Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng viên ngậm dưới lưỡi aslem 1mg

HPLC là một phương pháp vừa có khả năng tách, định tính, định lượng đồng thời trong cùng một lần phân tích với độ chọn lọc, độ đúng, độ chính xác cao và được sử dụng ngày càng phổ biến h

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THANH MINH

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VIÊN NGẬM DƯỚI

LƯỠI ASLEM 1 mg

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THANH MINH

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập tại trường đại học Dược Hà Nội, em đã được các thầy, các cô luôn quan tâm chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để em học tập trau dồi kiến thức Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, em đã có cơ hội vận dụng kiến thức cũng như được mở rộng vốn hiểu biết của mình để áp dụng cho công việc tương lai

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS

TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người đã cống hiến hết mình vì sự nghiệp giáo

dục, người đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành khóa luận

Em xin trân trọng cảm ơn PGS TS Đào Kim Chi và nhóm nghiên cứu

đã cung cấp chất chuẩn, chế phẩm để em có thể thực hiện đề tài

Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô, anh chị Phòng kiểm nghiệm, phân tích và tương đương sinh học – Viện Công nghệ dược phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em thực hiện khóa luận

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, khích lệ và tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Hà nội, ngày tháng năm Sinh viên

Lê Thanh Minh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ ASLEM 3

1.1.1 Hoạt chất Glycyl funtumin 3

1.1.2 Tình hình nghiên cứu hoạt chất Glycyl funtumin 4

1.1.3 Các phương pháp định lượng Glycyl funtumin 6

1.2 VÀI NÉT VỀ VIÊN NGẬM DƯỚI LƯỠI 9

1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 10

1.3.1 Nguyên tắc và phân loại 10

1.3.2 Các thông số đặc trưng 10

1.3.3 Các phương pháp định lượng bằng HPLC 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 15

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.2 Dung môi, hóa chất 15

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, máy móc 15

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 16

2.2.1 Thẩm định phương pháp định lượng viên ngậm dưới lưỡi Aslem

bằng HPLC 16

2.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng viên ngậm dưới lưỡi Aslem 16

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.3.1 Thẩm định phương pháp định lượng viên ngậm dưới lưỡi Aslem bằng HPLC 17

2.3.2 Xây dựng tiêu chuẩn kĩ thuật và phương pháp đánh giá chất lượng viên ngậm dưới lưỡi Aslem 18

2.3.3 Tính toán và xử lý số liệu 20

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 22

3.1 CHUẨN BỊ MẪU 22

3.1.1 Mẫu chuẩn 22

3.1.2 Mẫu thử 22

3.2 LỰA CHỌN DUNG MÔI PHA MẪU VÀ ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 23

3.2.1 Lựa chọn dung môi pha mẫu 23

3.2.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký 23

3.3 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 25

3.3.1 Độ phù hợp của hệ thống 25

3.3.2 Độ chọn lọc 25

3.3.3 Độ tuyến tính 27

3.3.4 Độ chính xác 29

3.3.5 Độ đúng 32

3.4 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG VIÊN

NGẬM DƯỚI LƯỠI ASLEM 1 mg 34

3.4.1 Tính chất 34

3.4.2 Định tính 34

3.4.3 Độ đồng đều khối lượng 35

3.4.4 Độ rã 36

3.4.5 Độ đồng đều hàm lượng 36

3.4.6 Định lượng 37

BÀN LUẬN 39

KẾT LUẬN 42

ĐỀ XUẤT 43

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography)

KLTB Khối lƣợng trung bình

MeOH Methanol

MS Khối phổ (Mass spectrometry)

PA Hóa chất tinh khiết dùng trong phân tích (Pure Analysis)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Nội dung Trang

3.3 Kết qủa khảo sát độ tuyến tính của GF.HCl 28 3.4 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 30

3.5 Kết quả đánh giá độ chính xác khác ngày của phương

3.6 Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp 33 3.7 Kết quả đánh giá độ đồng đều khối lượng 35 3.8 Kết quả đánh giá độ đồng đều hàm lượng 37 3.9 Kết quả định lượng GF.HCl trong viên Aslem 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tổ chức Y tế Thế giới đã dự báo về mô hình bệnh tật trong thế kỷ 21, các bệnh không lây nhiễm trong đó có ung thư sẽ trở thành nhóm bệnh chủ yếu đe dọa đến sức khỏe con người, chiếm 54% nguyên nhân gây tử vong Ở Việt Nam, theo nhận định của Bộ Y tế, các bệnh ung thư, tim mạch, tâm thần đang có nguy cơ tăng lên giống với các nước công nghiệp phát triển Theo số liệu thống kê qua ghi nhận ung thư tại Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh, ước tính mỗi năm ở nước ta có khoảng 150.000 bệnh nhân ung thư mới mắc và 75.000 người chết vì ung thư, con số này có xu hướng ngày càng gia tăng [26] Chính vì thế xu hướng nghiên cứu và sản xuất các thuốc điều trị và điều trị bổ trợ dành cho bệnh nhân ung thư đang ngày càng phát triển

