Lựa chọn tỉ lệ khơ lạc và bột mì sẽ ảnh hưởng tới hàm lượng các chất dinh dưỡng cĩ trong mơi trường nuơi cấy (nguồn C, nguồn N, chất cảm ứng, chất khống). Do vậy, tỉ lệ nguyên liệu cĩ ảnh hưởng tới hoạt tính của protease được tạo ra bởi nấm mốc.
Theo các tài liệu về sản xuất nước tương ở nước ngồi, người ta thường sử dụng tỉ lệ phối trộn khơ đậu nành:bột mì dao động trong khoảng (50-90%) : (10-50%) [17]. Do đi từ nguồn nguyên liệu là khơ lạc và bột mì nên chúng tơi cần khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu tới hoạt tính protease. Các thí nghiệm được thực hiện như sau:
Các yếu tố cố định trong quá trình nuơi nấm mốc:
• Tỉ lệ mốc cấy: 3% v/w
• Độ ẩm của mẫu: 50%
• Thời gian nuơi mốc: 42 giờ
• Nhiệt độ nuơi mốc: nhiệt độ phịng
Yếu tố thay đổi:
• Tỉ lệ thành phần nguyên liệu (khơ lạc : bột mì) = (50:50), (70:30), (90:10), (100:0) (w/w).
Cách tiến hành: Trộn nguyên liệu khơ lạc và bột mì theo các tỉ lệ trên, bổ sung ẩm cho hỗn hợp mơi trường nuơi cấy (cơng thức xem phần phụ lục). Mơi trường sau khi hấp tiệt trùng 121oC, 1atm, 20 phút sẽ được làm nguội, kiểm tra và hiệu chỉnh tới độ ẩm 50%, sau đĩ, tiến hành gieo cấy nấm mốc. Dùng pipet vơ khuẩn lấy 10ml nước vơ khuẩn cho vào ống nghiệm
chứa giống. Dùng que cấy đánh nhẹ cho các bào tử nấm phân tán trong nước. Sau đĩ hút 3ml huyền phù bào tử và phân phối đều trên khay nuơi. Trộn đều mơi trường với giống nấm mốc. Nấm mốc được nuơi cấy trên khay nuơi, ở nhiệt độ phịng. Trong suốt thời gian nuơi cấy, bề mặt khay nuơi được che phủ bằng khăn vải đã được thấm ướt để hạn chế sự mất ẩm của mơi trường và sự nhiễm vi sinh vật khác từ mơi trường bên ngồi. Sau khi kết thúc thời gian nuơi mốc, ta thu lấy canh trường, đem xác định ẩm và đo hoạt tính protease.
BẢNG 4.13: Aûnh hưởng của tỉ lệ khối lượng khơ lạc:bột mì đến hoạt tính protease trong canh trường bề mặt Asp. oryzae
Tỉ lệ khơ lạc:bột mì (w/w) Hoạt tính protease tb (Đvhđ/g ctk)
50:50 1.11a
70:30 2.00b
90:10 2.72c
Chú thích: “a, b, c, d…”: kí tự giống nhau thì các giá trị khác biệt khơng cĩ ý nghĩa, kí tự khác nhau thì các giá trị khác biệt cĩ ý nghĩa với P<0,05
HÌNH 4.7: Quan hệ giữa tỉ lệ nguyên liệu và hoạt tính protease
Ta nhận thấy, khi hàm lượng khơ lạc trong hỗn hợp nguyên liệu tăng thì hoạt tính protease tăng. Tức là khi tăng hàm lượng cơ chất cảm ứng (protein) thì nấm mốc Asp. oryzae sẽ sinh tổng hợp protease cĩ hoạt tính cao hơn.
Cĩ thể giải thích quy luật này dựa vào sơ đồ sau của Monod và Jacob: Gen điều khiển Gen tổng hợp 1. 2. 3. 4.
