Phƣơng pháp thử: bằng cảm quan. Quan sát viên bằng mắt thƣờng dƣới ánh sáng tự nhiên. Kết quả: Viên nén không bao, màu trắng ngà.
Tiêu chuẩn về chỉ tiêu “tính chất” là: viên nén không bao, màu trắng ngà.
3.4.2. Định tính
Pha mẫu chuẩn và thử nhƣ mục 3.1.1.2 và 3.1.2.1. Tiến hành sắc ký 2 mẫu đã chuẩn bị, kết quả trình bày ở hình 3.5.
Hình 3.5. Sắc ký đồ định tính. a. Mẫu chuẩn b. Mẫu thử
b. a.
GF.HCl
GF.HCl
Tiêu chuẩn về chỉ tiêu “định tính” là: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử có một pic có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn.
Nhận xét: tR của mẫu thử và mẫu chuẩn đều bằng 4,77 do đó kết luận: chế phẩm cho phản ứng dƣơng tính của GF.HCl.
3.4.3. Độ đồng đều khối lƣợng
Phƣơng pháp thử: thử theo chuyên luận “Phép thử độ đồng đều khối lƣợng” của Dƣợc điển Việt Nam IV (Phụ lục 11.3).
Cân riêng biệt 20 đơn vị lấy ngẫu nhiên, tính khối lƣợng trung bình (KLTB). Kết quả xác định độ đồng đều khối lƣợng đƣợc trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.7: Kết quả đánh giá độ đồng đều khối lƣợng Viên Khối lƣợng viên (mg) Chênh lệch với KLTB (%) Viên Khối lƣợng viên (mg) Chênh lệch với KLTB (%) 1 118,9 - 0,58 11 118,2 - 1,16 2 120,1 0,43 12 119,0 - 0,49 3 120,2 0,51 13 119,8 0,18 4 120,6 0,84 14 120,4 0,67 5 120,5 0,76 15 120,0 0,34 6 118,3 - 1,08 16 121,0 1,18 7 118,1 - 1,25 17 118,2 - 1,16 8 118,3 - 1,08 18 119,6 0,01 9 119,7 0,09 19 121,0 1,18 10 119,5 - 0,08 20 120,4 0,68 KLTB = 119,59 mg
Vì chế phẩm có khối lƣợng trung bình viên lớn hơn 80 mg và nhỏ hơn 250 mg, theo quy định của DĐVN IV (phụ lục 11.3), % chênh lệch của của viên so với KLTB đƣợc quy định là 7,5%.
Tiêu chuẩn về chỉ tiêu “Độ đồng đều khối lượng” là: Khối lượng từng viên chênh lệch so với khối lượng trung bình viên không quá 7,5% (KLTB ± 7,5%).
Nhận xét: chế phẩm đạt yêu cầu về độ đồng đều khối lƣợng.
3.4.4. Độ rã.
Môi trƣờng thử: nƣớc.
Tiến hành: Cho môi trƣờng thử vào cốc. Vận hành máy điều nhiệt để nhiệt độ của môi trƣờng thử ở 37°C ± 0,5°C. Cho vào mỗi ống thử một viên thuốc, đậy đĩa chất dẻo, thử với 6 viên. Nhúng thiết bị vào trong cốc đựng chất lỏng, vận hành thiết bị và quan sát.
Kết quả: Thời gian rã của viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem 1 mg là 26 giây.
Tiêu chuẩn về chỉ tiêu “Độ rã” là: Thời gian rã không quá 3 phút.
Nhận xét: Chế phẩm đạt yêu cầu về độ rã.
