng đổi trong suốt quá trình phát triển của vi sinh vật. Trong khi theo phương pháp bề sâu, pH ảnh hưởng rất lớn, nhiều khi đĩng vai trị quyết định đến sự tích lũy protease [6, 10].
2.3.5.3. Kỹ thuật nuơi cấy bề mặt
Mơi trường được trải đều ra các khay với chiều dày 2-3 cm và tiến hành trộn giống vi sinh vật vào khối mơi trường sao cho thật đều. Giống vi sinh vật thường được nuơi cấy riêng ở phịng thí nghiệm hay các phân xưởng nhân giống hoặc là các giống thương phẩm. Các loại giống này thường chứa nhiều bào tử. Khi cấy vào mơi trường dinh dưỡng, chúng sẽ phát triển thành tế bào vi sinh vật và tạo ra các loại enzym mà ta mong muốn.
Sau khi trộn giống, các khay chứa mơi trường sẽ được đưa vào phịng nuơi cấy, đặt trên các giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng khơng khí được lưu thơng thường xuyên. Phịng nuơi cấy phải cĩ hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm khơng khí.
Nhiệt độ thích hợp cho đại đa số nấm sợi là 28-32oC. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều khơng cĩ lợi cho sự phát triển của nấm sợi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thời gian nuơi nấm sợi để thu nhận enzym vào khoảng 36-60 giờ. Điều này cịn phụ thuộc vào giống vi sinh vật và vào điều kiện mơi trường cũng như phụ thuộc vào điều kiện nuơi cấy.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong mơi trường bán rắn khi nuơi bằng phương pháp bề mặt cĩ thể trải qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1:
Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuơi cấy. Ở giai đoạn này cĩ những thay đổi sau:
• Nhiệt độ tăng rất chậm
• Thành phần dinh dưỡng bắt đầu cĩ sự thay đổi. • Khối mơi trường cịn rời rạc.
• Enzym mới bắt đầu hình thành.
• Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt. Tuyệt đối khơng được đưa nhiệt độ cao quá 30oC vì thời kỳ đầu này, giống rất mẫn cảm với nhiệt độ.
Giai đoạn 2:
Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ. Trong giai đoạn này cĩ những thay đổi cơ bản như sau:
• Tồn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh. Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chủ yếu trên bề mặt mơi trường. Trong giai đoạn này, ta hồn tồn nhìn rõ các sợi nấm cĩ màu trắng xám bằng mắt thường.
• Mơi trường được kết lại khá chặt. • Độ ẩm mơi trường giảm dần.
• Nhiệt độ sẽ tăng nhanh, cĩ thể lên tới 40-45oC.
• Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hĩa mạnh của nấm sợi.
• Các loại enzym được hình thành và enzym nào cĩ cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ được tạo thành nhiều hơn.
• Lượng oxy trong khơng khí giảm và lượng CO2 sẽ tăng dần, do đĩ trong giai đoạn này cần phải được thơng khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-30oC là tốt nhất.
Giai đoạn 3:
Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ. Ở giai đoạn này cĩ một số thay đổi cơ bản như sau:
dưỡng sẽ chậm lại.
• Nhiệt độ của khối mơi trường giảm, do đĩ làm giảm lượng khơng khí mơi trường xuống cịn 20-25 thể tích khơng khí/thể tích phịng nuơi cấy/1giờ. Nhiệt độ nuơi duy trì ở 30oC.
• Trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều, do đĩ lượng enzym sẽ giảm. Chính vì thế, việc xác định thời điểm để thu nhận enzym là rất cần thiết.
2.3.5.4. Enzym protease
Khái niệm:
Enzyme protease hay peptid hydrolase, là một chất xúc tác sinh học cĩ bản chất là protein. Nĩ xúc tác cho quá trình thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein và các polypeptid. Sản phẩm của quá trình thủy phân cĩ thể là các acid amin, các peptide, các polypeptide chuỗi ngắn…
Phân loại protease:
Protease là tên gọi chung một nhĩm bao gồm nhiều enzyme khác nhau. Hiện nay, trên thế giới cĩ rất nhiều phương pháp phân loại protease.
• Theo pH xúc tác:
Dựa vào mức độ hoạt động trong dung dịch cĩ giá trị pH khác nhau mà enzyme protease được chia làm ba loại:
o Protease acid: Loại protease này thường được thu nhận từ các lồi nấm mốc như: Asp. niger, Asp. awamori, Asp. saitoi, Asp. shirousami. pHopt = 2.5-3. Hầu hết được sử dụng trong chế biến các sản phẩm từ thịt.
o Protease trung tính: Loại này cĩ thể thu nhận từ rất nhiều loại nấm mốc khác nhau như: Asp. oryzae, Asp. flavus, Asp. fumigatus, Asp. terricola. Protease trung tính thường cĩ pHopt : 6-7.5 và được sử dụng trong cơng nghiệp thực phẩm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
lồi nấm mốc như: Asp. oryzae, Asp. sojae, Asp. flavus. Protease kiềm cĩ pHopt = 8-11. Các loại protease kiềm được ứng dụng trong sản xuất bột giặt.
• Theo vị trí xúc tác trong phân tử protein:
Dựa trên cơ chế tác dụng của protease lên cơ chất, người ta phân loại enzyme thành hai nhĩm lớn: Exopeptidase (cịn gọi là peptidase) và Endopeptidase. Trong đĩ, exopeptidase tham gia xúc tác thủy phân liên kết peptide từ đầu mút của phân tử protein. Nếu phân cắt ở gốc amino hoặc carboxyl tự do thì gọi là enzyme aminopeptidase hay carboxypeptidase. Endopeptidase (cịn gọi là protease) xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide nằm ở giữa mạch phân tử protein.
Phương pháp phân loại này rất tổng quát, nên chỉ mang tính chất định tính sơ bộ ban đầu.
2.3.5.5. Enzym amylase
Định nghĩa và phân loại:
Amylase là nhĩm enzym thủy phân tinh bột, glycogen, dextrin. Sản phẩm của quá trình thủy phân là maltose, glucose, dextrin cĩ phân tử lượng nhỏ.
• α-amylase: (EC :3.2.1.1)
Thủy phân liên kết α-(1-4) glucoside bên trong chuỗi amylose và amylopectin ở bất kỳ vị trí nào để tạo ra hỗn hợp các mono và oligosaccharide như glucose, maltose. Phản ứng này dừng lại khi gặp liên kết α-(1-6) tại điểm phân nhánh.
Đặc tính của α-amylase của Aspergillus oryzae: pH hoạt động là 4-7.
Nhiệt độ tối ưu là 55-60oC. • Glucose amylase (EC : 3.2.1.3)
Đây là exo-enzym, thủy phân tinh bột, glycogen, polysaccharide ở các mối liên kết α -(1-4) và α -(1-6) glucoside từ đầu khơng khử thành các dextrin cĩ phân tử lượng thấp và cuối cùng tạo thành glucose.
CHƯƠNG 3. NGUYÊN LIỆU VAØ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.Nguyên liệu