3.2.1. Lựa chọn dung môi pha mẫu
Quá trình pha mẫu cần đảm bảo nhanh chóng, thuận tiện, đặt biệt là hòa tan tốt hoạt chất. Dựa vào tính tan của GF.HCl tan tốt trong MeOH, mặt khác, MeOH là dung môi thông dụng và bảo quản mẫu tốt, chúng tôi tiến hành pha GF.HCl chuẩn trong MeOH. Kết quả nhận thấy GF.HCl tan tốt, nhanh. Vì vậy chúng tôi đã lựa chọn MeOH làm dung môi pha mẫu.
3.2.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký
Chúng tôi tiến hành quét phổ GF.HCl cho kết quả nhƣ hình 3.1.
Trên phổ hấp thụ cho thấy GF.HCl có một đỉnh hấp thụ ở 200 nm. Để hạn chế ảnh hƣởng của dung môi tới kết quả phân tích khi tiến hành sắc ký, chúng tôi quyết định chọn bƣớc sóng phát hiện ở 204 nm.
Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV của GF.HCl.
Chúng tôi lựa chọn điều kiện sắc ký dựa trên khảo sát thực tế và nghiên cứu của các tác giả đã công bố [2]. Qua quá trình khảo sát, nhận thấy pic của GF.HCl sắc nét, cân đối và có thời gian phân tích phù hợp. Vậy chúng tôi lựa chọn điều kiện sắc ký nhƣ sau:
- Cột sắc ký: Zorbax Eclipse XDB C18 (150 × 4,6 mm; 5 μm), nhiệt độ cột 24°C.
- Pha động: Methanol – dung dịch dikali hydrophosphat 20 mM pH 7,0 (80 : 20), trộn đều, lọc qua màng lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 μm.
- Bước sóng phát hiện: 204 nm.
- Lưu lượng dòng: 1,0 ml/phút.
- Thể tích tiêm: 20 μl.
Dung dịch đệm K2HPO4 20 mM pH 7,0 đƣợc pha nhƣ sau: hòa tan 1,74 g dikali hydrophosphat trong 400 ml nƣớc cất 2 lần, điều chỉnh pH về 7,0 bằng dung dịch acid phosphoric 85%. Pha loãng với nƣớc cất 2 lần vừa đủ 500 ml.
3.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 3.3.1. Độ phù hợp của hệ thống 3.3.1. Độ phù hợp của hệ thống
Pha mẫu chuẩn GF.HCl nhƣ mục 3.1.1.2. Tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch trên. Ghi lại thời gian lƣu và diện tích pic của GF.HCl. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1 : Kết quả độ phù hợp hệ thống sắc ký. STT tR ( phút) S (mAU.s) 1 4,780 565,592 2 4,779 572,816 3 4,776 572,850 4 4,773 565,655 5 4,771 573,894 6 4,776 572,701 Trung bình 4,774 570,585 RSD% 0,10 0,68
Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD% của thời gian lƣu, diện tích pic của GF.HCl đều nằm trong khoảng cho phép (< 2%). Điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký phù hợp cho việc định lƣợng GF.HCl.
3.3.2. Độ chọn lọc
Để chứng minh sự có mặt của tá dƣợc không ảnh hƣởng tới quá trình phân tích hoạt chất, chúng tôi chuẩn bị các mẫu:
- Mẫu chuẩn: Chuẩn bị nhƣ mục 3.1.1.2 - Mẫu placebo: Chuẩn bị nhƣ mục 3.1.2.3
Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu trên theo điều kiện sắc ký đã chọn. Kết quả trình bày ở hình 3.2.
Hình 3.2: Kết quả khảo sát đánh giá độ chọn lọc a. Mẫu placebo b. Mẫu MeOH c. GF.HCl chuẩn
a. b. c. GF.HCl GF.HCl GF.HCl
Nhận xét: Trên các sắc kí đồ thu đƣợc, tại thời điểm ứng với thời gian
lƣu của GF.HCl trên mẫu chuẩn, thì sắc ký đồ của mẫu trắng (mẫu placebo và mẫu MeOH) không xuất hiện pic nào. Vậy phƣơng pháp có tính chọn lọc cao.