Aslem (glycyl funtumin hydroclorid) là một thuốc kích thích miễn dịch [11] được nghiên cứu bởi Phó giáo sư Đào Kim Chi, Giáo sư Đặng Hanh Phức và cộng sự trong hơn 30 năm Năm 2002, chế phẩm thuốc tiêm Aslem

ra đời tại Trung tâm Khoa học công nghệ Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội (Số đăng ký: VD-0105-06) và được chuyển giao cho công ty cổ phần Dược phẩm Vĩnh Phúc sản xuất – là sản phẩm thuốc tiêm miễn dịch đầu tiên được sản xuất tại Việt Nam Aslem có tác dụng tăng cường miễn dịch dùng để điều trị bổ trợ ung thư đường tiêu hóa (gan, dạ dày, đại trực tràng, tụy), ung thư phổi và ung thư vú Kết hợp hiệp đồng với kháng sinh nhằm mục đích ngăn ngừa nhiễm trùng trước và sau phẫu thuật [12] Các nghiên cứu lâm sàng về tác dụng của Aslem đã được thực hiện và cho kết quả hết sức khả quan [1], [20], [22], [25]

Để đáp ứng yêu cầu điều trị ngày một tăng cao, Phó giáo sư Đào Kim Chi và nhóm nghiên cứu tại trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu bào

chế thử nghiệm chế phẩm Aslem dưới dạng viên ngậm dưới lưỡi (glycyl funtumin hydroclorid 1mg)

Hiện nay, tiêu chuẩn cơ sở để định lượng nguyên liệu GF.HCl và dung dịch tiêm Aslem vẫn áp dụng phương pháp đo quang bằng cách tạo cặp ion với heliantin [15] Năm 2009, các tác giả [2] đã xây dựng thành công phương pháp định lượng GF.HCl bằng HPLC HPLC là một phương pháp vừa có khả năng tách, định tính, định lượng đồng thời trong cùng một lần phân tích với

độ chọn lọc, độ đúng, độ chính xác cao và được sử dụng ngày càng phổ biến hiện nay

Xuất phát từ nhu cầu thực tế để kiểm tra chất lượng và hoàn thiện hồ sơ đăng ký thuốc cho viên ngậm dưới lưỡi Aslem, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng viên ngậm dưới lưỡi Aslem 1 mg”

với 2 mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng Glycyl funtumin hydroclorid trong viên ngậm dưới lưỡi Aslem bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2 Xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng viên ngậm dưới lưỡi Aslem (glycyl funtumin hydroclorid 1mg)

N C

1.1.1 Hoạt chất Glycyl funtumin

1.1.1.1 Công thức cấu tạo

Hình 1.1- Công thức cấu tạo của Glycyl Funtumin Hydroclorid [11], [12] Công thức phân tử: C23H38O2N2.HCl

Trọng lượng phân tử: 410,5 Da

Tên khoa học: N- (aminoethanoyl)- 3- preganan- 20- on hydroclorid [12]

1.1.1.2 Tính chất hóa lý

Glycyl Funtumin bản chất là một aminoacyl steroid, được tổng hợp dưới

dạng muối với HCl hoặc HBr

- Tính chất vật lý:

+ Bột kết tinh màu trắng, vị hơi đắng và chát nhẹ

+ Bị phân hủy ở nhiệt độ 220-230°C

+ Dễ tan trong nước nóng và methanol, tan trong cloroform, khó tan trong nước nguội

+ Năng suất quay cực: dung dịch 0,5% trong MeOH ở 25°C có [α]D

= 98°

88 Tính chất hóa học:

+ GF có tính chất hóa học của một amin, tham gia phản ứng tạo muối với các acid như HCl, HBr (dạng dược dụng là GF HCl); tham gia các phản ứng alkyl hóa và dễ bị oxy hóa

+ GF có bản chất là một phân tử amid nên dễ bị thủy phân khi đun nóng

+ Có tính chất hóa học của một ceton, tham gia phản ứng cộng hợp vào nhóm carbonyl, phản ứng oxy hóa khử nhóm carbonyl… [12]

1.1.1.3 Tác dụng dược lý

Các nghiên cứu ban đầu cho thấy: thuốc có tác dụng kích thích miễn dịch dịch thể [11] và qua trung gian tế bào theo cơ chế hoạt hóa chức năng thực bào của đại thực bào và tăng chuyển dạng lympho bào Ngoài ra, nó còn

có tác dụng tăng cường sức đề kháng và chống nhiễm khuẩn ở mô hình

in vitro và mô hình thực nghiệm gây viêm phúc mạc bởi trực khuẩn mủ xanh

kháng kháng sinh [12]

1.1.1.4 Chỉ định

Aslem được chỉ định kết hợp với phẫu thuật, hóa trị liệu và xạ trị để điều trị bổ trợ ung thư đường tiêu hóa (gan, dạ dày, đại trực tràng, tụy), ung thư phổi và ung thư vú Kết hợp hiệp đồng với kháng sinh nhằm mục đích ngăn ngừa nhiễm trùng trước và sau phẫu thuật [12]

