- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng 25 ± 2 g.
- Tiến hành: 60 chuột nhắt trắng được chia làm 6 lô, mỗi lô 10 con: Nghiên cứu được tiến hành trong 5 ngày như sau:
Lô 1 (Chứng sinh học): Uống nước lọc hàng ngày 0,2 ml/10g chuột, tiêm dưới da nước muối sinh lý 0,1 ml/10g chuột tương ứng vị trí tiêm Compound 48/80 ở những lô khác.
Lô 2 (Lô mô hình): Uống nước lọc hàng ngày 0,2 ml/10g chuột, tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4 mg/kg với thể tích 0,1 ml/10g chuột để gây mô hình gây ngứa.
Lô 3 (Methylprednisolon): 4 ngày đầu chuột được uống methylprednisolon 6 mg/kg. Ngày thứ 5, sau khi uống methylprednisolon 1 giờ, chuột được gây mô hình bằng Compound 48/80 4 mg/kg tiêm dưới da cổ.
Lô 4 (Ketotifen): 4 ngày đầu chuột được uống ketotifen 1 mg/kg. Ngày thứ 5, sau khi uống ketotifen 1 giờ, chuột được gây mô hình bằng Compound 48/80 4 mg/kg tiêm dưới da cổ.
Lô 5 (Thử EZ-H1): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết nước với liều 3,54 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4 mg/kg.
Lô 6 (Thử EZ-H2): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết nước với liều 10,62 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống
thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4 mg/kg.
Lô 7 (Thử EZ-E1): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết cồn với liều 2,11 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4 mg/kg.
Lô 8 (Thử EZ-E2): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết cồn với liều 6,33 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4 mg/kg.
Quy trình: chuột được cho uống thuốc trong 4 ngày liên tục. Đến ngày thứ 5, sau khi uống thuốc 1 giờ gây mô hình bằng cách tiêm dưới da cổ Compound 48/80 liều 4mg/kg với thể tích 0,1ml/10g chuột.
Tác nhân gây ngứa là dung dịch Compound 48/80 0,4% pha trong nước muối sinh lý 0,9%.
Theo dõi phản ứng gãi của từng chuột ở các lô tại các thời điểm 0-5 phút, 5-10 phút, 10-15 phút, 15-20 phút sau khi tiêm Compound 48/80, ghi vào sổ ghi chép.
Bảng 3.7. Tác dụng của cao EZ lên mô hình gây ngứa
STT Lô Thuốc thử Liều
Số phản xạ gãi trung bình (X± SD, số lần) 0-5 phút 5-10 phút 10-15 phút 15-20 phút Tổng số 1 Chứng sinh học NaCl 0,9% 0,1ml/10g 0 0 0 0 0 2 Mô hình C 48/80 4mg/kg 4,4 ± 2,6 9,6 ± 5,2 9,1 ± 4,9 9,7 ± 4,5 32,8 ±10,9 3 Chứng dương 1 Methyl 6mg/kg 3,1 ± 2,1 7,7 ± 5,0 6,1 ± 2,9 4.3 ± 3,4 21,2 ± 9,3 P3-2 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 4 Chứng dương 2 Ketotifen 1mg/kg 4,2 ± 3,5 7,4 ± 3,4 6,5 ± 1,8 5,8 ± 2,2 23,9 ± 4,8 P4-2 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 5 Thử EZ-H1 CN EZ 3,54g/kg 3,4 ± 2,6 4,8 ± 2,3 5,1 ± 3,7 3,8 ± 3,4 17,1 ±9,0 P5-2 > 0,05 < 0,05 > 0,05 < 0,01 < 0,01 P5-3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 P5-4 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 6 Thử EZ-H2 CN EZ 10,62g/kg 4,0 ± 4,0 2,8 ± 2,3 5,2 ± 4,3 3,7 ± 3,1 15,7 ± 9,6 P6-2 > 0,05 < 0,05 >0,05 < 0,001 < 0,01 P6-3 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 P6-4 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 6 5 P >0,05 7 Thử EZ-E1 CC EZ 2,11g/kg 4,8 ± 2,5 6,4 ± 2,7 4,8 ± 3,8 3,6 ± 2,6 19,1 ± 9,1 P7-2 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,01 < 0,01 P7-3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 P7-4 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 8 Thử EZ-E2 CC EZ 6,33g/kg 3,4 ± 2,7 4,3 ± 3,1 4,1 ± 3,8 4,3 ± 1,9 16,1 ± 8,6 P8-2 > 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,01 < 0,01 P8-3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 P8-4 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 P8-7 >0,05
0 5 10 15 20 25 30 35 S Ố L Ầ N G Ã I mô hình methylprednisolon ketotifen CC liều thấp CN liều cao CC liều thấp CC liều cao
Hình 3.8: biểu đồ thể hiện tác dụng ức chế ngứa trong 20 phút. Nhận xét:
Ở lô chứng sinh học không sử dụng chất gây dị ứng Compound 48/80: Không có chuột nào có phản xạ gãi điển hình trong 20 phút.
