ĐỊnh tính, định lượng rutin trong cao đặc EZ và thăm dò tác dụng chống dị ứng

ĐẶT VẤN ĐỀ Me rừng (tên khoa học Phyllanthus emblica L. hay Emblica officinalis Gartn.) Trên thế giới, người ta đã tiến hành nhiều công trình nghiên cứu về loài này. Cụ thể, về thành phần hóa học, người ta đã phân lập từ cây Me rừng nhiều hợp chất như acid gallic, acid chebulinic, acid ascorbic, corilagin, geraniin và các chất khác 11. Về tác dụng dược lý, các chất này đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý như kháng khuẩn, chống viêm, giải độc do các gốc tự do và các bức xạ gây ra, đặc biệt chúng còn có tác dụng phòng chống một số dạng ung thư và kìm hãm sự phát triển của virus HIV (human immunodeficiency virus)6. Hiện nay, ở Ấn Độ và Trung Quốc, người ta đã thương mại hóa nhiều sản phẩm từ loài này như bột pha uống bổ sung vitamin C, mỹ phẩm chống lão hóa cho da. Trong khi đó, cây Me rừng ở Việt Nam là loài cây mọc hoang, có thể phát triển trong các vùng khí hậu khắc nghiệt, nắng nóng trên cả nước và đã được đưa vào trồng thử nghiệm 5. Trong dân gian, quả Me rừng được dùng làm nước giải khát, ngoài ra trong y học cổ truyền, nước sắc quả Me rừng được dùng làm vị thuốc chữa cảm mạo, viêm họng 1. Tuy nhiên, chúng lại chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học để có thể sử dụng trong điều trị theo y học hiện đại như thế giới. Do đó, nghiên cứu thành phần hóa học của cây Me rừng là nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về loài này. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học của quả Me rừng (Phyllanthus emblica L.)” với mục tiêu: “Nghiên cứu thành phần hóa học của quả Me rừng”.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HUYỀN ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG RUTIN TRONG CAO ĐẶC EZ VÀ THĂM DÒ TÁC DỤNG CHỐNG DỊ ỨNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI-2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HUYỀN ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG RUTIN TRONG CAO ĐẶC EZ VÀ THĂM DÒ TÁC DỤNG CHỐNG DỊ ỨNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn 1.PGS.TS. Nguyễn Mạnh Tuyển 2. BS. Lê Thị Minh Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Dược Cổ Truyền 2. Bộ môn Dược lý, Trường đại học Y Hà Nội 3. Viện kiểm nghiệm thuốc TW HÀ NỘI-2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Mạnh Tuyển, người thầy đã tận tính trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian hoàn thành khóa luận này. Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn BS. Lê Thị Minh, học viên Y dược học cổ truyền giúp đỡ tôi trong quá trình làm khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Phạm Thị Vân Anh, Trưởng bộ môn Dược lý trường đại học Y Hà Nội, DS. Lê Thị Duyên, khoa Mỹ Phẩm, Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương đã giúp đỡ tôi thực hiện các nghiên cứu trình bày trong khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên tại trường đại học Dược Hà Nội và bộ môn Dược lý, trường đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi cũng xin gửi tới các thây cô và cán bộ trường đại học Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành nhất vì đã dạy bảo tôi trong suốt năm năm học tập và nghiên cứu tại trường. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, người thân, bạn bè đã luôn ở bên tôi cỗ vũ, động viên và là chỗ dựa tinh thần cho tôi trong thời gian học tập và thực hiện khóa luận. Hà Nội, Ngày 14 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Huyền MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH ECZEMA 3 1.1.1. Bệnh eczema theo quan điểm Tây y 3 1.1.2. Bệnh eczema theo quan điểm Đông y 10 1.2. TỔNG QUAN VỀ BÀI THUỐC EZ 14 1.2.1. Tổng quan về bài thuốc 14 1.2.2. Tóm tắt đặc điểm của các vị thuốc 16 1.2.2.1. Kim ngân đằng (Caulis cum folium Lonicerae) 16 1.2.2.2. Núc nác (Cortex Oroxyli) 18 1.2.2.3. Hòe hoa (Flos Styphnolobii japonici imaturi) 20 1.2.2.4. Thương nhĩ tử (Fructus Xanthii strumarii) 22 1.2.2.5. Đơn lá đỏ (Folium Excoecariae) 24 1.2.2.6. Hoàng bá (Cortex Phellodendri) 25 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 27 2.1.NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 27 2.1.1.Nguyên liệu 27 2.1.2. Phương tiện nghiên cứu 27 2.2. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 28 2.2.1. Bào chế cao đặc EZ 28 2.2.2. Đính tính rutin trong cao đặc bằng phương pháp TLC 29 2.2.3. Định lượng rutin trong cao đặc bằng HPLC 29 2.2.4. Khảo sát tác dụng chống dị ứng của cao đặc EZ 30 2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu 32 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LU ẬN 34 3.1. BÀO CHẾ CAO ĐẶC TỪ BÀI THUỐC EZ 34 3.1.1. Sắc 34 3.1.2. Chiết bằng ethanol 35 3.2. ĐỊNH TÍNH RUTIN BẰNG TLC 37 3.3. ĐỊNH LƯỢNG RUTIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC 38 3.3.1. Xác định hàm ẩm cao đặc 38 3.3.2. Định lượng rutin bằng HPLC 39 3.3. NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG DỊ ỨNG CỦA CAO ĐẶC EZ 43 3.3.1. Chuẩn bị chế phẩm 43 3.3.2. Khảo sát tác dụng chống dị ứng bằng phương pháp gây shock phản vệ 44 3.3.3. Khảo sát tác dụng chống dị ứng bằng phương pháp gây ngứa 47 3.3.4. Khảo sát tác dụng chống dị ứng bằng mô hình gây viêm cấp tính trên chân chuột nhắt trắng 51 3.4.BÀN LUẬN 56 KẾT LUẬN VÀ Đ Ề XUẤT 64 TÀI LI ỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 74 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT AD Atopic dermatitis - viêm da cơ địa CC Cao cồn C 48/80 Compound 48/80 CN Cao nước DĐVN Dược điển Việt Nam ETC Thuốc bán theo đơn GĐ Giai đoạn HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao Methyl methylprednisolon NST Nhiễm sắc thể OTC Thuốc không kê đơn TT Thể trọng TLC Sắc ký lớp mỏng YHCT Y học cổ truyền DANH MỤC CÁC BẢNG tr ang Bảng 3.1: Kết quả xác định độ ẩm của cao cồn 39 Bảng 3.2: Kết quả xác định độ ẩm của cao nước 39 Bảng 3.3: Chế độ gradient dung môi định lượng rutin trong cao đặc EZ 41 Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra tính thích hợp hệ thống sắc ký lỏng 42 Bảng 3.5: Kết quả định lượng rutin trong mẫu cao cồn và cao nước EZ 43 Bảng 3.6: Tác dụng của cao EZ trên mô hình gây shock phản vệ 46 Bảng 3.7: Tác dụng của cao EZ trên mô hình gây ngứa 49 Bảng 3.8: Tác dụng của cao EZ trên mô hình gây viêm cấp tính 54 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ trang Hình 1.1. Cơ chế dị ứng cuả bệnh eczema 4 Hình 1.2. Vị thuốc Kim ngân đằng 74 Hình 1.3. Vị thuốc Núc nác 74 Hình 1.4. Vị thuốc Hòe hoa 74 Hình 1.5. Vị thuốc Thương nhĩ tử 74 Hình 1.6. Vị thuốc Đơn lá đỏ 75 Hình 1.7. Vị thuốc Hoàng bá 75 Hình 3.1: Sơ đồ bào chế cao đặc EZ bằng phương pháp chiết nước 34 Hình 3.2: Sơ đồ bào chế cao đặc EZ bằng phương pháp chiết ethanol 36 Hình 3.3: Sắc ký đồ rutin, cao cồn, cao nước ở 366nm và 254nm 38 Hình 3.4: Sắc ký đồ của rutin chuẩn 42 Hình 3.5: Sắc ký đồ của 3 mẫu cao nước 75-76 Hình 3.6: Sắc ký đồ của 3 mẫu cao cồn 76 Hình 3.7: Biểu đồ thể hiện tác dụng ức chế shock phản vệ 46 Hình 3.8: Biều đồ thể hiện tác dụng ức chế ngứa trong 20 phút 50 Hình 3.9: Biểu đồ thể hiện tác dụng ức chế phù chân chuột 55 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Eczema