3.3.3. Độ tuyến tính
Với mục tiêu xây dựng phƣơng pháp có khoảng tuyến tính đủ rộng để đánh giá chỉ tiêu trong định lƣợng, xác định hàm lƣợng, chúng tôi tiến hành xây dựng khoảng nồng độ từ 50% đến 150% nồng độ dự định sử dụng khi tiến hành đối với chỉ tiêu định lƣợng.
Chuẩn bị 5 bình định mức 20 ml. Từ dung dịch chuẩn gốc GF.HCl, pha các dung dịch chuẩn có nồng độ GF.HCl dự kiến từ 25-75 μg/ml.
Cách pha đƣợc trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2: Pha dãy chuẩn chạy độ tuyến tính.
Dung dịch chuẩn C1 C2 C3 C4 C5
Chuẩn gốc
(ml) 1,0 1,5 2,0 2,5
3,0
MeOH Vừa đủ 20 ml
Tiến hành sắc ký lần lƣợt từng dung dịch chuẩn và ghi lại diện tích pic. Từ đó xác định mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích pic của GF.HCl với nồng độ. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.2; 3.3.
Hình 3.3: Sắc ký đồ khảo sát độ tuyến tính
Bảng 3.3: Kết qủa khảo sát độ tuyến tính của GF.HCl. Dung dịch C (μg/ml) S (mAU.s) C1 25,39 288,665 C2 38,09 427,777 C3 50,79 569,572 C4 63,48 711,498 C5 76,18 857,821
Phƣơng trình hồi quy y = 11,200x + 2,254
Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích và nồng độ GF.HCl.
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy, trong khoảng nồng độ đã khảo sát của
GF.HCl, có sự tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic với nồng độ, hệ số hồi quy tuyến tính (r) là 0,9999.
3.3.4. Độ chính xác
3.3.4.1. Độ lặp lại
Chuẩn bị mẫu: Thực hiện nhƣ đối với chuẩn bị dung dịch thử đánh giá chỉ tiêu định lƣợng ở mục 3.1.2.1. Tiến hành với 6 lần phân tích riêng biệt từ cùng một mẫu bột viên. Kết quả thể hiện ở bảng 3.4.
y = 11,200x + 2,254 r = 0,9999 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 GF.HCl Nồng độ (μg/ml) D iện t ích (m A U .s)
Bảng 3.4: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp. STT Khối lƣợng bột viên (mg) Spic (mAU.s) Hàm lƣợng so với nhãn (%) 1 120,21 572,419 101,61 2 118,84 555,836 99,81 3 118,05 543,779 98,29 4 118,84 555,836 99,81 5 119,17 560,665 100,39 6 118,13 546,420 98,70 Trung bình 100,13 RSD% 1,49 GF.HCl chuẩn: Sc = 560,343 mAU.s; mc = 25,20 mg.
Nhận xét: Trong điều kiện sắc ký đã chọn, độ lệch chuẩn tƣơng đối của 6
lần phân tích độc lập đối với GF.HCl trong viên có kết quả nhỏ hơn 2%. Nhƣ vậy phƣơng pháp có độ lặp lại tốt.
b. Độ chính xác trung gian
Tiến hành xác định hàm lƣợng GF.HCl trong mẫu thử ở ngày khác. Tiến hành tƣơng tự nhƣ xác định độ lặp lại với 6 mẫu độc lập nhƣng ở ngày phân tích khác. Độ chính xác khác ngày của GF.HCl trong mẫu thử đƣợc đánh giá trên 12 mẫu trong 2 ngày khác nhau và kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5: Kết quả đánh giá độ chính xác khác ngày của phƣơng pháp. STT Khối lƣợng cân (mg) Spic
(mAU.s) Hàm lƣợng so với nhãn (%) 1 118,92 558,193 100,39 2 118,63 548,274 98,84 3 119,15 551,307 98,96 4 119,01 560,559 100,74 5 118,59 549,857 99,16 6 120,03 565,724 100,80 Trung bình 99,81 RSD% 0,92 Tính chung 2 ngày TB: 99,970 RSD%:1,19 GF.HCl chuẩn: Sc = 561,089 mAU.s; mc = 25,29 mg.