1.1.1.5 Tác dụng không mong muốn

Ở liều điều trị, chưa có báo cáo nào về tác dụng phụ nguy hiểm Một số biểu hiện như: mẩn ngứa, mề đay, nôn, buồn nôn, táo bón có xảy ra nhưng rất hiếm gặp [12]

1.1.2 Tình hình nghiên cứu hoạt chất Glycyl funtumin

1.1.2.1 Trên thế giới

Từ năm 1958, Funtumin lần đầu tiên đã được Janot, Khương Hữu Quý

và Goutarel chiết xuất, phân lập từ lá cây Funtumia lactifolia-staff

Apocynaceae, một loài cây có ở miền Đông châu Phi

Năm 1965, tại Viện nghiên cứu hóa học các hợp chất tự nhiên ở

Gif-Sur-Yvette (Cộng hòa Pháp), Giáo sư Nguyễn Đăng Tâm đã dùng Funtumin để

bán tổng hợp một dãy các aminoacyl steroid, trong đó có Glycyl funtumin đã được chứng minh là chất có tác dụng kích thích miễn dịch mạnh, vì thế nó đã được lựa chọn để bào chế tiếp thành một chế phẩm thuốc ở dạng muối hydrobromid và có tên là LH1 Sau đó, do thiếu nguồn nguyên liệu nên quá trình bán tổng hợp Glycyl funtumin bị hạn chế và dừng lại [3], [12], [19], [22]

1.1.2.2 Ở Việt Nam

Năm 1973, chế phẩm LH1 đã được Giáo sư Tôn Thất Tùng sử dụng

trong điều trị bổ trợ cho bệnh nhân ung thư gan tiên phát tại bệnh viện Việt Đức, mở ra triển vọng to lớn trong việc sử dụng dược phẩm này để điều trị những bệnh có liên quan đến sự suy giảm hệ thống miễn dịch

Nhận thấy tiềm năng quý báu và với mong muốn tạo ra một loại dược phẩm chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu chữa bệnh của người dân trong nước, các nhà khoa học Việt Nam đã nỗ lực không mệt mỏi và hiện tại đã thu được những kết quả rất đáng khích lệ:

Năm 1977, Giáo sư Đặng Hanh Phức và cộng sự đã bán tổng hợp được

GF.HCl, đặt tên là Aslem và được sản xuất dưới dạng thuốc tiêm ở quy mô phòng thí nghiệm để tiến hành những thử nghiệm lâm sàng bước đầu trong điều trị ung thư gan, ung thư phổi, nhiễm khuẩn ngoại khoa kết hợp với kháng sinh và trong nhiễm khuẩn virus khác ở các bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức, Viện Lao và Bệnh Phổi, bệnh viện Hữu Nghị Việt Xô

Năm 1982, nhờ tổng hợp thành công Funtumin tại khoa Hóa trường Đại

học Tổng hợp Leiden (Hà Lan), Phó giáo sư Đào Kim Chi và cộng sự đã tổng

hợp thành công GF.HCl từ pregnenolon qua trung gian phtalimid tại Labo

Tổng hợp thuốc của trường Đại Học Dược Hà Nội do tổ chức NUFFIC tài trợ [12], [22]

Sau gần 50 năm nghiên cứu và phát triển, năm 2002, chế phẩm thuốc tiêm miễn dịch Aslem (Glycyl Funtumin Hydroclorid 0,3mg) đã ra đời Chế phẩm hiện do công ty cổ phần Dược phẩm Vĩnh Phúc sản xuất (Số đăng ký: VD-0105-06) Hiện nay, Phó giáo sư Đào Kim Chi và nhóm nghiên cứu đang tiếp tục nghiên cứu để cho ra đời chế phẩm viên ngậm dưới lưỡi Aslem (Glycyl funtumin hydroclorid 1mg)

Cho đến nay đã có khá nhiều nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh tác dụng của Aslem trong điều trị bổ trợ ung thư gan [1], sau phẫu thuật ung thư đại tràng [20], ung thư dạ dày [22], ung thư đường tiêu hóa [25] Các nghiên cứu về ảnh hưởng của Aslem trên hệ thống enzyme CY-P450 ở gan động vật thí nghiệm [3], ảnh hưởng lên chức năng hệ tạo máu, gan thận và huyết áp [18], nghiên cứu thăm dò tác dụng sinh học [21] đều cho kết quả hết sức khả quan Các nghiên cứu về dược động học của Aslem cũng đã được tiến hành trên động vật thí nghiệm và người tình nguyện [13], [16], [19], [23]

1.1.3 Các phương pháp định lượng Glycyl funtumin

1.1.3.1 Các phương pháp định lượng trong huyết tương

1.1.3.1.1 Phương pháp LC-MS

Phạm Như Quỳnh [23] sử dụng LC- MS để khảo sát dược động học của

GF trong huyết tương chó Phương pháp đã định lượng được GF ở khoảng nồng độ 0,01 – 0,2 μg/ml

- Các điều kiện để sử dụng LC-MS cho định lượng GF gồm:

Chiết GF từ huyết tương bằng cloroform; Pha tĩnh: cột Hypersil BDS Cyano (5μm, 150 × 4,6 mm); Pha động: hỗn hợp MeOH – H2O (6:4) – dung dịch acid formic 0,2% (tt/tt); Tốc độ dòng: 1ml/phút; Thể tích bơm mẫu: 10 μl

Các điều kiện để sử dụng LC-MS/MS cho định lượng GF gồm:

Điều kiện khối phổ:

Kiểu phổ khối: MS/MS, nguồn ion hóa HESI (+), bộ phận phân tích khối Triple Quadrupole; Chuẩn nội (IS): Salbutamol; Số khối của ion mẹ: GF: m/z = 375, IS: m/z = 240; Thế phân mảnh GF: 32V; IS: 18V; Số khối của mảnh ion con: GF: m/z = 121; IS: m/z = 148

Điều kiện sắc ký:

- Nhiệt độ cột 50°C; Thể tích tiêm mẫu: 25 μl

Cột sắc ký, pha động và tốc độ dòng có thể dùng 1 trong 2 điều kiện sau:

- Cột Luna CN, kích thước 150 × 4,6 mm, 5μm; Pha động: MeOH – dung dịch acid formic 0,5% (60:40) (tt/tt); Tốc độ dòng: chương trình gradient [16], [17], [19]

- Cột Luna C18, kích thước 75 × 4,6 mm; 2,7μm; Pha động: MeOH – dung dịch acid formic 0,5% (80:20) (tt/tt); Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút [13]

1.1.3.2 Các phương pháp định lượng trong nguyên liệu và chế phẩm

Định lượng GF.HCl trong chế phẩm không đòi hỏi phương pháp có độ nhạy cao cỡ ng/ml như đối với định lượng trong huyết tương

1.1.3.2.1 Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS

Phương pháp tạo màu với ninhydrin

Nguyên tắc: GF.HCl có khả năng tạo phức màu xanh tím không bền với ninhydrin Hợp chất màu có tác dụng với cadimi clorua sẽ cho một phức màu hồng bền, phức này hấp thụ mạnh ở bước sóng 510 nm

Phương pháp tạo cặp ion với heliantin

Nguyên tắc: GF.HCl là một base hữu cơ có khả năng tạo cặp với acid hữu cơ mang màu (heliantin) Cặp ion này được chiết bằng dung môi hữu cơ cloroform rồi đem đo quang

Cực đại hấp thụ của cặp ion này ở khoảng 425 – 426 nm

Phương pháp tạo cặp ion có độ lặp lại cao hơn và đòi hỏi dụng cụ, thuốc thử, thao tác đơn giản hơn nên phương pháp này được chọn để đưa vào tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu GF.HCl và dung dịch tiêm Aslem [15]

Phương pháp chiết đo quang thực hiện qua nhiều giai đoạn, đòi hỏi nhiều thời gian và phải tiếp xúc với dung môi độc hại (cloroform)

1.1.3.2.2.Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh và cộng sự đã xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định lượng GF.HCl với khoảng nồng độ 0,05-0,25 mg/ml Phương pháp có độ chính xác cao với khả năng thu hồi > 97% và độ chụm ≤ 0,12%

Điều kiện sắc ký gồm:

Cột sắc ký: RP 18 (150 × 4,6 mm; 5 μm); Pha động: Methanol – dung dịch kali dihydrophosphat 20 mM pH 7,0 (80 : 20), trộn đều, lọc qua

màng lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 μm; Bước sóng : 204 nm; Lưu lượng dòng: 1,0 ml/phút; Thể tích tiêm: 20 μl [2]

Phương pháp định lượng GF.HCl có độ chính xác cao, đơn giản, thời gian phân tích nhanh (khoảng 7 phút) và khoảng nồng độ tuyến tính phù hợp cho việc định lượng trong chế phẩm

1.2 VÀI NÉT VỀ VIÊN NGẬM DƯỚI LƯỠI

Định nghĩa: Viên đặt dưới lưỡi (Sublingual tablet) là chế phẩm dạng rắn,

đơn liều được đặt dưới lưỡi để cho tác dụng toàn thân Viên được bào chế bằng cách nén hỗn hợp của bột hoặc hạt thành viên có hình dạng phù hợp với mục đích sử dụng [28]

Miệng không phải là nơi hấp thu thức ăn nhưng tại đây có một màng lưới mao mạch khá phong phú, đặt biệt là 2 bên má và dưới lưỡi, rất thuận tiện cho việc hấp thu thuốc Dược chất sau khi hòa tan trong nước bọt (có pH khoảng 6,5) được hấp thu qua màng niêm mạc mỏng ở dưới lưỡi và đi về tĩnh mạch cảnh nghĩa là được đưa thẳng vào vòng tuần hoàn (vào tĩnh mạch cảnh rồi về tim), tác dụng do đó xuất hiện nhanh, lại không qua gan nên tránh được

sự phá hủy của men chuyển hóa thuốc ở gan vì vậy sinh khả dụng của thuốc được nâng cao so với đường uống pH của nước bọt là 6,5 là một lợi thế vì ít ảnh hưởng đến độ bền vững của các thuốc nhạy cảm với môi trường kiềm hoặc acid Đây là một đường đưa thuốc thuận tiện, dễ thực hiện, và an toàn [4]