Cơ chất Sản phẩm (S) (P)
Bình thường, khi khơng cĩ cơ chất cảm ứng, chất kìm hãm cĩ trong tế bào sẽ tương tác với gen điều khiển, tồn bộ quá trình sinh tổng hợp enzym bị phong tỏa và khơng hoạt động. Khi ta cho cơ chất cảm ứng vào mơi trường nuơi cấy, cơ chất sẽ tương tác với chất kìm hãm, gen điều khiển thốt ra khỏi sự phong tỏa của chất kìm hãm, khi đĩ, quá trình sinh tổng hợp protease sẽ xảy ra. Như vậy, lượng cơ chất cảm ứng trong mơi trường càng nhiều thì sẽ kích thích tổng hợp ra nhiều enzym cảm ứng. Kết quả thí nghiệm đạt được là phù hợp với lý thuyết điều khiển sinh tổng hợp enzym cảm ứng mà Monod và Jacob đã đưa ra.
Tuy nhiên, tác động cảm ứng đạt hiệu quả cao chỉ ở một liều lượng nhất định nào đĩ của cơ chất cảm ứng. Khi nào hàm lượng cơ chất cảm ứng quá cao, khả năng sinh tổng hợp enzym cảm ứng sẽ giảm [6]. Từ kết quả thí nghiệm, ta nhận thấy: hoạt tính protease tăng dần khi hàm lượng khơ lạc trong nguyên liệu tăng, nhưng nĩ khơng tăng mãi mãi. Hoạt tính protease đạt cực đại khi nuơi cấy nấm mốc trong mơi trường cĩ thành phần 90% (khơ lạc):10% (bột mì). Và sau đĩ, khi tăng hàm lượng khơ lạc lên thì hoạt tính protease lại giảm do hiện tượng ức chế dị hĩa. Tức là, khi hàm lượng protein trong mơi trường tăng cao thì sau một thời gian nuơi cấy, lượng acid amin tự do được tích lũy trong canh trường sẽ tăng lên. Chúng sẽ đĩng vai trị kìm hãm quá trình sinh tổng hợp protease của nấm mốc. Do vậy, khơng phải càng cho nhiều cơ chất thì khả năng sinh tổng hợp enzym càng cao.
So sánh với tỉ lệ thành phần nguyên liệu trong sản xuất nước tương ở một số nước:
Tỉ lệ phối trộn nguyên liệu khơ đậu nành và bột mì của các loại nước tương ở các quốc gia khác nhau rất đa dạng và tạo nên nét đặc trưng riêng cho sản phẩm nước tương của từng nước.
• Si yau (Trung Quốc): Khơ đậu nành và bột mì được trộn với tỉ lệ 6:4 • Kecap asin (Indonesia): Khơ đậu nành và bột mì được trộn với tỉ lệ 1:2. • Toyo (Philipine): Hàm lượng khơ đậu nành khoảng 66-90%, bột mì
khoảng 10-34%.
• Nhật Bản: Tỉ lệ phối trộn giữa khơ đậu nành và bột mì của các loại nước tương khác nhau cũng khác nhau (BẢNG 4 .14).
BẢNG 4.14: Tỉ lệ phối trộn nguyên liệu trong sản xuất nước tương ở Nhật Bản Loại nước
tương Koikuchi-shoyu Usukuchi-shoyu Tamari-shoyu Saishikomi-shoyu Shiro-shoyu Tỉ lệ khơ đậu
nành:bột mì 1:1 1:1 Khơng dùng bột mì 10:1 1:5
Đối với nguyên liệu là khơ lạc đã khảo sát ở trên, do hàm lượng protein thơ khơng cao như trong hạt đậu nành hay khơ đậu nành nên, nếu sử dụng tỉ lệ khơ lạc thấp cĩ thể sẽ khơng cĩ đủ nguồn N thích hợp cho nấm mốc sinh tổng hợp protease cĩ hoạt tính cao. Việc sử dụng bột mì với tỉ lệ 10% chủ yếu cung cấp nguồn C (tinh bột) cho mốc sinh trưởng và phát triển. Thành cơng hay thất bại trong sản xuất enzym cảm ứng phụ thuộc rất nhiều vào việc xác định cơ chất cảm ứng và liều lượng cần thiết của chất cảm ứng đưa vào mơi trường.
Với thành phần mơi trường thích hợp là 90% (khơlạc):10% (bột mì), chúng tơi tiếp tục tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố khác tới hoạt tính protease.