Ở lô mô hình: Compound 48/80 liều 4 mg/kg tiêm dưới da cổ chuột cho thấy tác dụng gây dị ứng điển hình thông qua chỉ số phản xạ gãi trong từng thời điểm và tổng số sau 20 phút.
Lô 3,4: Thuốc chứng dương methylprednisolon liều 6 mg/kg và ketotifen 1 mg/kg cho thấy tác dụng chống dị ứng: số phản xạ gãi trung bình trong 20 phút giảm rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình.
Ở lô 5: uống cao EZ chiết nước liều 3,54 g/kg. Số lần gãi trung bình trong cả 20 phút giảm rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô 2 mô hình. Tác dụng giảm ngứa chủ yếu tại 2 thời điểm: 5-10 phút và 15-20 phút. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tổng số lần gãi trong 20 phút ở lô uống cao EZ chiết nước liều 3,54 g/kg so với lô uống methylprednisolon 6 mg/kg và lô uống ketotifen 1 mg/kg.
Ở lô 6: uống cao EZ chiết nước liều 10,62 g/kg. Số lần gãi trung bình trong cả 20 phút giảm rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô 2 mô hình. Tác dụng giảm ngứa chủ yếu cũng tại 2 thời điểm: 5-10 phút và 15-20 phút. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tổng số lần gãi trong 20 phút ở lô uống EZ chiết nước liều 10,62 g/kg so với lô uống methylprednisolon 6 mg/kg. Tác dụng của EZ chiết nước liều 10,62 g/kg khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô uống ketotifen 1 mg/kg. Chưa có sự khác biệt giữa cao EZ chiết nước hai liều 3,54 g/kg và 10,62 g/kg.
Ở lô 7: uống cao EZ chiết cồn liều 2,11 g/kg. Số lần gãi trung bình trong cả 20 phút giảm rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô 2 mô hình. Tác dụng giảm ngứa chủ yếu tại 2 thời điểm: 10-15 phút và 15-20 phút. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tổng số lần gãi trong 20 phút ở lô uống cao EZ chiết cồn liều 2,11 g/kg so với lô uống methylprednisolon 6 mg/kg và lô uống ketotifen 1 mg/kg.
Ở lô 8: uống cao EZ chiết cồn liều 6,33 g/kg. Số lần gãi trung bình trong cả 20 phút giảm rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô 2 mô hình. Tác dụng giảm ngứa chủ yếu tại 3 thời điểm: 5-10 phút, 10-15 phút và 15-20 phút. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tổng số lần gãi trong 20 phút ở lô uống cao EZ chiết nước liều 6,33 g/kg so với lô uống methylprednisolon 6 mg/kg. Tác dụng của EZ chiết cồn liều 6,33 g/kg khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô uống ketotifen 1 mg/kg. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tổng số lần gãi trong 20 phút giữa 2 lô uống cao EZ chiết cồn liều 2,11 g/kg và 6,33 g/kg.
3.3.4. Nghiên cứu tác dụng chống dị ứng bằng mô hình gây viêm cấp tính trên chân chuột nhắt trắng
- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng 25 ± 2 g.
Tiến hành:
80 chuột nhắt trắng được chia làm 8 lô, mỗi lô 10 con: Mô hình được gây bằng cách tiêm Compound 48/80 dưới da vùng gan bàn chân chuột ở tất cả các chuột, sử dụng chân bên phải (P). Nghiên cứu được tiến hành trong 5 ngày như sau:
Lô 1 (Chứng sinh học): Uống nước lọc hàng ngày 0,2 ml/10g chuột, tiêm
nước muối sinh lý thể tích 0,02 ml gan bàn chân phải chuột.