Để so sánh giá trị trung bình của hàm lƣợng GF.HCl trong 2 ngày, chúng tôi sử dụng hàm t-test trên phần mềm Microsoft office Excel 2010. Kết quả giá trị p-value = 0,67 > 0,05 cho thấy sự khác biệt về hàm lƣợng giữa kết quả của hai ngày là không có ý nghĩa thống kê.
Nhận xét: Độ chính xác trung gian đạt trong khoảng giới hạn (<3%), cho
thấy phƣơng pháp có độ lặp lại giữa các ngày khác nhau tốt.
Nhƣ vậy phƣơng pháp đã chọn có độ chính xác cao, đạt yêu cầu cho phép định lƣợng hoạt chất.
3.3.5. Độ đúng
Đánh giá độ đúng theo phƣơng pháp thêm chuẩn trên nền mẫu placebo. Lƣợng chất chuẩn thêm vào ở 3 mức tƣơng đƣơng với 80%, 100%, 120% nồng độ định lƣợng. Mỗi mức nồng độ làm 3 mẫu độc lập.
Chuẩn bị mẫu:
Mẫu chuẩn gốc: Chuẩn bị 9 mẫu chuẩn gốc GF.HCl bằng cách cân
chính xác vào mỗi bình định mức 20 ml những lƣợng chất chuẩn sau:
- Khoảng 8 mg GF.HCl (80%).
- Khoảng 10 mg GF.HCl (100%).
- Khoảng 12 mg GF.HCl (120%). Thêm MeOH đến vạch, lắc đều.
Mẫu chạy sắc ký: Cân chính xác khoảng 93 mg bột viên placebo đã
nghiền mịn vào 9 bình định mức 20 ml, thêm khoảng 15 ml MeOH, lắc đều.
- Hút chính xác 2 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc cho tƣơng ứng vào các bình chứa placebo ở trên.
- Lắc đều, siêu âm 15 phút, định mức bằng MeOH đến vạch, lắc đều. Ly tâm 5500 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch trong lọc qua màng lọc 0,45 μm.
Tiến hành sắc ký các mẫu đã chuẩn bị. Ghi diện tích pic, tính % GF.HCl tìm lại, tính RSD%. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6: Kết quả thẩm định độ đúng của phƣơng pháp. Mức (%) Lƣợng thêm (mg) Spic (mAU.s) Tìm lại (mg) % Tìm lại 80 0,8104 447,078 0,7965 98,30 0,8005 446,012 0,7946 99,26 0,7836 432,816 0,7710 98,40 100 1,0038 557,479 0,9931 98,94 0,9899 559,204 0,9962 100,63 0,9770 545,452 0,9717 99,44 120 1,2151 678,272 1,2083 99,46 1,2200 689,917 1,2291 100,74 1,2052 667,441 1,1890 98,66 Trung bình 99,31 RSD% 0,89 GF.HCl chuẩn: Sc = 559,912 mAU.s; mc = 25,14 mg.
Nhận xét: Kết quả cho thấy phƣơng pháp có độ đúng cao với tỷ lệ tìm lại
từ 98,30% - 100,74 %, đáp ứng yêu cầu về độ đúng của phƣơng pháp.
Nhận xét chung:
Phƣơng pháp đƣợc thẩm định phù hợp hệ thống phân tích, có tính chọn lọc cao, khoảng tuyến tính rộng (25,39 – 76,18 μg/ml). Phƣơng pháp có thể đƣợc ứng dụng để đánh giá các chỉ tiêu về hàm lƣợng của chế phẩm viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem 1 mg.
3.4. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN VÀ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG VIÊN NGẬM DƢỚI LƢỠI ASLEM 1 mg
3.4.1. Tính chất
Phƣơng pháp thử: bằng cảm quan. Quan sát viên bằng mắt thƣờng dƣới ánh sáng tự nhiên. Kết quả: Viên nén không bao, màu trắng ngà.
Tiêu chuẩn về chỉ tiêu “tính chất” là: viên nén không bao, màu trắng ngà.
3.4.2. Định tính
Pha mẫu chuẩn và thử nhƣ mục 3.1.1.2 và 3.1.2.1. Tiến hành sắc ký 2 mẫu đã chuẩn bị, kết quả trình bày ở hình 3.5.