hay còn gọi là bệnh chàm là một bệnh da liễu thường gặp. Có nhiều giả thuyết về nguyên nhân gây bệnh, nhưng yếu tố cơ địa dị ứng đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh [19]. Là một bệnh da ngứa điển hình với đặc tính là hay tái phát, khó điều trị nên diễn biến dài, mang lại nhiều thống khổ cho người bệnh [3]. Cùng với sự phát triển của kinh tế, xã hội và công nghiệp kèm theo là sự gia tăng tình trạng ô nhiễm môi trường làm cho tần suất và tỷ lệ xuất hiện bệnh ngày càng gia tăng. Các thuốc điều trị Tây y hiện nay chủ yếu điều trị triệu chứng. Trong đó bao gồm các thuốc kháng histamine, nhưng cũng không cho kết quả như mong đợi. Liệu pháp corticoid tuy có tác dụng nhất định nhưng sau khi dừng thuốc thường có hiện tượng tái phát nặng hơn và thường phát sinh nhiều tác dụng phụ. Sử dụng cao thuốc y học cổ truyền với tác dụng chống viêm, chỉ dương, chống dị ứng trong điều trị chứng bệnh này cho hiệu quả tốt và an toàn [26]. Bài thuốc EZ do PGS.TS. Phùng Hòa Bình xây dựng là một trong số những giải pháp điều trị Eczema bằng thảo dược có hiệu quả trên lâm sàng. Tuy nhiên việc sử dụng thuốc thang thường bất tiện, hạn chế việc phát huy hiệu quả và tính phổ cập của bài thuốc, khó có thể đáp ứng đủ nhu cầu người bệnh. Do vậy vấn đề nghiên cứu chuyển dạng bài thuốc đã được chúng tôi đặt ra. Cao đặc là một dạng chế phẩm trung gian thường được dùng trong nghiên cứu chuyển dạng bào chế hiện đại. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành bào chế cao đặc EZ và bước đầu thăm dò một số tác dụng dược lý. Cao đặc EZ đã được nghiên cứu và khảo sát các tác dụng kháng khuẩn, chống viêm cấp tính và mạn tính cho thấy có tác dụng tốt trên mô hình thực nghiệm [27]. Ngoài sử dụng liệu pháp chống viêm trong điều trị Eczema còn chú trọng đến sử dụng các thuốc có tác dụng chống dị ứng [51], [52]. Bài thuốc EZ cũng được thiết kế với cấu trúc như vậy. Để tiếp tục chứng minh 2 khả năng sử dụng bài thuốc trong điều trị Eczema, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tiếp tục nghiên cứu bài thuốc EZ và thăm dò tác dụng chống dị ứng” với mục tiêu sau: 1. Định tính, định lượng rutin trong cao đặc bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao. 2. Thăm dò tác dụng chống dị ứng của cao đặc bài thuốc EZ. [...]... xác định flavonoid có 6 chất trong đó một chất thuộc nhóm flavonol [16], [28] - Tác dụng dược lý: Tác dụng chống viêm, chống dị ứng: Đơn lá đỏ có tác dụng chống viêm, chống dị ứng tốt (Nguyễn Danh Mâu, 1980) Dịch chiết đơn lá đỏ có tác dụng giảm phù từ giờ thứ 4, 5 Dịch chiết flavonoid toàn phần giảm 85,8%, lô uống dịch sắc giảm 90,3% phản ứng dị ứng [1] Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm: Đơn lá đỏ có tác. .. [29] - Tác dụng dược lý: Tác dụng chống choáng phản vệ: vỏ núc nác làm giảm độ thấm của mạch máu và flavonoid chiết từ vỏ núc nác có tác dụng chống choáng phản vệ gây bằng lòng trắng trứng trên thỏ và chuột lang, không có tác dụng bảo vệ đối với choáng gây bằng histamine [16], [29] 19 Tác dụng chống dị ứng: có tác dụng rõ rệt chống dị ứng và làm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một số tác nhân... Cao chiết ethanol có độc tính thấp hơn cao sắc nước LD50 = 420,32 (455,68-349,60) g dược liệu/kg 16 Cao sắc nước và cao chiết ethanol đều có độc tính cấp nhất định trên chuột nhắt trắng nhưng đều có độ an toàn cao (chỉ số trị liệu cao sắc nước: 17,88 và cao sắc cồn: 29,25) [27] - Tác dụng chống viêm Tác dụng chống viêm cấp: cả cao sắc nước và cao sắc cồn đều có tác dụng chống viêm cấp, nhưng tác