Lô 2 (Lô mô hình): Uống nước lọc hàng ngày 0,2 ml/10g chuột, tiêm dưới da gan bàn chân chuột dung dịch Compound 48/80 0,4% thể tích 0,02 mL để gây mô hình phù gan bàn chân bên phải.
Lô 3 (Methylprednisolon): 4 ngày đầu chuột được uống methylprednisolon 6 mg/kg. Ngày thứ 5, sau khi uống methylprednisolon 1 giờ, chuột được gây mô hình bằng dung dịch Compound 48/80 0,4% 0,02 ml tiêm dưới da gan bàn chân bên phải.
Lô 4 (Ketotifen): 4 ngày đầu chuột được uống ketotifen 1 mg/kg. Ngày thứ 5, sau khi uống ketotifen 1 giờ, chuột được gây mô hình bằng dung dịch Compound 48/80 0,4% 0,02 ml tiêm dưới da gan bàn chân bên phải.
Lô 5 (Thử EZ-H1): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết nước với liều 3,54 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được gây mô hình bằng dung dịch Compound 48/80 0,4% 0,02 ml tiêm dưới da gan bàn chân bên phải.
Lô 6 (Thử EZ-H2): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết nước với liều 10,62 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được gây mô hình bằng dung dịch Compound 48/80 0,4% 0,02 ml tiêm dưới da gan bàn chân bên phải.
Lô 7 (Thử EZ-E1): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết cồn với liều 2,11 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống
thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được gây mô hình bằng dung dịch Compound 48/80 0,4% 0,02 ml tiêm dưới da gan bàn chân bên phải.
Lô 8 (Thử EZ-E2): 4 ngày đầu chuột được uống thuốc nghiên cứu EZ chiết cồn với liều 6,33 g cao/kg/ngày. Vào ngày thứ 5, 1 giờ sau khi uống thuốc nghiên cứu liều lượng như trên, chuột được gây mô hình bằng dung dịch Compound 48/80 0,4% 0,02 ml tiêm dưới da gan bàn chân bên phải.
Quy trình: chuột được cho uống thuốc trong 4 ngày liên tục. Đến ngày thứ 5, sau khi cho uống thuốc 1 giờ, đo độ dày và thể tích bàn chân chuột. Sau đó tiêm dưới da gan bàn chân bên phải Compound 48/80 liều 0,8mg/kg với thể tích 0,02ml/10g chuột. Đo độ dày và thể tích bàn chân chuột ở thời điểm 30 phút và 1 giờ sau khi tiêm Compound 48/80 và ghi vào sổ ghi chép.
Tác nhân gây viêm cấp tính là dung dịch Compound 48/80 0,4% pha trong nước muối sinh lý 0,9%.
Bảng 3.8: Kết quả của cao EZ trên mô hình gây viêm cấp tính
Lô Thuốc thử Liều Chiều dày chân chuột (X± SD, mm)
Gia tăng thể tích chân chuột (X± SD,%) 0 phút 30 phút 60 phút 30 phút 60 phút Chứng sinh học NaCl 0,9% 0,02ml 1,57 ±0,05 2,09 ± 0,16 1,73 ± 0,16 10,21 ± 8,32 5,14 ± 5,10 Mô hình C 48/80 0,4% 0,02ml 1,55 ±0,08 3,67 ± 0,31 3,32 ± 0,25 67,89 ± 23,18 52,48 ± 26,05 P2-1 > 0,05 < 0,001 < 0,001 < 0,001 < 0,001 Chứng dương 1 Methyl 6mg/kg 1,50 ±0,07 3,85 ± 0,25 3,35 ± 0,24 46,08 ± 10,74 42,80 ± 14,34 Mức độ ức chế -10,85 -4,52 32,13 19,82 P3-2 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 Chứng dương 2 Ketotifen 1mg/kg 1,54 ±0,09 3,53 ± 0,50 3,54 ± 0,32 47,35 ± 24,67 37,03 ± 24,49 Mức độ ức chế 6,13 -12,99 30,25 29,44 P4-2 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Thử EZ-H1 CN EZ 3,54g/kg 1,51 ±0,05 3,78 ± 0,26 3,48 ± 0,38 43,75 ± 12,73 42,55 ± 20,32 Mức độ ức chế -7,06 -11,3 35,56 18,92 P5-2 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,01 > 0,05 P5-3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 P5-4 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Thử EZ-H2 CN EZ 