3.4.5. Độ đồng đều hàm lƣợng
Chuẩn bị mẫu nhƣ mục 3.1.2.2. Thực hiện với 10 viên độc lập. Tiến hành sắc ký lần lƣợt 10 mẫu đã chuẩn bị, ghi lại diện tích pic. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3.8: Kết quả đánh giá độ đồng đều hàm lƣợng Viên Diện tích pic
(mAU.s) Hàm lƣợng so với nhãn (%) % chênh lệch trung bình 1 556,463 98,50 - 2,01 2 565,544 100,11 - 0,41 3 577,880 102,29 1,76 4 556,782 98,56 - 1,95 5 567,429 100,44 - 0,08 6 566,439 100,27 - 0,25 7 587,148 103,93 3,39 8 575,869 101,94 1,41 9 564,696 99,96 - 0,56 10 560,536 99,22 - 1,29 HLTB 100,52 GF.HCl chuẩn: Sc = 570,434 mAU.s; mc = 25,45 mg.
Tiêu chuẩn đề ra về “Độ đồng đều hàm lƣợng” theo tiêu chuẩn DĐVN IV (phụ lục 11.2 đối với viên nén) nhƣ đã trình bày ở mục 2.3.2.5.
Nhận xét: Hàm lƣợng của GF.HCl nằm trong khoảng giới hạn cho phép. Nhƣ vậy chế phẩm Aslem đạt độ đồng đều hàm lƣợng.
3.4.6. Định lƣợng
Chuẩn bị mẫu nhƣ ở mục 3.1.2.1, làm 3 mẫu.
Tiến hành sắc ký, ghi lại diện tích pic, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.9: Kết quả định lƣợng GF.HCl trong viên Aslem Mẫu số Khối lƣợng bột (mg) Diện tích pic (mAU.s) Hàm lƣợng so với nhãn (%) 1 118,63 548,274 98,84 2 119,01 560,559 100,74 3 118,59 549,857 99,16 Trung bình ± SD 99,58 ± 1,01 GF.HCl chuẩn: Sc = 561,089 mAU.s; mc = 25,29 mg.
Vì chế phẩm có hàm lƣợng GF.HCl trong một viên nhỏ hơn 50 mg nên theo quy định của DĐVN IV giới hạn cho phép về hàm lƣợng là chênh lệch không quá 10% hàm lƣợng ghi trên nhãn.
Tiêu chuẩn về chỉ tiêu “Định lượng” là: Hàm lượng Glycyl funtumin hydroclorid phải đạt từ 90,0% - 110,0% hàm lượng ghi trên nhãn.
Nhận xét: Hàm lƣợng của GF.HCl nằm trong khoảng giới hạn cho phép. Nhƣ vậy chế phẩm Aslem đạt yêu cầu về chỉ tiêu định lƣợng.
Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở và Phiếu kiểm nghiệm viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem 1mg đƣợc trình bày ở phụ lục 1.
BÀN LUẬN
Aslem (Glycyl funtumin hydroclorid) là một thuốc kích thích miễn dịch hoàn toàn do các nhà khoa học Việt Nam nghiên cứu và phát triển trong hơn 50 năm. Sau khi đƣợc lƣu hành trên thị trƣờng dƣới dạng thuốc tiêm từ năm 2002, thuốc Aslem đã đáp ứng đƣợc một phần nhu cầu trong việc điều trị bổ trợ cho các bệnh nhân ung thƣ, cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu lâm sàng khẳng định tác dụng của Aslem trên các đối tƣợng ung thƣ khác nhau. Để tiếp nối thành công đó và góp phần tạo ra một chế phẩm mới tiện dùng và hiệu quả hơn, chế phẩm viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem 1 mg đã và đang đƣợc nghiên cứu thử nghiệm. Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem đáp ứng nhu cầu từ thực tế nhằm kiểm tra chất lƣợng và góp phần xây dựng hồ sơ đăng kí thuốc cho chế phẩm.