Hình 3.5. Sắc ký đồ định tính. a. Mẫu chuẩn b. Mẫu thử
b. a.
GF.HCl
GF.HCl
Tiêu chuẩn về chỉ tiêu “định tính” là: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử có một pic có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn.
Nhận xét: tR của mẫu thử và mẫu chuẩn đều bằng 4,77 do đó kết luận: chế phẩm cho phản ứng dƣơng tính của GF.HCl.
3.4.3. Độ đồng đều khối lƣợng
Phƣơng pháp thử: thử theo chuyên luận “Phép thử độ đồng đều khối lƣợng” của Dƣợc điển Việt Nam IV (Phụ lục 11.3).
Cân riêng biệt 20 đơn vị lấy ngẫu nhiên, tính khối lƣợng trung bình (KLTB). Kết quả xác định độ đồng đều khối lƣợng đƣợc trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.7: Kết quả đánh giá độ đồng đều khối lƣợng Viên Khối lƣợng viên (mg) Chênh lệch với KLTB (%) Viên Khối lƣợng viên (mg) Chênh lệch với KLTB (%) 1 118,9 - 0,58 11 118,2 - 1,16 2 120,1 0,43 12 119,0 - 0,49 3 120,2 0,51 13 119,8 0,18 4 120,6 0,84 14 120,4 0,67 5 120,5 0,76 15 120,0 0,34 6 118,3 - 1,08 16 121,0 1,18 7 118,1 - 1,25 17 118,2 - 1,16 8 118,3 - 1,08 18 119,6 0,01 9 119,7 0,09 19 121,0 1,18 10 119,5 - 0,08 20 120,4 0,68 KLTB = 119,59 mg
Vì chế phẩm có khối lƣợng trung bình viên lớn hơn 80 mg và nhỏ hơn 250 mg, theo quy định của DĐVN IV (phụ lục 11.3), % chênh lệch của của viên so với KLTB đƣợc quy định là 7,5%.
Tiêu chuẩn về chỉ tiêu “Độ đồng đều khối lượng” là: Khối lượng từng viên chênh lệch so với khối lượng trung bình viên không quá 7,5% (KLTB ± 7,5%).
Nhận xét: chế phẩm đạt yêu cầu về độ đồng đều khối lƣợng.
3.4.4. Độ rã.
Môi trƣờng thử: nƣớc.
Tiến hành: Cho môi trƣờng thử vào cốc. Vận hành máy điều nhiệt để nhiệt độ của môi trƣờng thử ở 37°C ± 0,5°C. Cho vào mỗi ống thử một viên thuốc, đậy đĩa chất dẻo, thử với 6 viên. Nhúng thiết bị vào trong cốc đựng chất lỏng, vận hành thiết bị và quan sát.
Kết quả: Thời gian rã của viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem 1 mg là 26 giây.
Tiêu chuẩn về chỉ tiêu “Độ rã” là: Thời gian rã không quá 3 phút.
Nhận xét: Chế phẩm đạt yêu cầu về độ rã.
3.4.5. Độ đồng đều hàm lƣợng
Chuẩn bị mẫu nhƣ mục 3.1.2.2. Thực hiện với 10 viên độc lập. Tiến hành sắc ký lần lƣợt 10 mẫu đã chuẩn bị, ghi lại diện tích pic. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3.8: Kết quả đánh giá độ đồng đều hàm lƣợng Viên Diện tích pic
(mAU.s) Hàm lƣợng so với nhãn (%) % chênh lệch trung bình 1 556,463 98,50 - 2,01 2 565,544 100,11 - 0,41 3 577,880 102,29 1,76 4 556,782 98,56 - 1,95 5 567,429 100,44 - 0,08 6 566,439 100,27 - 0,25 7 587,148 103,93 3,39 8 575,869 101,94 1,41 9 564,696 99,96 - 0,56 10 560,536 99,22 - 1,29 HLTB 100,52 GF.HCl chuẩn: Sc = 570,434 mAU.s; mc = 25,45 mg.
Tiêu chuẩn đề ra về “Độ đồng đều hàm lƣợng” theo tiêu chuẩn DĐVN IV (phụ lục 11.2 đối với viên nén) nhƣ đã trình bày ở mục 2.3.2.5.