10,62g/kg 1,51 ±0,07 3,79 ± 0,35 3,56 ± 0,09 41,22 ± 12,29 37,72 ± 10,93 Mức độ ức chế -7,55 -15,82 39,28 28,13 P6-2 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,01 > 0,05 P6-3 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 P6-4 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 P 6 5 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 Thử EZ-E1 CC EZ 2,11g/kg 1,52 ±0,07 3,65 ± 0,33 3,45 ± 0,32 41,42 ± 20,80 24,12 ± 19,52 Mức độ ức chế -0,47 -9,04 38,99 54,04 P7-2 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 P7-3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 P7-4 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Thử EZ-E2 CC EZ 6,33g/kg 1,50 ±0,09 3,89 ± 0,31 3,68 ± 0,24 56,40 ± 24,52 40,32 ± 23,37 Mức độ ức chế -12,74 -23,16 16,92 23,17 P8-2 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 P8-3 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 P8-4 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 P8 7 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 M Ứ C Đ Ộ Ứ C C H Ế P H Ù ( % )
methyl ketotifen CN lieu thap CN lieu cao CC lieu thap CC lieu cao chế phẩm chiều dày 30p chiều dày 60p thể tích 30p thể tích 60p
Hình 3.9: biểu đồ thể hiện tác dụng ức chế phù chân chuột Nhận xét:
Chiều dày bàn chân chuột giữa các lô trước khi gây mô hình không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê đảm bảo sự tương đồng sinh học giữa các lô.
Ở lô 2: Compound 48/80 gây phù chân chuột rõ ràng so với lô chứng sinh học chỉ tiêm nước muối sinh lý trên cả hai chỉ tiêu: chiều dày và gia tăng thể tích chân chuột.
Lô 3:Methylprednisolon 6 mg/kg có tác dụng làm giảm độ gia tăng thể tích chân chuột có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình. Chứng tỏ tác dụng ức chế phù của methylprednisolon.
Lô 4: Ketotifen 1 mg/kg ức chế thay đổi chiều dày chân chuột ở 30 phút và độ gia tăng thể tích chân chuột nhưng không có ý nghĩa thống kê.
Ở lô 5: Cao EZ chiết nước liều 3,54 g/kg thể hiện tác dụng ức chế gia tăng thể tích chân chuột ở thời điểm 30 phút (p<0,05) nhưng làm tăng chiều dày chân chuột so với lô mô hình không có ý nghĩa thống kê.
Ở lô 6: Cao EZ chiết nước liều 10,62 g/kg cũng cho thấy tác dụng ức chế gia tăng thể tích chân chuột ở thời điểm 30 phút (p<0,05) nhưng làm tăng
chiều dày chân chuột so với lô mô hình đặc biệt tăng rõ ở thời điểm 60 phút (p<0,05).
Ở lô 7: Cao EZ chiết cồn liều 2,11 g/kg cho thấy tác dụng ức chế gia tăng thể tích chân chuột ở thời điểm 30 phút và 60 phút (p<0,05). Tác dụng ức chế gia tăng thể tích tốt hơn methylprednisolon ở thời điểm 60 phút (p<0,05), nhưng làm tăng chiều dày chân chuột so với lô mô hình không có ý nghĩa thống kê.
Ở lô 8: Cao EZ chiết cồn liều 6,33 g/kg cho thấy làm gia tăng chiều dày chân chuột đặc biệt tăng rõ rệt ở thời điểm 60 phút (p<0,05), ức chế gia tăng thể tích chân chuột nhưng không có ý nghĩa thống kê.
3.4. BÀN LUẬN
3.4.1. Định tính rutin bằng sắc ký lớp mỏng
Rutin tan trong methanol, hơi tan trong ethanol và thực tế trong tan trong nước [8]. Do đó trong quá trình định tính rutin trong cao đặc đã sử dụng methanol làm dung môi để chiết rutin trong cao đặc EZ. Mặt khác methanol bảo quản hoạt chất trong dịch chiết tốt hơn ethanol (ethanol bay hơi nhanh trong quá trình bảo quản làm giảm độ cồn).
