Cân 1-2g mẫu, nghiền nhuyễn trong cối chày sứ, chuyển vào becher và thêm 3ml nước cất. Khuấy đun sơi để hồ hĩa tinh bột. Làm nguội tới 40oC và thêm vào 2ml
1 2 100 M M X M − = ×
dung dịch enzym amilase để thủy phân hồn tồn tinh bột trong 20 phút. Kiểm tra đã thủy phân hồn tồn bằng một giọt thuốc thử Liugon. Sau đĩ tiến hành giống như mẫu xác định đường khử bằng phương pháp Ferrycyanure( tham khảo [5])
7.3.Tính kết quả
Hàm lượng tinh bột % trong mẫu nguyên liệu:
Trong đĩ: Xtb – hàm lượng % đường khử sau thủy phân Xk - hàm lượng % đường khử trước thủy phân 0.9 - hệ số chuyển đổi từ glucose sang tinh bột
PHỤ LỤC 8. ĐỊNH LƯỢNG CELLULOSE 8.1.Dụng cụ, hĩa chất
Tủ sấy, lị nung, cối chày sứ, chén nung.
Bình cầu 150 cĩ gắn ống sinh hàn khí, phễu, giấy lọc khơng tro, becher.
HCl đặc, KOH 10%, CH3COOH 2%.
Thuốc thử Liugon.
8.2.Tiến hành
Cân 25g nguyên liệu đã được nghiền mịn, cho vào một bình cầu cao cổ đã chứa 50ml nước cất, thêm vào 10ml HCl đậm đặc.
Đặt bình cầu lên bếp điện trong tủ hotte, gắn ống sinh hàn khí và đun sơi thật kỹ cho đến khi tinh bột bị thủy phân hồn tồn, thử điểm kết thúc thủy phân bằng cách chấm một giọt dung dịch thủy phân lên lam kính vào giọt thuốc thử Luigon đến mất màu xanh.
Lấy bình cầu ra khỏi bếp, lọc qua giấy lọc khơng tro, lấy bã. Rửa bã nhiều lần bằng nước cất. Dùng bình tia nước chuyển hết bã vào lại bình cầu đã dùng trên.
9 . 0 * ) (Xtb Xk TB= −
Thêm vào bình cầu 10ml KOH 10%. Đặt bình cầu lên bếp, đun sơi 20- 30 phút nữa.
Lọc lấy bã trên hai giấy lọc khơng tro cĩ trọng lượng bằng nhau. Rửa bã 5 lần bằng nước cất, mỗi lần 20ml. Sau đĩ rửa 3 lần bằng dung dịch CH3COOH 2% rồi bằng rượu etylic nguyên chất (cồn tuyệt đối). Sau khi rửa bã cĩ màu trắng trong là được.
Đặt cả 2 giấy lọc và bã vào đĩa petri rồi đưa vào tủ sấy 1050C trong 2 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm và cân.
Đưa cả hai giấy lọc và bã vào chén nung (đã được nung trong lị nung ở 400- 5000C, để nguội và cân trên cân phân tích), tiến hành nung bã trong lị nung ở nhiệt độ 400- 5000C trong 3 giờ đến khối lượng khơng đổi. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm và cân chén nung chứa tro sau khi nung.
8.3.Tính kết quả
Lượng cellulose cĩ trong mẫu được tính theo cơng thức:
Trong đĩ:
m1: khối lượng bã sau khi sấy (g).
m 2: khối lượng chén nung và tro sau khi nung (g). m 3: khối lượng chén nung (g).
m: khối lượng mẫu (g).
PHỤ LỤC 9. ĐỊNH LƯỢNG TRO 9.1.Tiến hành:
Nung chén sứ đã rửa sạch ở lị nung (6000C) đến trọng lượng khơng đổi. Để nguội ở bình hút ẩm và cân trên cân phân tích. Cho vào chén m (g) chất thử, cân trên cân phân tích rồi cho vào lị nung 6000C, nung đến tro trắng. Lấy ra cho vào bình hút ẩm và cân chính xác trên cân phân tích. Tiếp tục nung 30 phút rồi lấy ra cho vào bình
( ) 1 2 3 .100 % m m m X m − − =
hút ẩm và cân chính xác trên cân phân tích đến khối lượng khơng đổi. 9.2.Cơng thức: Độ tro = Trong đĩ: G là trọng lượng chén. G1 là trọng lượng chén và mẫu. G2 là trọng lượng chén và tro.