Để dược chất được hấp thu nhanh, viên đặt dưới lưỡi phải rã rất nhanh (trong vòng 1 – 2 phút) và dược chất phải là loại dễ tan

Để tránh gây cảm giác cộm dưới lưỡi khi đặt và làm cho viên rã nhanh, viên đặt dưới lưỡi thường được chế với khối lượng nhỏ (<150 mg) và mỏng

Do vậy dược chất phải là loại dùng ở liều thấp (1-15 mg), không kích ứng niêm mạc và ở dạng bột rất mịn [8]

1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.3.1 Nguyên tắc và phân loại

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – High Performance Liquid Chromatography) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao

Pha tĩnh có thể là chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân, chất lỏng được bao trên bề mặt một chất rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ

Tùy thuộc vào bản chất các pha, cơ chế tách mà người ta phân làm nhiều loại sắc ký khác nhau: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học Trong đó, sắc

ký lỏng phân bố được sử dụng phổ biến nhất hiện nay [5], [9], [10], [14]

1.3.2 Các thông số đặc trưng

1.3.2.1 Thời gian lưu t R

Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại

Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là xác định Vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các chất Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

- Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc của hạt nhồi

- Bản chất, thành phần, tốc độ pha động

- Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế

- Trong một số tường hợp còn phụ thuộc pH của pha động, nồng độ chất tạo phức, nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc ký [9], [14]

1.3.2.2 Hệ số phân bố K

Là đại lượng đặc trưng cho sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh K =

Trong đó: CS: là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh

CM: là nồng độ mol của chất tan trong pha động

K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách diễn

a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

Yêu cầu: F khi chuẩn hóa cột từ 0,9 – 2,0

Hệ số đối xứng thấp do hiện tượng mở rộng dải (doãng pic), nguyên nhân có thể do quá trình khuếch tán xoáy, khuếch tán dọc, hoặc quá trình chuyển khối không cân bằng [5], [9], [14]

1.3.2.5 Số đĩa lý thuyết N

Là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký:

N = 16 = 5,54

Trong đó: W: chiều rộng đo ở đáy pic

W1/2: chiều rộng đo ở nửa chiều cao pic

Nếu N quá nhỏ thì không có sự tách của các chất, nếu N quá lớn thì tR lớn, rửa giải tốn nhiều dung môi Theo thực tế, trong phân tích hầu hết các hỗn hợp mẫu, N nằm trong khoảng 3500 – 7500 là vừa đủ

Nếu gọi L là chiều dài của cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết được tính bằng công thức: H =

tRA , tRB: thời gian lưu hiệu lực của 2 pic liền kề nhau (của chất A và B)

WA, WB: độ rộng pic đo ở các đáy pic

W1/2A, W1/2B: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5 [5], [9], [14]

1.3.3 Các phương pháp định lượng bằng HPLC

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó

Có 4 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký là:

- Phương pháp chuẩn ngoại

- Phương pháp chuẩn nội

- Phương pháp thêm chuẩn

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Trong khuôn khổ khóa luận, chúng tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuản và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu chuẩn sẽ tính dược nồng độ chất trong mẫu thử Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm

 Chuẩn hóa 1 điểm: Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của

mẫu thử Tính nồng độ mẫu thử theo công thức: CX = CS

CX, CS: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn

SX, SS: diện tích pic của chất phân tích trong SKĐ mẫu thử và mẫu chuẩn

 Chuẩn hóa nhiều điểm: tiến hành theo các bước sau:

Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn Vẽ đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn Sử dụng khoảng tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác

định Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) pic với nồng độ của chất cần xác định: Y = a + bC

Trong đó: Y: diện tích pic (hoặc chiều cao)

a: giao điểm của đường chuẩn với trục tung

b: độ dốc của đường chuẩn

C: nồng độ của chất phân tích

Chú ý: Độ lớn của diện tích hoặc chiều cao pic mẫu thử phải nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn [5], [9], [14]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.1 Chất chuẩn

Chuẩn GF.HCl (hàm lượng: 99,89%, độ ẩm: 0,7%) do Viện kiểm

nghiệm thuốc trung ương cung cấp

2.1.1.2 Viên Aslem

Viên ngậm dưới lưỡi Aslem chứa GF.HCl (hàm lượng ghi nhãn 1mg), chế phấm do bộ môn Hóa sinh trường Đại học Dược Hà nội cung cấp Số lô:

012014, sản xuất ngày: 15/01/2014

2.1.2 Dung môi, hóa chất

- Methanol (MeOH) tinh khiết HPLC (Merck – Đức)

- Dikali hydrophosphat (PA), dung dịch H3PO4 85% (PA) (Merck – Đức)

- Nước cất 2 lần

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, máy móc

- Hệ thống máy HPLC – detector UV – DAD Agilent Technologies 1260 Infinitive (Mỹ) với phần mềm Agilent Chemstation for LC version B

- Máy siêu âm Sonorex super RK 106 (Đức)

- Máy ly tâm Hettich EBA 20 (Đức)