Trong cấu trúc phân tử của GF.HCl không có nhóm mang màu (nối đôi liên hợp, nhân thơm…) nên để xác định hàm lƣợng của GF.HCl trong nguyên liệu cũng nhƣ thành phẩm bằng phƣơng pháp đo quang phổ tử ngoại khả kiến nhƣ trong tiêu chuẩn cơ sở đã xây dựng, phải tiến hành phản ứng tạo cặp ion với thuốc thử Heliantin sau đó chiết bằng cloroform [15]. Phƣơng pháp này phải qua nhiều giai đoạn, tốn thời gian và phải tiếp xúc với dung môi độc hại nhƣ cloroform. Để khắc phục các nhƣợc điểm đó các tác giả [2] đã xây dựng phƣơng pháp định lƣợng GF.HCl trong nguyên liệu bằng HPLC với detertor UV, phƣơng pháp đơn giản, có độ thu hồi cao, khoảng tuyến tính 0,05-0,25 mg/ml nên thích hợp để định lƣợng GF.HCl trong nguyên liệu và có thể ứng dụng trong kiểm nghiệm chế phẩm (không yêu cầu định lƣợng ở nồng độ thấp nhƣ các phƣơng pháp định lƣợng GF trong huyết tƣơng đã xây dựng [13], [17], [19], [23]).
Vì thế chúng tôi đã xây dựng và thẩm định phƣơng pháp HPLC dựa theo những quy định hiện hành [7], [27] để tiến hành định lƣợng GF.HCl trong viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem 1 mg.
Trong quá trình lựa chọn điều kiện sắc ký, chúng tôi nhận thấy GF.HCl có một đỉnh hấp thụ ở 200 nm. Tuy nhiên ở bƣớc sóng này có thể tá dƣợc, dung môi ảnh hƣởng tới kết quả do đó chúng tôi quyết định lựa chọn bƣớc sóng phát hiện là 204 nm tƣơng tự nhƣ nghiên cứu đã công bố [2].
Theo quy định [7], [27] đối với quy trình phân tích định tính và định lƣợng cần phải đánh giá các chỉ tiêu: Độ đúng, độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian), độ chọn lọc, tính tuyến tính và khoảng xác định. Kết quả thẩm định phƣơng pháp cho thấy: pic của GF.HCl sắc nét và cân đối, thời gian phân tích ngắn (tR khoảng 5 phút). Phƣơng pháp có độ chính xác; độ đúng cao; khoảng tuyến tính rộng: 25,39-76,18 μg/ml và hệ số tƣơng quan hồi quy r = 0,9999 (thích hợp cho việc định lƣợng GF.HCl hàm lƣợng 1 mg trong chế phẩm).
Từ kết quả thẩm định phƣơng pháp thu đƣợc, chúng tôi tiến hành xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng cho viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem 1 mg dựa trên tiêu chuẩn của DĐVN IV đối với viên nén không bao dạng ngậm bao gồm các chỉ tiêu: tính chất, định tính, độ đồng đều khối lƣợng, độ rã, độ đồng đều hàm lƣợng và định lƣợng. Tiêu chuẩn định tính GF.HCl trong chế phẩm dựa vào thời gian lƣu là đại lƣợng rất đặc trƣng của các chất, chính xác, đơn giản và kinh tế hơn các phƣơng pháp phổ hồng ngoại, sắc ký lớp mỏng và phản ứng tạo màu nhƣ trong tiêu chuẩn cơ sở đang áp dụng. Tiêu chuẩn về độ rã của viên ngậm theo DĐVN IV áp dụng nhƣ viên nén không bao với yêu cầu thời gian rã không quá 15 phút. Chế phẩm viên ngậm dƣới lƣỡi cần phải rã nhanh để tăng tốc độ hấp thu và thoải mái cho ngƣời dùng, vì vậy chúng tôi áp dụng yêu cầu chỉ tiêu đối với độ rã là không quá 3 phút.
Từ tiêu chuẩn cơ sở đã xây dựng, chúng tôi tiến hành kiểm nghiệm mẫu viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem, kết quả cho thấy chế phẩm đạt tất cả các yêu cầu: tính chất, định tính, độ đồng đều khối lƣợng, độ rã (rã rất nhanh – 26 giây), độ đồng đều hàm lƣợng, định lƣợng. Hàm lƣợng GF.HCl trong viên là 99,58% nằm trong giới hạn 90,0% - 110,0% hàm lƣợng so với nhãn.