Nhận xét: Hàm lƣợng của GF.HCl nằm trong khoảng giới hạn cho phép. Nhƣ vậy chế phẩm Aslem đạt độ đồng đều hàm lƣợng.
3.4.6. Định lƣợng
Chuẩn bị mẫu nhƣ ở mục 3.1.2.1, làm 3 mẫu.
Tiến hành sắc ký, ghi lại diện tích pic, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.9: Kết quả định lƣợng GF.HCl trong viên Aslem Mẫu số Khối lƣợng bột (mg) Diện tích pic (mAU.s) Hàm lƣợng so với nhãn (%) 1 118,63 548,274 98,84 2 119,01 560,559 100,74 3 118,59 549,857 99,16 Trung bình ± SD 99,58 ± 1,01 GF.HCl chuẩn: Sc = 561,089 mAU.s; mc = 25,29 mg.
Vì chế phẩm có hàm lƣợng GF.HCl trong một viên nhỏ hơn 50 mg nên theo quy định của DĐVN IV giới hạn cho phép về hàm lƣợng là chênh lệch không quá 10% hàm lƣợng ghi trên nhãn.
Tiêu chuẩn về chỉ tiêu “Định lượng” là: Hàm lượng Glycyl funtumin hydroclorid phải đạt từ 90,0% - 110,0% hàm lượng ghi trên nhãn.
Nhận xét: Hàm lƣợng của GF.HCl nằm trong khoảng giới hạn cho phép. Nhƣ vậy chế phẩm Aslem đạt yêu cầu về chỉ tiêu định lƣợng.
Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở và Phiếu kiểm nghiệm viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem 1mg đƣợc trình bày ở phụ lục 1.
BÀN LUẬN
Aslem (Glycyl funtumin hydroclorid) là một thuốc kích thích miễn dịch hoàn toàn do các nhà khoa học Việt Nam nghiên cứu và phát triển trong hơn 50 năm. Sau khi đƣợc lƣu hành trên thị trƣờng dƣới dạng thuốc tiêm từ năm 2002, thuốc Aslem đã đáp ứng đƣợc một phần nhu cầu trong việc điều trị bổ trợ cho các bệnh nhân ung thƣ, cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu lâm sàng khẳng định tác dụng của Aslem trên các đối tƣợng ung thƣ khác nhau. Để tiếp nối thành công đó và góp phần tạo ra một chế phẩm mới tiện dùng và hiệu quả hơn, chế phẩm viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem 1 mg đã và đang đƣợc nghiên cứu thử nghiệm. Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem đáp ứng nhu cầu từ thực tế nhằm kiểm tra chất lƣợng và góp phần xây dựng hồ sơ đăng kí thuốc cho chế phẩm.
Trong cấu trúc phân tử của GF.HCl không có nhóm mang màu (nối đôi liên hợp, nhân thơm…) nên để xác định hàm lƣợng của GF.HCl trong nguyên liệu cũng nhƣ thành phẩm bằng phƣơng pháp đo quang phổ tử ngoại khả kiến nhƣ trong tiêu chuẩn cơ sở đã xây dựng, phải tiến hành phản ứng tạo cặp ion với thuốc thử Heliantin sau đó chiết bằng cloroform [15]. Phƣơng pháp này phải qua nhiều giai đoạn, tốn thời gian và phải tiếp xúc với dung môi độc hại nhƣ cloroform. Để khắc phục các nhƣợc điểm đó các tác giả [2] đã xây dựng phƣơng pháp định lƣợng GF.HCl trong nguyên liệu bằng HPLC với detertor UV, phƣơng pháp đơn giản, có độ thu hồi cao, khoảng tuyến tính 0,05-0,25 mg/ml nên thích hợp để định lƣợng GF.HCl trong nguyên liệu và có thể ứng dụng trong kiểm nghiệm chế phẩm (không yêu cầu định lƣợng ở nồng độ thấp nhƣ các phƣơng pháp định lƣợng GF trong huyết tƣơng đã xây dựng [13], [17], [19], [23]).
Vì thế chúng tôi đã xây dựng và thẩm định phƣơng pháp HPLC dựa theo những quy định hiện hành [7], [27] để tiến hành định lƣợng GF.HCl trong viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem 1 mg.