PHỤ LỤC 10. ĐỊNH LƯỢNG HOẠT TÍNH PROTEASE 10.1. Hĩa chất:
Dung dịch Casein 1% pha trong dung dịch đệm 0,2N Glycin-NaOH pH 9,5. Thuốc thử Folin
Dung dịch tyrosin chuẩn (1 µmol/ml): cân 18,12mg tyrosin, hịa tan trong HCl 0,2N và định mức đến 100ml bằng dung dịch HCl 0,2N. Từ dung dịch này tiếp tục pha lỗng bằng dung dịch HCl 0,2N để nhận được các dung dịch cĩ nồng độ tyrosin từ 0,05 đến 0,3 µmol/ml.
Cách pha dung dịch tyrosin chuẩn (Bảng 2)
Dung dịch casein 2%: cân chính xác 2g casein, hịa tan trong 30ml dung dịch NaOH 0,1N, cĩ thể đun cách thủy cho đến khi tan hết casein (khuấy đều khi đun). Dùng dung dịch KH2PO4 1/15M để chỉnh pH về khoảng 6- 7, sau đĩ định mức đến 100ml bằng dung dịch đệm phosphat 1/15M. 2 1 100 G G G G − × −
Bảng 2: Cách pha dung dịch chuẩn tyrosin Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6 Nồng độ tyrosin 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Vtyrosin/VHCl 1/19 1/9 3/17 1/4 1/3 3/7
Dung dịch A (NaH2PO4 1/15 M): cân 11,866g NaH2PO4.12H2O pha trong 1 lít nước cất.
Dung dịch B: (KH2PO4 1/15 M): cân 9,073g KH2PO4 pha trong 1 lít nước cất. Dung dịch đệm phosphat pH= 7,4: trộn dung dịch A và B theo tỷ lệ 4:1. Dung dịch acid tricloacetic (TCA) 10%.
Dung dịch Na2CO3 6%.
Thuốc thử Folin-Cio-Calteau.
10.2. Tiến hành
Trích ly dịch chiết enzym thơ (hình 1)
Mẫu kiểm chứng: tiến hành mẫu kiểm chứng giống như đối với mẫu thí nghiệm, nhưng thay 1ml dịch enzym bằng 1ml nước cất.
Dựng đường chuẩn tyrosin: từ dung dịch tyrosin chuẩn đã pha lỗng ở trên, lấy 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm, thêm vào 4 ml dung dịch Na2CO3 6%, lắc đều, thêm tiếp 1ml thuốc thử Folin-Cio-Calteau, lắc đều, để phản ứng 30 phút ở nhiệt độ phịng, đo độ hấp thu A ở bước sĩng 750nm, tiến hành dựng đường chuẩn tyrosin theo kết quả thu được.
Hoạt tính của protease trong 1ml dịch enzyme (đvht/ml)
Trong đĩ: [T]: nồng độ
tyrosine được suy ra từ đường chuẩn và độ hấp thu của mẫu nghiên cứu, (µmol/ml) 8: số ml tồn bộ hỗn hợp phản ứng (1ml dịch enzyme, 2ml dung dịch casein, 5ml dung dịch TCA 10%)
n: hệ số pha lỗng
τ: Thời gian phản ứng (10 phút) Hoạt tính của protease trong 1g canh trường khơ
(đvht/g ctk)
Trong đĩ:V- thể tích định mức, (ml)
a- số g canh trường khơ, (g)
[ ] τ n T ml Hp/ = *8* a V ml Hp g Hp/ = / *
Hình 2: Sơ đồ xác định hoạt tính protease
PHỤ LỤC 11. THAØNH PHẦN MƠI TRƯỜNG GIỮ GIỐNG
Mơi trường Crapek để giữ giống Aspergillus oryzae:
Nước cất : 1000ml
NaNO3 : 3g
KH2PO4 : 1g
MgSO4.7H2O: 0,5g
FeSO4 : 0,01g