KẾT LUẬN
Từ kết quả thu đƣợc chúng tôi có kết luận sau:
1. Đã xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng Glycyl funtumin hydroclorid trong viên ngậm dưới lưỡi Aslem bằng HPLC với detector UV. Cụ thể là:
Điều kiện phân tích:
- Cột sắc ký: Zorbax Eclipse XDB C18 (150 × 4,6 mm; 5 μm), nhiệt độ cột 24°C.
- Pha động: Methanol – dung dịch dikali hydrophosphat 20 mM pH 7,0 (80 : 20), trộn đều, lọc qua màng lọc có đƣờng kính lỗ lọc 0,45 μm. - Bƣớc sóng phát hiện: 204 nm. - Lƣu lƣợng dòng: 1,0 ml/phút. - Thể tích tiêm: 20 μl. Kết quả thẩm định:
- Phƣơng pháp có độ đặc hiệu cao: Pic của GF.HCl sắc nét và cân đối, thời gian phân tích ngắn với tR khoảng 5 phút.
- Phƣơng pháp có độ đúng cao: 98,30% – 100,74%.
- Độ lặp lại có RSD = 1,49% < 2% và độ chính xác trung gian có RSD = 1,19% < 3%.
- Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 25,39-76,18 μg/ml cho hệ số tƣơng quan sát gần 1 (r = 0,9999)
2. Đã xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lượng chế phẩm viên ngậm dưới lưỡi Aslem 1 mg.
- Xây dựng đƣợc dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm viên ngậm dƣới lƣỡi Aslem với các chỉ tiêu: tính chất, định tính, độ rã, độ đồng đều khối lƣợng, độ đồng đều hàm lƣợng, định lƣợng.
- Kết quả kiểm tra chất lƣợng cho thấy viên đạt chỉ tiêu về tính chất; định tính; độ rã: 26 giây (cho phép ≤ 3 phút); độ đồng đều khối lƣợng: khối lƣợng viên chênh lệch từ -1,25% đến 1,18% KLTB (cho phép KLTB ± 7,5%); độ đồng đều hàm lƣợng: hàm lƣợng của GF.HCl nằm trong giới hạn từ 98,50% - 103,93% HLTB (cho phép từ 85% đến 115% HLTB), định lƣợng: hàm lƣợng GF.HCl trong chế phẩm đạt 99,58% (cho phép từ 90% đến 110% hàm lƣợng ghi trên nhãn).
ĐỀ XUẤT
Dựa vào những kết quả đã đạt đƣợc từ khóa luận, chúng tôi xin đƣa ra một vài đề xuất nhƣ sau:
1. Áp dụng dự thảo tiêu chuẩn cơ sở để kiểm tra chất lượng viên ngậm dưới lưỡi Aslem 1mg trong nghiên cứu độ ổn định.
2. Hoàn thiện và nộp hồ sơ đăng ký thuốc đối với chế phẩm, xin đăng ký lưu hành để đưa thuốc tới tay người tiêu dùng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Hoàng Anh và cộng sự (2004), "Hiệu quả điều trị miễn dịch bổ trợ bằng Aslem trong ung thƣ gan (tại bệnh viện Việt Đức giai đoạn 1991 - 2000)", Tạp chí Dược học, 11(343), tr. 12-15.
2. Nguyễn Thị Kiều Anh, Đào Kim Chi và cộng sự (2009), "Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp HPLC định lƣợng Glycyl funtumin hydroclorid", Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, 1(23), tr. 6-12.
3. Đào Thị Mai Anh (2003), Nghiên cứu ảnh hưởng của Aslem trên hệ thống enzym CY - P450 ở gan động vật thí nghiệm, Luận văn thạc sĩ
dƣợc học, Đại học Dƣợc Hà Nội.
4. Bộ Y tế (2011), Dược lâm sàng, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 130- 131.
5. Bộ Y tế (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, Hà nội, tr. 84-110.
6. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, Phụ lục 1.20; 11.2; 11.3; 11.4; 11.6.
7. Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn của Asean về thẩm định quy trình phân tích. Phụ lục 7 - Thông tư 22/2009/TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc.
8. Bộ Y tế (2008), Kỹ thuật bào chế và sinh dược học các dạng thuốc tập
II, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 185-186.
9. Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích tập 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 123-143.
10. Hoàng Minh Châu, Từ Văn Mạc, Từ Vọng Nghi (2007), Cơ sở hóa học
11. Đào Kim Chi (1984), Tổng hợp Funtumin, một số peptidyl funtumin và
thăm dò tác dụng kích thích không đặc hiệu của chúng, Luận án phó
tiến sĩ Dƣợc học, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
12. Đào Kim Chi và cộng sự (2005), Hoàn thiện quy trình sản xuất thuốc
tiêm Aslem điều hòa miễn dịch, Báo cáo tổng kết khoa học và kĩ thuật
của dự án KC10-DA13.
13. Nguyễn Thị Quỳnh Chi (2012), Định lượng Aslem bằng sắc ký lỏng - khối phổ ứng dụng trong nghiên cứu dược động học trên người tình nguyện, Khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ, Đại học Dƣợc Hà Nội.
14. Trần Tứ Hiếu và cộng sự (2007), Hóa học phân tích phần 2: Các phương pháp phân tích dụng cụ, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật,
Hà Nội, tr. 267-295, 372-376.
15. Phạm Gia Huệ, Lê Thị Hƣờng Hoa, Nguyễn Thúy Phƣơng (1993), "Nghiên cứu định lƣợng Glycyl Funtumin bằng phƣơng pháp đo quang", tạp chí Dược học, 3(218), tr. 20-23.
16. Tạ Mạnh Hùng (2011), "Bƣớc đầu nghiên cứu dƣợc động học của Glycyl Funtumin trên chó", Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, 2(32), tr. 14-
17.
17. Tạ Mạnh Hùng và cộng sự (2010), "Nghiên cứu xây dựng và thẩm định phƣơng pháp HPLC_MS/MS định lƣợng glycyl funtumin trong huyết tƣơng chó", tạp chí Dược học, 12(416), tr. 48-51.
18. Hoàng Kim Huyền, Đào Kim Chi (1992), "Khảo sát ảnh hƣởng của chế phẩm Aslem lên chức năng hệ tạo máu, gan thận và huyết áp", Tạp chí
Dược học, 1(214), tr. 28-30.
19. Lê Thị Thu Huyền (2011), Bước đầu nghiên cứu dược động học của glycyl funtumin trên động vật thí nghiệm bằng LC - MS/MS, Luận văn
20. Đỗ Tuấn Minh (2006), Bước đầu đánh giá tác dụng của phác đồ Fufol
+ Aslem trong điều trị bổ trợ sau phẫu thuật ung thư đại trực tràng,
Khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ Đại học Dƣợc Hà Nội.
21. Đỗ Hồng Quảng (2001), Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh
học của Methyonyl Glycyl - Funtumin, Luận văn thạc sĩ Dƣợc học,
trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
22. Đỗ Trọng Quyết (2010), Nghiên cứu điều trị ung thư dạ dày bằng phẫu
thuật có kết hợp hóa chất ELF và miễn dịch trị liệu ASLEM, Luận án
tiến sĩ Y học, trƣờng Đại học Y Hà Nội.
23. Phạm Nhƣ Quỳnh và cộng sự (2006), "Ứng dụng HPLC-MS để thiết lập các thông số Dƣợc động học của Glycyl Funtumin", tạp chí Dược học, 3(359), tr. 12-14.
24. Trần Cao Sơn - Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản khoa học và kĩ thuật, tr. 15-58.
25. Lê Quý Toản (2004), Bước đầu nghiên cứu tác dụng của Aslem lên đáp
ứng miễn dịch qua trung gian tế bào trong điều trị ung thư đường tiêu hóa, Khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
26. Nguyễn Quốc Triệu - Bộ trƣởng Bộ Y tế (2009), Qui hoạch phát triển
mạng lưới chống ung thư tại Việt Nam giao đoạn 2009 - 2020.
TIẾNG ANH
27. Asean (2009), "Guidelines for validation of analytical procedures". 28. British Pharmacopoeia 2008, Volume III, pp. 2366.