dụng. .. xanthinin và xanthium có tác dụng kháng khuẩn mạnh đối với các vi khuẩn Gram (-) và các nấm Cao chiết ethylic có tác dụng kháng khuẩn, cao nước không có tác dụng này [16], [28] Tác dụng chống viêm: Thành phần β-sitosterol-β-D-glucosid có tác dụng chống viêm và là thành phần của những chế phẩm điều hòa hoạt động nội tiết Dịch chiết n-butanol có tác dụng chống viêm trên mô hình viêm tai [16], [28], [36] Tác dụng. .. Genistein-4’-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid (GRG) có tác dụng trong điều trị bệnh viêm dị ứng do Compound gây ra thông qua hoạt hóa tế bào mast [16], [28], [54] Tác dụng chống shock phản vệ: Chất GRG có tác dụng cải thiện tình trạng shock phản vệ do Compound 48/80 gây ra và nhiều công trình nghiên cứu cũng đã chứng mình hòe hoa có tác dụng ngăn chặn phản ứng phản vệ [28], [54] Tác dụng chống viêm: rutin và quercetin có tác dụng ức chế phù... viêm không đặc hiệu [3], [62] 1.1.1.5 Điều trị Eczema là phức hợp giữa phản ứng dị ứng và phản ứng viêm trong đó cơ chế dị ứng là cơ chế chủ yếu trong phát sinh và phát triển bệnh Do đó nguyên tắc cơ bản trong điều trị Eczema là chống dị ứng, giảm viêm và tránh bùng phát:  Điều trị đặc hiệu Nhằm loại trừ tác động của dị nguyên: Tránh tiếp xúc với dị nguyên nếu phát hiện được Liệu pháp miễn dịch với... viêm cấp, nhưng tác dụng chống viêm cấp của cao sắc cồn tốt hơn cao sắc nước và có phụ thuộc vào liều Tuy nhiên, tác dụng chống viêm cấp của cao sắc nước không nhận thấy sự phụ thuộc liều [27] Tác dụng chống viêm mạn: cả cao chiết ethanol (liều14,37g dược liệu/ kg TT) và cao sắc nước đều có tác dụng chống viêm mạn tính trên mô hình gây viêm mạn u hạt ở chuột nhắt trắng Tác dụng này tương đương với... quercetin có tác dụng hạ cholesterol máu trên chuột cống trắng được gây tăng cholesterol máu, đồng thời có tác dụng điều trị và phòng ngừa bệnh xơ vữa động mạch thực nghiệm [16], [28] Tác dụng khác: tác dụng bảo vệ cơ thể chống chiếu xạ; tác dụng cầm máu; tác dụng chống kết tập tiểu cầu; trên tim ếch cô lập quercetin thể hiện tác dụng cường tim; ngoài ra nụ hòe còn có tác dụng làm giảm lượng tiêu hao... [29] Tác dụng chống dị ứng: Dịch chiết ethanol của kim ngân có tác dụng đối với bệnh hen suyễn dị ứng trên mô hình thực nghiệm gây ra bởi lòng trắng trứng Dịch chiết có thể rất hiệu quả đối với các bệnh hen suyễn và viêm liên quan [37] Dịch chiết nước của kim ngân có tác dụng ức chế hoạt hóa tế bào mast do trypsin (ức chế ERK_Extracellular signal-regulated kinase và ức chế hoạt động của trypsin) [42] Tác. .. iridoid, coumarin [24]  Tác dụng sinh học - Tác dụng kháng khuẩn Cao sắc nước và cao chiết ethanol 70% có tác dụng trên chủng vi khuẩn Gram (+) là Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus cereus và các chủng vi khuẩn Gram (-) là Escherichia coli, Proteus mirabilis (cao nước ức chế mạnh chủng này) Ở nồng độ 100mg/ml cao sắc nước cho tác dụng kháng khuẩn cao nhất, tác dụng kháng khuẩn giảm nhẹ . thuốc EZ và thăm dò tác dụng chống dị ứng với mục tiêu sau: 1. Định tính, định lượng rutin trong cao đặc bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao. 2. Thăm dò tác dụng chống dị ứng. Xác định hàm ẩm cao đặc 38 3.3.2. Định lượng rutin bằng HPLC 39 3.3. NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG DỊ ỨNG CỦA CAO ĐẶC EZ 43 3.3.1. Chuẩn bị chế phẩm 43 3.3.2. Khảo sát tác dụng chống dị ứng. EZ 28 2.2.2. Đính tính rutin trong cao đặc bằng phương pháp TLC 29 2.2.3. Định lượng rutin trong cao đặc bằng HPLC 29 2.2.4. Khảo sát tác dụng chống dị ứng của cao đặc EZ 30 2.2.5. Phương