- Máy đo pH Mettler Toledo – seven easy S20 (Thụy Sĩ)

- Máy thử độ rã Erweka ZT4 (Đức)

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45 μm

- Cân phân tích Mettler Toledo (Thụy Sĩ) (d=0,01 mg)

- Các dụng cụ khác: Bình định mức 20 ml, 50ml, pipet, ống đong, cốc có

mỏ, lọ đựng mẫu sắc kí (vial)…

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thẩm định phương pháp định lượng viên ngậm dưới lưỡi Aslem bằng HPLC

Theo hướng dẫn chung thẩm định quy trình phân tích đối với chế phẩm định tính và định lượng [7], [27] chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp phân tích đã được lựa chọn với các chỉ tiêu:

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Thẩm định phương pháp định lượng viên ngậm dưới lưỡi Aslem bằng HPLC [7], [24], [27], [29]

2.3.1.1 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký

- Xác định tính thích hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính Ghi lại thời gian lưu

và diện tích pic của các lần sắc ký

- Yêu cầu: chênh lệch diện tích pic, tR giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) không lớn hơn 2%

2.3.1.2 Tính chọn lọc của phương pháp

- Tạo mẫu trắng với các thành phần tá dược tương tự như trong chế phẩm nhưng không có hoạt chất GF.HCl (mẫu placebo) Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký với các điều kiện như mẫu thử

- Yêu cầu: trên sắc ký đồ của mẫu placebo thu được, tại thời điểm xuất hiện pic của GF.HCl không được xuất hiện pic lạ

2.3.1.3 Tính tuyến tính và khoảng xác định

- Tiến hành xác lập mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ GF.HCl Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn GF.HCl có nồng độ tăng dần Tiến hành sắc ký, xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r

- Yêu cầu: đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị r

≥ 0,995

2.3.1.4 Độ chính xác

Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả sự thống nhất (mức độ phân tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mô tả

- Độ lặp lại (Độ chính xác trong cùng điều kiện định lượng): xác định độ lặp lại của phương pháp bằng cách tiến hành 6 phép thử song song trên một

mẫu chế phẩm Ghi sắc ký đồ, diện tích pic của hoạt chất Tính hàm lượng của GF trong mẫu thử Đánh giá sự phân tán số liệu dựa vào giá trị RSD Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD phải không lớn hơn 2%

- Độ chính xác khác ngày: Diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm được thực hiện ở các ngày khác nhau Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD trong ngày phải không lớn hơn 2% và trong 2 ngày phải không lớn hơn 3%

2.3.1.5 Độ đúng của phương pháp

- Xác định độ đúng của phương pháp bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu placebo Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với khoảng 80%, 100%, 120% lượng hoạt chất có trong mẫu thử (đảm bảo nồng độ ở trong khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng) Ở mỗi nồng độ, tiến hành với 3 lần thử nghiệm riêng biệt

- Tính tỷ lệ thu hồi của GF.HCl chuẩn thêm vào mẫu thử

- Yêu cầu: tỷ lệ thu hồi đạt 98,0% – 102,0%

2.3.2 Xây dựng tiêu chuẩn kĩ thuật và phương pháp đánh giá chất lượng viên ngậm dưới lưỡi Aslem

2.3.2.3 Độ đồng đều khối lượng

Tiến hành theo chuyên luận “Phép thử độ đồng đều khối lượng” DĐVN

IV (Phụ lục 11.3)

Yêu cầu: Không được có quá 2 đơn vị có khối lượng nằm ngoài giới hạn chênh lệch (tùy vào KLTB viên ta xác định được giới hạn cho phép theo Bảng 11.3.1 DĐVN IV) so với khối lượng trung bình và không được có đơn vị nào

có khối lượng vượt gấp đôi giới hạn đó [6]

2.3.2.4 Độ rã

Thử độ rã theo chuyên luận “Phép thử độ rã của viên nén và nang” DĐVN IV (Phụ lục 11.6) Thuốc được coi là rã khi đáp ứng một trong các yêu cầu sau:

- Không còn cắn trên mặt lưới

- Nếu còn cắn, đấy là khối mềm không có màng nhận thấy rõ, không có nhân khô

Yêu cầu: Mẫu thử đạt yêu cầu nếu tất cả 6 viên đều rã Đối với viên ngậm thời gian rã không quá 15 phút [6]

từ 85% đến 115% của HLTB Nếu có 1 đơn vị có hàm lượng nằm ngoài giới hạn từ 85% đến 115% của HLTB, thử lại trên 20 đơn vị khác lẫy ngẫu nhiên Chế phẩm đạt yêu cầu nếu có không quá 1 trong tổng số 30 đơn vị đem thử có hàm lượng nằm ngoài giới hạn từ 85% đến 115% và không có đơn vị nào có hàm lượng nằm ngoài giới hạn từ 75% đến 125% của HLTB [6]

2.3.2.6 Định lượng

Xác định hàm lượng GF.HCl theo phương pháp HPLC đã thẩm định Tính toán hàm lượng phần trăm của GF.HCl so với hàm lượng ghi trên nhãn Tính hàm lượng GF.HCl trong chế phẩm dựa vào diện tích pic của GF.HCl trong sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn

Yêu cầu: Hàm lượng trung bình của GF.HCl nằm trong khoảng 90% - 110% [6]

2.3.3 Tính toán và xử lý số liệu

- Đối với chỉ tiêu định lượng: Hàm lượng GF.HCl so với lượng ghi trên nhãn được tính bằng phương pháp so sánh với chuẩn có nồng độ tương đương (phương pháp chuẩn hóa một điểm) Công thức tính:

%Hàm lượng = mC × H × (1 – w) ×

×

̅ × 100%

ft, fc: hệ số pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn

̅ (mg): khối lượng trung bình viên ngậm dưới lưỡi Aslem

B: hàm lượng GF.HCl ghi trên nhãn

- Đối với chỉ tiêu độ đồng đều hàm lượng: Hàm lượng GF.HCl so với lượng ghi trên nhãn được tính bằng phương pháp so sánh với chuẩn có nồng

độ tương đương (phương pháp chuẩn hóa một điểm) Công thức tính:

%Hàm lượng = mC × H × (1 – w ) ×

×

- Số liệu được xử lý trên Microsoft Office Excel 2010

Một số công thức tính các giá trị thống kê

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN

3.1.1.2 Dung dịch chuẩn GF.HCl

Lấy chính xác 2 ml dung dịch chuẩn gốc GF.HCl vào bình định mức 20

ml, thêm MeOH tới vạch, lắc đều Được dung dịch chuẩn có nồng độ GF.HCl

là 50 μg/ml

3.1.2 Mẫu thử

3.1.2.1 Dung dịch thử dùng trong định lượng

Cân chính xác 20 viên Aslem, khối lượng trung bình là 119,59 mg Nghiền mịn Cân chính xác khoảng 119 mg bột viên vào bình định mức 20

ml, thêm khoảng 15 ml MeOH, lắc đều trong 1 phút, siêu âm 15 phút, định mức bằng MeOH đến vạch, lắc đều Ly tâm 5500 vòng/phút trong 10 phút Lấy phần dịch trong lọc qua màng lọc 0,45 μm

3.1.2.2 Dung dịch thử dùng trong đánh giá độ đồng đều hàm lượng

Cho 1 viên vào bình định mức 20 ml Làm ẩm viên với khoảng 1 ml nước Thêm khoảng 15 ml MeOH, lắc đều trong 1 phút, siêu âm 15 phút, định mức bằng MeOH đến vạch, lắc đều Ly tâm 5500 vòng/phút trong 10 phút Lấy phần dịch trong lọc qua màng lọc 0,45 μm

3.1.2.3 Dung dịch placebo

Cân 20 viên placebo, khối lượng trung bình là 93,505 mg Nghiền mịn Cân chính xác khoảng 93 mg vào bình định mức 20 ml, thêm khoảng 15 ml MeOH, lắc đều trong 1 phút, siêu âm 15 phút, định mức bằng MeOH đến vạch, lắc đều Ly tâm 5500 vòng/phút trong 10 phút Lấy dịch trong lọc qua

màng lọc 0,45μm

3.2 LỰA CHỌN DUNG MÔI PHA MẪU VÀ ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ

3.2.1 Lựa chọn dung môi pha mẫu

Quá trình pha mẫu cần đảm bảo nhanh chóng, thuận tiện, đặt biệt là hòa tan tốt hoạt chất Dựa vào tính tan của GF.HCl tan tốt trong MeOH, mặt khác, MeOH là dung môi thông dụng và bảo quản mẫu tốt, chúng tôi tiến hành pha GF.HCl chuẩn trong MeOH Kết quả nhận thấy GF.HCl tan tốt, nhanh Vì vậy chúng tôi đã lựa chọn MeOH làm dung môi pha mẫu

3.2.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký

Chúng tôi tiến hành quét phổ GF.HCl cho kết quả như hình 3.1

Trên phổ hấp thụ cho thấy GF.HCl có một đỉnh hấp thụ ở 200 nm Để hạn chế ảnh hưởng của dung môi tới kết quả phân tích khi tiến hành sắc ký, chúng tôi quyết định chọn bước sóng phát hiện ở 204 nm

Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV của GF.HCl

Chúng tôi lựa chọn điều kiện sắc ký dựa trên khảo sát thực tế và nghiên cứu của các tác giả đã công bố [2] Qua quá trình khảo sát, nhận thấy pic của GF.HCl sắc nét, cân đối và có thời gian phân tích phù hợp Vậy chúng tôi lựa chọn điều kiện sắc ký như sau:

- Cột sắc ký: Zorbax Eclipse XDB C18 (150 × 4,6 mm; 5 μm), nhiệt độ

cột 24°C

- Pha động: Methanol – dung dịch dikali hydrophosphat 20 mM pH

7,0 (80 : 20), trộn đều, lọc qua màng lọc có đường kính lỗ lọc 0,45

μm

- Bước sóng phát hiện: 204 nm

- Lưu lượng dòng: 1,0 ml/phút

- Thể tích tiêm: 20 μl

Dung dịch đệm K2HPO4 20 mM pH 7,0 được pha như sau: hòa tan 1,74

g dikali hydrophosphat trong 400 ml nước cất 2 lần, điều chỉnh pH về 7,0 bằng dung dịch acid phosphoric 85% Pha loãng với nước cất 2 lần vừa đủ

500 ml

3.3 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP

3.3.1 Độ phù hợp của hệ thống

Pha mẫu chuẩn GF.HCl như mục 3.1.1.2 Tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch trên Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của GF.HCl Kết quả được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 : Kết quả độ phù hợp hệ thống sắc ký

STT t R

( phút)

S (mAU.s)

Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy độ lệch chuẩn tương đối RSD%

của thời gian lưu, diện tích pic của GF.HCl đều nằm trong khoảng cho phép (< 2%) Điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký phù hợp cho việc định lượng GF.HCl

3.3.2 Độ chọn lọc

Để chứng minh sự có mặt của tá dược không ảnh hưởng tới quá trình phân tích hoạt chất, chúng tôi chuẩn bị các mẫu:

- Mẫu chuẩn: Chuẩn bị như mục 3.1.1.2

- Mẫu placebo: Chuẩn bị như mục 3.1.2.3

- Mẫu MeOH: Lấy dung môi MeOH lọc qua màng lọc 0,45μm

Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu trên theo điều kiện sắc ký đã chọn Kết quả trình bày ở hình 3.2

Hình 3.2: Kết quả khảo sát đánh giá độ chọn lọc

a Mẫu placebo b Mẫu MeOH c GF.HCl chuẩn

Nhận xét: Trên các sắc kí đồ thu được, tại thời điểm ứng với thời gian

lưu của GF.HCl trên mẫu chuẩn, thì sắc ký đồ của mẫu trắng (mẫu placebo và

mẫu MeOH) không xuất hiện pic nào Vậy phương pháp có tính chọn lọc cao

3.3.3 Độ tuyến tính

Với mục tiêu xây dựng phương pháp có khoảng tuyến tính đủ rộng để đánh giá chỉ tiêu trong định lượng, xác định hàm lượng, chúng tôi tiến hành xây dựng khoảng nồng độ từ 50% đến 150% nồng độ dự định sử dụng khi tiến hành đối với chỉ tiêu định lượng

Chuẩn bị 5 bình định mức 20 ml Từ dung dịch chuẩn gốc GF.HCl, pha các dung dịch chuẩn có nồng độ GF.HCl dự kiến từ 25-75 μg/ml

Cách pha được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2: Pha dãy chuẩn chạy độ tuyến tính

Tiến hành sắc ký lần lượt từng dung dịch chuẩn và ghi lại diện tích pic

Từ đó xác định mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic của GF.HCl với nồng độ Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.2; 3.3

Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích và nồng

độ GF.HCl

Nhận xét: Kết quả trên cho thấy, trong khoảng nồng độ đã khảo sát của

GF.HCl, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic với nồng độ,

hệ số hồi quy tuyến tính (r) là 0,9999

3.3.4 Độ chính xác

3.3.4.1 Độ lặp lại

Chuẩn bị mẫu: Thực hiện như đối với chuẩn bị dung dịch thử đánh giá chỉ tiêu định lượng ở mục 3.1.2.1 Tiến hành với 6 lần phân tích riêng biệt từ cùng một mẫu bột viên Kết quả thể hiện ở bảng 3.4

y = 11,200x + 2,254

r = 0,9999

0 100

Bảng 3.4: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp

Nhận xét: Trong điều kiện sắc ký đã chọn, độ lệch chuẩn tương đối của 6

lần phân tích độc lập đối với GF.HCl trong viên có kết quả nhỏ hơn 2% Như vậy phương pháp có độ lặp lại tốt

b Độ chính xác trung gian

Tiến hành xác định hàm lượng GF.HCl trong mẫu thử ở ngày khác Tiến hành tương tự như xác định độ lặp lại với 6 mẫu độc lập nhưng ở ngày phân tích khác Độ chính xác khác ngày của GF.HCl trong mẫu thử được đánh giá

trên 12 mẫu trong 2 ngày khác nhau và kết quả được trình bày ở bảng 3.5

Bảng 3.5: Kết quả đánh giá độ chính xác khác ngày của phương pháp

STT Khối lượng cân (mg) S pic

(mAU.s)

Hàm lượng so với nhãn (%)

GF.HCl chuẩn: Sc = 561,089 mAU.s; mc = 25,29 mg

Để so sánh giá trị trung bình của hàm lượng GF.HCl trong 2 ngày, chúng tôi sử dụng hàm t-test trên phần mềm Microsoft office Excel 2010 Kết quả giá trị p-value = 0,67 > 0,05 cho thấy sự khác biệt về hàm lượng giữa kết quả của hai ngày là không có ý nghĩa thống kê

Nhận xét: Độ chính xác trung gian đạt trong khoảng giới hạn (<3%), cho

thấy phương pháp có độ lặp lại giữa các ngày khác nhau tốt

Như vậy phương pháp đã chọn có độ chính xác cao, đạt yêu cầu cho phép định lượng hoạt chất